1
Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Salmonella là một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh ngộ độc thực
phẩm cho người trên diện rộng và luôn là mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng. Vi sinh
vật này phân bố rộng rãi trong đất, nước, gia súc, thực phẩm… trong đó thịt và các sản
phẩm gia cầm là các nguồn bệnh quan trọng. Các báo cáo của Ủy Ban Châu Âu năm
1995 xác định rằng các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt là Salmonella và
Campylobacter là vấn đề quan trọng cho sức khỏe cộng đồng. Vì tính chất rất nguy
hiểm của Salmonella, tất cả các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của các nước
trên thế giới đều xếp Salmonella vào nhóm không được phép có mặt.
Hiện nay, khoảng 2500 kiểu huyết thanh về Salmonella đã được xác định. Qua
các nghiên cứu cho thấy không phải tất cả các chủng mà chỉ có một số ít có khả năng
gây bệnh. Nếu có phương pháp phân biệt được các dòng Salmonella gây bệnh với các
dòng lành tính thì sẽ tạo thuận lợi hơn trong việc mua bán và trao đổi hàng hóa thực
phẩm giữa các nước. Đồng thời việc phân biệt các dòng trên còn giúp ích nhiều trong
việc điều tra và kiểm soát dịch bệnh do vi khuẩn này gây ra.
Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học
Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của Th.S Nguyễn Tiến Dũng, TS.
Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY
BỆNH CHO CHUỘT Ở CÁC CHỦNG SALMONELLA CÓ NGUỒN GỐC TỪ BỆNH
PHẨM, THỰC PHẨM”.
1.2. Mục đích
Nghiên cứu khả năng gây bệnh của các chủng Salmonella có nguồn gốc bệnh
phẩm và thực phẩm.
1.3. Nội dung
Khảo sát khả năng gây bệnh, gây chết ở chuột do các chủng Salmonella.
Khảo sát khả năng xâm nhiễm của các chủng Salmonella vào gan và lách chuột.
Nghiên cứu khả năng xâm nhiễm của các chủng Salmonella vào các cơ quan
thuộc hệ tiêu hóa chuột gồm: dạ dày, gan, lách, ruột non và ruột già.
lắng cặn.
3
Trên môi trường thạch thường vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng S (Smooth) tròn,
lồi, trơn láng, bờ đều, thường không màu hay màu trắng xám. Đôi khi tạo khuẩn lạc
dạng R (Rough), kích thước khuẩn lạc thường trong khoảng 2 – 4 mm.
Trên môi trường thạch Macconkey vi khuẩn Salmonella mọc thành những
khuẩn lạc tròn, đường kính 2 – 3 mm, trong suốt, không màu, sáng, nhẵn bóng và hơi
lồi ở giữa.
Trên môi trường thạch SS (Shigella – Salmonella Agar) Salmonella hình thành
những khuẩn lạc tròn, bóng không màu hay có màu hồng và có tâm đen ở giữa.
Trên môi trường thạch XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar) Salmonella
cho khuẩn lạc trong suốt, không màu hay có màu hơi nhuốm đỏ đôi khi có tâm đen,
thường xuất hiện vùng đỏ hồng xung quanh khi khuẩn lạc Salmonella phát triển mạnh.
Trên môi trường thạch BPLS (Brilliant Green Phenol Red Lactose Agar)
Salmonella cho khuẩn lạc tròn, màu trắng hồng, môi trường xung quanh đỏ hồng.
Trên môi trường thạch BSA (Bismuth Sulphite Agar) Salmonella cho khuẩn lạc
có màu nâu xám hay màu đen, thường có ánh kim bao quanh [3, 6, 12, 25, 34].
2.1.1.3. Sức đề kháng
Salmonella bị tiêu diệt ở nhiệt độ 50
o
C trong 1 giờ, 70
o
C trong 15 phút, 100
o
C
trong 5 phút. Chúng có thể sống sót trong môi trường thạch ở nhiệt độ -10
o
C trong 115
ngày, sống từ 4 - 8 tháng trong thịt ướp muối với tỷ lệ 29% ở nhiệt độ 6 – 12
Voges Proskauer -
Chú thích: (-) âm tính, (+)dương tính
2.1.1.5. Đặc điểm biến dị di truyền
Trong khi nuôi cấy Salmonella, đặc biệt là nuôi cấy lâu ngày trong môi trường
tổng hợp thì Salmonella có thể biến dị về khuẩn lạc và kháng nguyên. Các biến dị
thường gặp là: [11, 17]
Biến dị S - R: Vi khuẩn mới phân lập có khuẩn lạc dạng S trơn, bóng láng, bờ
đều, có kháng nguyên O đặc hiệu. Qua một thời gian nuôi cấy, vi khuẩn phát sinh biến
dị, khuẩn lạc có thể trở nên nhám, xù xì, gồ ghề, người ta gọi đó là dạng R, khi biến
thành dạng này thì kháng nguyên O không còn đặc hiệu nữa.
Biến dị O - H: Trong khi nuôi cấy dưới ảnh hưởng của một số hóa chất trong
môi trường như acid fenic… vi khuẩn có thể bị biến dị vì mất lông, do đó chúng sẽ
không di động được khi chỉ còn kháng nguyên O.
Biến dị của kháng nguyên H: Vi khuẩn có lông có thể biến dị từ phase 1 sang
phase 2, có nghĩa là biến dị từ phase đặc hiệu sang phase không đặc hiệu.
2.1.2. Đặc điểm phân loại
Dựa vào sự lai giữa DNA - DNA, Bergey’s (1994) đã chia giống Salmonella
thành 2 loài cơ bản là Salmonella enterica (hay còn gọi là S. cholerasuis) và S.
bongori [10, 25, 33].
5
S. bongori là một loài hiếm, trong khi đó S. enterica thì phân bố rộng khắp mọi
nơi trên thế giới và phổ vật chủ của chúng rất rộng.
Loài S. enterica được chia thành 6 loài phụ sau:
S. enterica enterica hay còn gọi là S. enterica I
S. enterica salamae hay còn gọi là S. enterica II
S. enterica arizonae hay còn gọi là S. enterica IIIa
S. enterica diarizonae hay còn gọi là S. enterica IIIb
S. enterica houtenae hay còn gọi là S. enterica IV
S. enterica indica hay còn gọi là S. enterica VI
+
+
-
-
-
-
+
(+)
2
-
+
+
-
-
-
-
-
+
+
+
-
+
-
-
+
D
3
+
Kháng nguyên O (kháng nguyên màng tế bào, somatic): nằm trên màng của vi
khuẩn và được phóng thích vào môi trường nuôi cấy. Kháng nguyên này đặc trưng bởi
cấu trúc lypopolysaccharide - protein. Loại kháng nguyên này được coi là nội độc tố
của vi khuẩn, có tác dụng ngăn cản bạch huyết cầu đi qua mao mạch và làm thay đổi
tạm thời sự thẩm thấu của mao quản. Kháng nguyên này bền đối với nhiệt, chúng
không bị phân hủy ở nhiệt độ 100
o
C trong 2 giờ. Chúng bị phân hủy trong môi trường
acid tạo ra 2 thành phần cơ bản: [3, 28]
Phần 1 là lipide, có cấu trúc tương tự như ở tất cả các loài vi khuẩn thuộc đường
ruột khác, phần này qui định khả năng gây độc của vi khuẩn và được gọi là nội độc tố.
Phần 2 là phần có nguồn gốc từ polysaccharide, gồm các nhóm hydro nằm
ngoài, được dùng để phân biệt các kiểu huyết thanh của Salmonella. Nhóm
polysaccharide ở bên trong có chức năng phân biệt các dạng khuẩn lạc.
Do có sự khác nhau giữa các loài Salmonella về phương diện cấu tạo kháng
nguyên O nên người ta đã chia Salmonella thành 34 nhóm có ký hiệu như sau: A, B,
C1, C2, C3, D1, D2, E1 … E4, F, G1, G2, X, Y, Z, 49, 50. Mỗi nhóm huyết thanh học
gồm một số loài vi khuẩn có kháng nguyên O cấu tạo bởi một số thành phần nhất định.
Ví dụ trong nhóm A, S. paratyphi A, kháng nguyên O gồm 3 thành phần (I), II, XII
trong đó thành phần I có thể có hoặc không, thành phần II là thành phần đặc biệt
không thể thiếu dùng để phân biệt về mặt huyết thanh học với các nhóm khác.
Kháng nguyên H (kháng nguyên lông, flagella): có bản chất là protein rất kém
bền vững so với kháng nguyên O, bị phá hủy ở 70
o
C hay dưới tác dụng của cồn, các
enzyme phá hủy protein, nhưng không bị ảnh hưởng bởi formol 0,5%. Kháng nguyên
Pili
7
H không có tác dụng gây bệnh, không tạo miễn dịch. Salmonella chứa 2 nhóm kháng
nguyên H, chúng được mã hóa bởi 2 gen khác nhau nhưng có liên quan mật thiết với
8
Bảng 2.3. Cấu trúc kháng nguyên của một vài Salmonella thƣờng gặp [Jay, 2000]
Nhóm
Loài/kiểu huyết
thanh
Kháng nguyên
O
Kháng nguyên H
Phase 1 Phase 2
A
B
C1
C2
D E1
S. paratyphi A
S. schottmuelleri
S. typhimurium
S. hirschfeldii
S. choleraesuis
S. oranienburg
S. montevideo
S. newport
1, 2
1, 5
1, 5
-
(1, 2, 7)
1, 2
-
(1, 7)
-
1, 6
Ghi chú: - sự có mặt của yếu tố đó là do sự đảo ngược phage, ( ) có thể vắng mặt.
2.1.4. Phân loại theo mục đích miễn dịch học
Về dịch tễ học, Salmonella được chia thành 3 nhóm: [29, 32]
Nhóm chỉ nhiễm trên người: Gồm các kiểu huyết thanh S. typhi, S. paratyphi A,
S. paratyphi C. Chúng là tác nhân gây sốt thương hàn và phó thương hàn. Sốt thương
hàn có thời gian ủ bệnh dài, thân nhiệt tăng cao và thường tỷ lệ tử vong cao. S. typhi
được phân lập từ máu, thỉnh thoảng từ phân và nước tiểu bệnh nhân có vấn đề về
đường ruột. Triệu chứng của bệnh phó thương hàn thì nhẹ hơn thương hàn.
Nhóm gây bệnh trên thú: Gồm các kiểu huyết thanh S. gallinarum (gia cầm), S.
dublin (bò), S. abortus-equi (ngựa), S. abortus-ovis (cừu), S. choleraesuis (heo).
Nhóm không kí chủ đặc hiệu: gây bệnh trên người và thú, thường tìm thấy
trong thức ăn.
Để có biểu hiện bệnh thì mật độ vi khuẩn đưa vào cơ thể phải đạt khoảng 10
7
-
10
9
CFU/g.
9
tăng c-GMP (Guanyl-cyclase monophotphate) trong tế bào dẫn đến nước tập trung vào
ruột non sau 18 - 24 giờ và dẫn đến tiêu chảy.
2.1.6. Dịch tễ học
2.1.6.1. Tác nhân truyền bệnh
Salmonella hiện diện khắp nơi trong tự nhiên. Thực phẩm Salmonella thường
hiện điện trong các sản phẩm có nguồn gốc từ thịt gia súc, gia cầm. Ngoài ra,
Salmonella còn hiện diện trong trứng, sữa, sản phẩm thủy sản như trai ốc sống trong
nước bẩn… Thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật ít khi là nguồn gây ngộ độc
Salmonella trừ những rau quả ăn sống như rau diếp, cà chua… nếu bón phân tươi hoặc
rửa bằng nước bẩn thì sẽ rất nguy hiểm. Kem, nước đá làm bằng nước bẩn cũng có thể
10
truyền bệnh. Phân người bệnh hoặc người lành mang vi khuẩn mãn tính có thể làm bẩn
nguồn nước, thức ăn… [ 8, 12, 13, 18, 25, 31].
2.1.6.2. Động vật cảm thụ
Salmonella có thể phân lập được trên các loại gia súc như heo, bò…, gia cầm
như gà, chim, vịt…, thú thí nghiệm như chuột bạch, thỏ, chuột lang.
Bệnh từ heo có thể lây sang bò, chó, người. Heo là ổ chứa tự nhiên quan trọng,
do đó ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. Bệnh thường xảy ra trên con cái hơn là con
đực [7, 10].
2.1.6.3. Nơi chứa mầm bệnh
Máu, phủ tạng đặc biệt là gan, lách, các chất tiết, phân đều chứa vi khuẩn trong
thể bại huyết cấp tính. Một số trường hợp thú khỏe mang mầm bệnh, tỷ lệ này biến đổi
tùy theo điều kiện, phương thức chăn nuôi. Trong trường hợp này, Salmonella sống
hoại sinh ở ruột, hạch ruột, túi mật, phân, hạch hầu …
Bằng thực nghiệm các nhà khoa học đã chứng minh rằng S. typhimurium hiện
diện với tỷ lệ 93,5% ở hạch amygdale, 71% ở manh tràng, 55% hạch bạch huyết hàm
dưới và 45% hạch bạch huyết van hồi tràng ở những heo giết mổ vào tuần thứ 20 - 28
sau khi nhiễm. Một số tìm thấy trong dịch tiết đường sinh dục, dịch hoàn [3, 10, 14].
2.1.6.4. Đƣờng xâm nhập
Salmonella xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua đường tiêu hóa thông qua thức ăn,
Bảng 2.4. Những rào cản của cơ thể ký chủ chống lại sự xâm nhiễm của
Salmonella [29]
Cơ quan phòng vệ Nhân tố phòng vệ
Dạ dày
Tính acid trong dạ dày
Tốc độ tiêu hóa thức ăn trong dạ dày
Ruột non
Sự chuyển động của nhu động ruột
Hệ vi sinh vật đường ruột
Dịch nhầy
Các nhân tố di truyền kháng sự xâm nhiễm của
vi sinh vật
Các nhân tố khác
Tình trạng dinh dưỡng
Sự tiết kháng thể
Lactoferin
Lysozyme
Khi những rào cản trong ký chủ này bị giảm hay mất tác dụng, ký chủ trở nên
dễ bị Salmonella tấn công. Những yếu tố tạo cho ký chủ có tính nhạy cao đối với
Salmonella thì được thể hiện ở Bảng 2.5.
12
Thí dụ, người bị AIDS thì khả năng miễn dịch của cơ thể bị giảm dẫn đến cơ
thể rất dễ bị nhiễm Salmonella. Khi cơ thể sử dụng kháng thể thường xuyên thì khả
năng Salmonella kháng lại các loại kháng sinh cũng rất lớn.
Bảng 2.5. Những yếu tố làm tăng tính nhạy của ký chủ với Salmonella [28, 30]
Cơ quan hoặc yếu tố Nhân tố
Dạ dày
Kém phát triển
Hình 2.3. Các vị trí Salmonella có thể biểu hiện bệnh [28]
Những nghiên cứu ở mức hiển vi cho thấy các chủng Salmonella xâm chiếm
vào các tế bào biểu mô thông qua quá trình nhập bào. Sau khi vi khuẩn gắn vào đỉnh
các lông tiếp xúc trên bề mặt tế bào biểu mô thì có sắp xếp lại bộ khung tế bào trong
cơ thể ký chủ, làm phá vỡ các lông tiếp xúc này và cảm ứng việc tạo nên các lằn gợn
trên màng bao quanh vi khuẩn trong một nang lớn. Các nang mang Salmonella được
đưa vào cơ thể thông qua quá trình nhập bào. Bằng kỹ thuật công nghệ sinh học hiện
đại, người ta đã chứng minh những nhiễm sắc thể và plasmid tham gia kiểm soát quá
trình nhân lên và xâm nhiễm này. Sự xâm nhập của vi khuẩn thông qua quá trình nhập
bào đòi hỏi phải có sự tổng hợp nhiều loại protein tế bào như CdtA, CdtB, CdtC có
hoạt tính như enzyme, chúng phá hủy DNA làm cho những tế bào ký chủ ngừng hoạt
động [10, 21].
Ngoài việc Salmonella xâm nhiễm vào tế bào biểu mô gây ra tình trạng viêm
ruột còn cảm ứng tế bào biểu mô tiết các tín hiệu làm di chuyển các bạch cầu trung
tính vào bên trong lớp lumen [10].
(ở ruột non, ruột già)
Gây tiêu chảy.
Sơ đồ 2.1. Cơ chế gây bệnh của Salmonella gây ra phản ứng viêm ruột non và tiêu
chảy [17, 28]
Sau khi xâm chiếm vào các tế bào biểu mô ruột, vi khuẩn Salmonella nhân lên
trong tế bào và lan rộng xuống các hạch bạch huyết ở màng treo ruột, một số đi khắp
cơ thể theo hệ thống tuần hoàn. Salmonella được giữ lại bởi những tế bào lưới nội mô,
đây là nơi sẽ khuếch tán vi sinh vật. Tuy nhiên, tùy vào kiểu huyết thanh Salmonella
và sự phòng vệ của ký chủ, một vài Salmonella xâm nhiễm vào gan, lách, túi mật,
xương, màng não và những cơ quan khác. Một lượng lớn Salmonella bị tiêu diệt tại
những vị trí ở ngoài ruột [3, 28].
15 Hình 2.4. Sự xâm nhiễm của Salmonella vào tế bào biểu mô ruột [28]
Sau khi xâm chiếm vào ruột, Salmonella thường gây ra phản ứng viêm nặng,
phản ứng này có thể gây ra sự lở loét. Vi khuẩn Salmonella có thể tạo ra độc tố
cytotoxin nhằm ngăn chặn quá trình tổng hợp protein của cơ thể ký chủ. Độc tố
cytotoxin có góp phần trong việc tạo ra phản ứng viêm và lở loét thì không được biết
rõ. Tuy nhiên, sự xâm chiếm vào dịch nhầy là nguyên nhân làm cho những tế bào biểu
mô tổng hợp và phóng thích những cytokine khác nhau gồm: IL-1, IL-6, IL-8, TNF-2,
IFN-U, MCP-1 và GM-CSF. Các chất này đã gây ra phản ứng viêm và gây hại cho
ruột, những triệu chứng viêm thông thường như phát sốt, ớn lạnh, đau bụng, bệnh bạch
cầu và tiêu chảy [28].
Cơ chế về phản ứng viêm dạ dày- ruột và tiêu chảy xảy ra khi những chủng
Sự xâm nhập
Lớp lumen
Nhân lên
Lớp lamina propria
Tiêu
chảy
Gây tiết nước và chất điện phân
Bị thực bào bởi bạch
cầu trung tính và
những đại thực bào
Sự phát tán có
hệ thống
16
rất nhỏ. Salmonella vượt qua khỏi ranh giới của những tế bào biểu mô để vào lớp
lamina propria. Sự xâm chiếm vào niêm mạc ruột diễn ra bởi sự hoạt hóa adenylate
cyclase, kết quả là làm tăng lượng c-AMP gây ra hiện tượng bài tiết. Cơ chế thì không
được hiểu rõ nhưng có liên quan đến việc tạo ra prostaglandin hoặc những thành phần
gây ra phản ứng viêm. Thêm vào đó, những dòng Salmonella tạo ra một hoặc nhiều
hợp chất tương tự như enterotoxin gây bài tiết ở ruột [28].
Tóm lại, để Salmonella có thể xâm nhiễm vào bên trong và gây độc cho vật chủ
thì vi khuẩn phải mang những gen độc giúp cho nó thể hiện tính độc trong vật chủ. Các
gen gây bệnh thường có hàm lượng G+C khác biệt so với các vùng còn lại trên nhiễm
sắc thể vi khuẩn, các gen này thường xen giữa các gen có tính bảo tồn cao. Một vài
gen được biết là có liên quan đến sự bám dính và xâm chiếm như viz., sef1, pef2, spv3
và inv4. Những gen giúp Salmonella sống sót trong cơ thể ký chủ là mgtC5 hoặc gây
bệnh cho ký chủ là viz., sop, stn7, pipA, B, D8… [14, 25, 26, 28, 29].
2.2. TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG VÀ BIỆN PHÁP PHÕNG NGỪA
2.2.1. Triệu chứng lâm sàng
Bệnh do Salmonella thường gây ra 3 triệu chứng chính sau: [9, 16, 18, 26, 34]
Viêm dạ dày- ruột
huyết thanh khác. Thời kỳ ủ bệnh thường không có triệu chứng lâm sàng nhất định, từ
10 - 14 ngày đầu có thể thay đổi tùy thuộc vào số lượng vi khuẩn. Thời kỳ này tương
ứng với giai đoạn Salmonella vào cơ thể qua miệng cùng thức ăn và nước. Sau khi
vượt qua được môi trường acid trong dạ dày, một số vi khuẩn vào ruột non, chúng xâm
nhập vào các tế bào biểu mô của thành ruột rồi di chuyển tới lớp lamina propria để
sinh sản ở đó. Lúc này, vi khuẩn sẽ xâm nhiễm qua các hạch bạch huyết ở màng treo
ruột để vào máu và bị bắt giữ bởi các đại thực bào. Nhưng các tế bào Salmonella bên
trong đại thực bào không bị tiêu diệt, trái lại chúng vẫn phát triển và nhân lên bên
trong các tế bào này. Sau cùng, chúng phá vỡ các đại thực bào, lan truyền khắp cơ thể
và tập trung lại ở hệ lưới nội mô như tủy xương, gan, lách, mật và cả đường tiết niệu.
Kết quả là Salmonella có thể giải phóng ra ngoài cơ thể bằng đường phân, cả bằng
nước tiểu và sữa.
Bệnh thương hàn không có triệu chứng lâm sàng cố định. Thời kỳ khởi phát chỉ
có những triệu chứng lâm sàng thông thường như nhức đầu, đau bụng, sốt: sốt càng
cao khi tác nhân gây độc càng tích tụ nhiều trong máu. Thời kỳ toàn phát thì sốt là
triệu chứng quan trọng, kèm theo đó là các dấu hiệu nhiễm trùng độc, vẻ mặt vô cảm,
môi khô, má đỏ, tiêu chảy xen kẽ với táo bón và các tình trạng khác như vàng mắt,
vàng da… Khi các tế bào Salmonella bị tiêu diệt, chúng phóng thích nội độc tố gây
nhiễm độc máu. Tỷ lệ tử vong khi mắc bệnh vào khoảng 10% nhưng nếu sử dụng
kháng sinh thích hợp thì tỷ lệ này có thể giảm xuống còn 1%. Khi không bị tử vong,
bệnh nhân sẽ chuyển sang thời kỳ lui bệnh như hạ sốt nhanh và chuyển sang thời gian
hồi phục kéo dài. Vi khuẩn Salmonella lúc này vẫn còn tồn tại trong tủy xương, gan và
thận.
Copyright: Tài liệu đại học ©