TRNG I HC NÔNG NGHIP HÀ NI
KHOA CÔNG NGH THC PHM
******* Bài ging thc tp
MÔN VI SINH VT I CNG Ging viên: TS. Nguyn Th Thanh Thu

c làm sch bng máy hút bi, lau chùi bng mt s hoá cht kh trùng (dung
dch nc cloramin 0,5-3%)
Làm v sinh trc và c sau khi làm thí nghim
Trên bàn làm vic không đ các vt dng không cn thit. Phi có nhãn ghi trên tt
c các l hoá cht, các l dung dch đã pha ch và phi đt  ch xác đnh
Trong phòng thí nghim phi mc áo blouse khi làm vic, không đc phép n,
ung, hút thuc lá.

NGUYÊN TC LÀM VIC VI CÁC GING VI SINH VT
Trong điu kin phòng thí nghim, vi sinh vt đc nuôi cy trên các môi trng
dinh dng (đc hoc lng đng trong các ng nghim, đa Petri hoc các bình thu
tinh. Dng c thu tinh và môi trng dinh dng đu đã đc kh trùng trc.
Cy là công vic đa các t bào vi sinh vt vào các môi trng đã đc kh trùng.
Khi cy (hoc cy chuyn) phi tin hành theo nhng qui tc xác đnh, đm bo gi
cho các ging nghiên cu khi b nhim vi sinh vt  môi trng xung quanh
Thc tp VSV N.T.T.Thy
2
Trc khi cy: ghi lên ng nghim (đa Petri hoc bình thu tinh) tên ging, tên
môi trng, ngày nuôi cy. Có th vit bng bút vit kính hoc vit lên các nhãn
giy ri dán vào dng c
Trong khi cy
: Khi ly t bào vi sinh vt trong môi trng đc đ cy hoc làm tiêu
bn, ngi ta s dng các que cy đu tròn hoc đu nhn.  ly các t bào vi sinh
vt trong môi trng lng, ngi ta thng dùng các pipet đã kh trùng.
Cách tin hành
Kh trùng đu que cy trc khi ly t bào vi sinh vt. H nóng đ đu que cy và
làm nóng c phn cán. a que cy đã kh trùng vào các dng c cha vi sinh vt.
 tránh làm cht vi sinh vt, trc ht phi áp que cy vào mt trong ca các dng
c thu tinh hoc vào phn môi trng cha vi sinh vt cho ngui ri mi dùng đ
ly mt lng nh sinh khi vi sinh vt.

3
Chú ý
- Phi ghi chép t m các kt qu thu đc, các s liu phi ghi thành tng
bng, nu cn thit phi v biu đ, đ th
- Có quan sát, nhn xét, kt lun ca bn thân
- Không ghi chép vào các mnh giy ri

CÁCH S DNG MT S MÁY MÓC
Trong phòng thí nghim có mt s loi máy móc thng xuyên đc s dng, vì
vy cn phi nm vng cách vn hành và bo dng các máy móc đó
1.NI P ÁP LC (AUTOCLAVE)
Nguyên lý

Phng pháp s dng ni hp áp lc da trên nguyên tc làm gia nhit các vt bng
hi nc bão hoà di áp sut ln hn áp sut khí quyn. Khi áp sut tng, nhit đ
cng tng theo (bng)
Bng. Nhit đ hi nc bão hoà  các áp sut khác nhau
Áp sut (atm)
Bình thng Cao (áp sut b sung)
Nhit đ (
o
C)
1,0 - 100
1,0 0,5 112
1,0 1,0 121
1,0 1,5 128
1,0 2,0 134
Tác dng phi hp gia nhit đ cao và áp sut đm bo cho vic kh trùng thc
hin đc tt. Khi hp, áp lc s tiêu dit c t bào & sinh dng ln bào t ca vi
sinh vt

- Khi đã đ thi gian kh trùng, đi áp sut trong ni h dn ti vch s 0, m van
thông hi x ht khí. Vn c, m np, ly các đ dùng đã đc kh trùng ra.

2.T NH ÔN (THERMOSTAB)
ây là thit b quan trng trong nuôi cy vi sinh vt. Nhit đ trong t có th thay
đi t 0-60
o
C. Nhit đ khi đã đc xác đnh s đc duy trì n đnh trong sut thi
gian nuôi cy.
Cu to

Bao gm 2 lp:
- Lp trong là lp kim loi dn nhit và gi nhit đ bên trong ca t
- Lp ngoài là lp kim loi dy hn và bao bc bên trong mt lp cách nhit
Gia lp trong và lp ngoài thng là khong rng gi cho nhit đ ít bin đi
Trong t có mc b phn cm ng nhit đ báo nhit đ lên xung cho rle hot đng
Phía mt ngoài ca t có các núm điu chnh nhit đ
Các đim cn chú ý khi s dng

- Phi xem đin th ca máy vi ni đt máy có ging nhau không. Nu khác nhau
phi dùng bin th đin
- Khi dùng ln đu phi xem b phn điu chnh nhit có làm vic tt không, nhhit
đ trong t có n đnh không
- Ca t luôn đóng kín tr khi ly hoc cho nguyên liu vào nuôi cy
- Luôn dm bo sch s, khô ráo trong t. Cho máy chy thng xuyên nht là
nhng ngày tri m


C s gây cháy giy.
- Kh trùng xong, tt công tc đin nhng không đc m ca t trc khi nhit đ
h xung di 80
o
C, nu không s gây nt và làm nh hng đn tính vô trùng ca
các dng c.

CÁCH X LÝ DNG C THY TINH
i vi dng c thu tinh mi, dng c thu tinh trc và sau khi làm thí nghim,
cn chú ý hai nhim v chính là trung tính và ra các dng c này.
Phng pháp trung tính dng c thu tinh

Phng pháp này đc s dng nhm tránh s thay đi pH gây ra t các dng c
cha vào trong môi trng nuôi cy
Phng pháp th: ly nc trung tính (pH=7) cho vào trong dng c thu tinh, đem
hp  nhit đ cao khong 30’ -> 1 gi. Ly ra, đ ngui, th pH. Nu pH>7, ngâm
dng c này vào dung dch HCl 2% trong 10gi. Sau khi th li thy cha trung
tính thì tin hành ngâm tip. Nói chung dng c thu tinh đu kim
Ra các dng c thu tinh

Dng c mi
Dùng chi lông sát xà phòng ra sch trong, ngoài dng c, ra xong đ dc ngc
cho khô nc
Dng c sau khi dùng

ng nghim: Dùng xong qua kh trùng trong ni hp áp lc hay ngâm trong dung
dch lyzol 2% trong 24 h
Thc tp VSV N.T.T.Thy
6
 các vt phm trong ng nghim ra, dùng xà phòng ra sch trong, ngoài ng.

2
0,1% hay dung dch lyzol 5%. un trong nc xà phòng 5 phút. Ra sch, đ
khô. Có th gi phin kính trong cn, khi dùng ly ra lau khô, h lên la. Nh vy
tránh đc bi, phin kính s sch hn.

BAO GÓI DNG C THY TINH
Các dng c thu tinh chim mt phn ln trong các dng c phòng thc tp vi sinh
vt hc. Vic x lý và bao gói các dng c này có liên quan trc tip ti kt qu tin
hành. Dng c phi đc la chn đúng qui cách, đm bo cht lng, phi đc
x lý tt, không có vt bn và không cha tp cht. Bao gói phi đt tiêu chun khi
kh trùng và thun tin khi s dng.
Trc khi hp kh trùng dng c, vt liu, cn phi tin hành bao goí k càng và
đúng k thut đ thun tin cho công vic kh trùng, tránh hin tng nt v hay b
tp nhim sau khi hp
Cách làm nút bông

Làm bng bông không thm nc (bông m) loi si dài. Ct bông thành ming nh
hình vuông 7-8cm. Tu theo đng kính ming ng nh hay to mà ta có th thay
đi kích thc ca ming bông cho phù hp
Chú ý

- Nút bông cho ng nghim không dài quá 4 cm
- Không làm nút bông quá cht gây v ng nghim
- Không làm nút bông quá lng vì d b nhim tp
- Làm nút bông cho các bình ln phi bc thêm vi tha hoc gc  ngoài
Thc tp VSV N.T.T.Thy
7
Làm nút ng hút
Mc đích: ngn nga các cht t môi trng nuôi cy vào trong ming và tránh
nhim tp t ming vào môi trng

Dung dch axit HCl 0,2%; H
2
SO
4
20%, Fenol 5%; HNO
3
Dung dch cht oxy hoá: KmnO
4
0,2%; K
2
Cr
2
O
7
10%
Dung dch cht sát trùng: lyzol 2%; credin 2%
Thc tp VSV N.T.T.Thy
8

BÀI 2 - PHNG PHÁP S DNG KÍNH HIN VI, CÁCH LÀM TIÊU BN
VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VT
Vic nghiên cu, cu to các t bào vi sinh vt ht sc nh bé ch có th thc hin
đc nh s giúp đó ca các kính hin vi. Hin nay, ngi ta đã sáng ch ra nhiu
loi kính hin vi khác nhau nhm mc đích nghiên cu rõ và sâu hn v vi sinh vt.
Tuy nhiên  đây chúng ta ch nghiên cu s dng loi kính hin vi quang hc – loi
kính đc s dng  hu ht các lnh vc có liên quan đn vi sinh vt.
 quan sát vi sinh vt di kính hin vi quang hc, cn làm tiêu bn các t bào
sng (tiêu bn ti) và tiêu bn các t bào đã đc c đnh (cht)
Mc đích – yêu cu


Thc tp VSV N.T.T.Thy
9
đu,  đu có mt vòng đen đ phân bit vi vt kính khác) vt kính có bi s thp
thng đc dùng đ xem ti, còn vt kính du thng đ xem tiêu bn nhum
Th kính: cu to gm hai thu kính ghép li. Th kính không có nng lc to nh
nh vt kính mà ch yu chc nng ca nó là phóng đi nh do vt kính thu đc.
Thông thng th kính có đ phóng đi: 7X; 10X; 15X và 20X (hoc 12X, 16X…)
 phóng đi tiêu bn quan sát s là tích s ca đ phóng đi th kính vi đ phóng
đi ca vt kính đem s dng
Ví d: nu dùng vt kính du có đ phóng đi 90X và th kính có đ phóng đi 15X
đ quan sát tiêu bn thì tiêu bn đã đc phóng đi lên: 90x15 = 1350 ln
B phn tp trung ánh sáng

Gng phn chiu: t di khay kính gm hai mt lõm và li
T quang kính: đt di khay kính dùng đ tp trung ánh sáng t gng phn chiu
vào tiêu bn. T quang kính do mt hoc nhiu thu kính to nên s tp trung ánh
sáng. Di h thng thu kính là b phn chn sáng. T quang kính có th di đng
lên xung nh có c điu khin làm chuyn dch bn l gn t quang.
CÁCH S DNG
T th kính:

t kính trên bàn ngay ngn,  t th có li nht cho ngi quan sát. Khi quan sát
ngi ta thng dùng mt trái còn mt phi đ ghi chép
Ngun sáng

Có th s dng hai ngun sáng là ngun sáng t nhiên và ngun sáng nhân to (ánh
sáng đèn)
S dng ngun sáng t nhiên thng là ánh sáng tán x (ánh sáng gián tip). Tránh
dùng ánh sáng chiu trc tip vì có hi cho mt và ánh sáng không đc rõ.
S dng ngun sáng nhân to, thng ngi ta dùng ánh sáng ca đèn đin và ánh

đng kính thu kính nh vì vy khi không cho du thì ch có mt phn nh ánh
sáng lt vào thu kính, nh vào s không đc rõ, du bch dng có chit sut xp
x chit xut thu tinh cho nên ánh sáng đi qua tiêu bn đ vào vt kính là mt môi
trng gn nh đng nht nên di thng mà không b khúc x vì vy lng ánh sáng
vào nhiu, nh rõ. Xoay vt kính du cho sát xung tiêu bn cho đu vt kính ngp
trong du. Khi thy có chp nh thì vn c vi cp t t đ thy rõ nh tiêu bn.
CÁCH BO QUN KÍNH HIN VI
Ly kính hin vi trong hp ra nên dùng tay phi, nm chc tr kính kéo kính ra theo
hng nm ngang không đ đng vào thành hp; sau đó dùng tay trái đ chân kính
đ mang đi. Nu mang đi xa thì phi c đnh chc chn đ tránh b hng kính do b
lc mnh
Không đc s tay vào các đu ca vt kính và th kính. Nu phát hin thy vt
kính, th kính b bi bn thì phi dùng giy riêng đ lau kính hay khn la đ lau,
khi lau phi nh nhàng
Khi dùng xong, nu s dng vt kính du thì trc ht phi dùng giy mm hoc vi
la đ lau nh cho sch du, sau đó lau li bng xylen hoc benzen cho ht du 
đu vt kính. Xoay các b phn ca kính v đúng ch qui đnh
Không đc đ ánh sáng mt tri chiu trc tip vào kính. Không đc tháo lp các
b phn ca kính, không t ý cho du vào các b phn c gii ca kính
Phi đ ni khô ráo thoáng, không nóng, ít bi bn.

B. PHNG PHÁP LÀM VÀ NHUM CÁC TIÊU BN
PHNG PHÁP LÀM TIÊU BN TI KHÔNG NHUM
Tiêu bn “git ép”

Tiêu bn “git ép” đc dùng đ xác đnh hình thái, kích thc, xp và phng
thc sinh bào t ca các t bào vi sinh vt
Cách làm:
Dùng mt phiên kính (lame) khô, sch, ly mt git nc vô trùng đt lên gia
phiên kính. Sau đó dùng que cy vô trùng thêm vào đó mt ít t bào vi sinh vt hay

Mc đích: có th quan sát mt các rõ ràng hn hot đng sng ca t bào vi sinh vt
Cách làm: ging nh tiêu bn “git treo” hoc “git ép”, nhng cho thêm dung dch
thuc nhum xanh metylen …%

PHNG PHÁP C NH VÀ NHUM MÀU TIÊU BN.
C đnh và nhum màu tiêu bn dùng đ quan sát k các phn cu trúc ca t bào.
Nhng tiêu bn này có tác dng bo tn tiêu bn ca mt loi hình vi sinh vt nào
đó cho các nghiên cu v sau.
Vic chun b tiêu bn gm các bc: chun b vt bôi, làm khô, c đnh và nhum màu
(hình)
Chun b vt bôi:

t vt liu nghiên cu lên mt phin kính sch theo kiu làm git ép, dùng que cy
dàn đu vt liu trên din tích 1-2cm
2

Thc tp VSV N.T.T.Thy
12

Làm khô vt bôi:
Tiêu bn đc làm khô trong không khí, nu khô chm có th h phiên kính lên
phía trên cao ca ngn la đèn cn. Tránh làm quà nóng vt bôi vì nu nh vy vi
sinh vt s b bin dng.
C đnh:

Mc đích
- Gn các t bào vi sinh vt lên trên phin kính
- Tránh b ra trôi
- Làm cho vt bôi d bt thuc nhum do các t bào cht d nhum màu hn các t
bào sng, an toàn s dng vt bôi hn, nht là khi s dng các vi sinh vt gây bnh.

Thc tp VSV N.T.T.Thy
13
- Miêu t hình thái và s ny chi ca nm men.
- Miêu t hình thái c quan mang bào t và bo t ca nm mc
- Nhum Gram đi vi các loi vi khun. V hình thái và xác đnh s bt màu ca
chúng
Chun b dng c và hoá cht

Dng c
Kính hin vi, du soi kính
Que cy tròn và nhn
Phin kính thng và lõm, lá kính
èn cn.
Giá và chu thu tinh
Hoá cht
Xanh metylen axit phenic Cn 96
o
Tím gentian KI I
2
Axeton Safranin Fucshin Thc tp VSV N.T.T.Thy
14
BÀI 3 - MÔI TRNG NUÔI CY VÀ PHNG PHÁP PHÂN LP VSV

1. MÔI TRNG NUÔI CY
Kh nng tng h p và cách thc thu nhn nng lng khác nhau tu thuc vào mi
loi vi sinh vt. Do vy nhu cu v các cht dinh dng ca chúng cng khác nhau.
Môi trng dinh dng cn thit cho vic nuôi cy tích lu, phân lp, bo qun

bit rõ thành phn
Môi trng này đc s dng ph bin trong vi sinh vt hc công nghip đ thu
nhn các axit amin, vitamin và các sn phm quan trng khác trong hot đng sng
ca vi sinh vt
Thc tp VSV N.T.T.Thy
15
Cn c v công dng ca môi trng
Phân loi thành các môi trng: môi trng chn lc và môi trng chun đóan phân bit
Môi trng c s:
là môi trng đc s dng rng rãi nht và trên c s ca môi trng này có th
to ra các môi trng cn dùng khác. Môi trng c s thng thy nht là môi
trng nc pepton, môi trng nc tht pepton.
Môi trng chn lc:
Môi trng đm bo s phát trin  th ca mt loài hay mt nhóm vi sinh vt nào
đó ít thun li hoc hoàn toàn bt li đi vi d phát trin ca các vi sinh vt khác.
Các môi trng chn lc ch yu đc s dng đ phân lp vi sinh vt t môi
trng sinh sng t nhiên ca chúng hoc dùng đ nuôi cy tích lu.
Môi trng chun đoán phân bit (môi trng ch th)
Cho phép phân bit khá nhanh loài vi sinh vt này vi loài vi sinh vt khác. Thành
phn ca môi trng này phi tính toán, chn la sao cho phát hin đc rõ ràng
các đc đim ca loài đó.
Các môi trng ch th đc dùng trong vi khun hc lâm sàng, trong nghiên cu di
truyn hc và đnh tên vi sinh vt
Cn c vào trng thái vt lý ca môi trng
Cn c vào trng thái vt lý ca môi trng, có th phân bit thành các dng sau:
Môi trng lng:
Hp thành do s hoà tan các cht dinh dng cn thit  trong nc nh môi trng
nc tht, nc pepton, nc các loi c, qu nh carot, su hào, khoai tây, giá đ….
Môi trng này đc ng dng đ phát hin các đc đim sinh lý – sinh hoá ca vi
sinh vt, đ tích lý sinh khi hoc các sn phm trao đi cht, đ gi ging và bo

Thông thng điu chnh đ pH ca môi trng cao hn só vi yêu cu mt chút vì
theo kinh nghim, môi trng sau khi kh trùng pH s b h thp (môi trng thch
rn khi hp pH h 0,4; môi trng thch mm h 0,2; môi trng lng h 0,1
Mun điu chnh pH thng dùng dung dch HCl, NaOH, H2SO4, NaHCO3… pha vi
nng đ xác đnh
Lc và phân phi môi trng
Có th dùng giy lc, vi xô, bông hoc lc bng thit b lc chân không
Phân phi môi trng vào các dng c cn làm.
Chú ý lng môi trng không vt quá t l cho phép so vi dung tích vt cha đ
tránh b trào ra ngoài.
- Khi hp thch nghiêng không đ quá 1/4 dung tích ng
- Khi hp thch ng không đ quá 2/3 dung tích ng
- Khi hp thch trong bình tam giác, lng môi trng không vt quá 2/3 dung tích bình
Kh trùng
Thông thng kh trung trong ni hp áp lc. Nhit đ và thi gian kh trùng tu
thuc vào đc tính ca môi trng đó.
Do k nng d bin đi đc tính hoá hc ca môi trng khi có mt các cht trong
quá trình kh trùng, ta có th hp riêng r mt s cht, sau đó kt hp li vi nhau
trc khi dùng đ nuôi cy
Mt s môi trng d b phá hy  nhit đ cao, có th dùng phng pháp gián
đon (phng pháp tyndal) đ x lý.
Kim đnh
Sau khi hp kh trùng, đt môi trng trong t đnh ôn  nhit đ 30
0
C. Sau 24-
48h nu không thy vi sinh vt xut hin thì đt yêu cu
Bo qun
Môi trng đc kim đnh nu cha dùng ngay thì phi bo qun  nhit đ thp và tránh
ánh sáng giúp môi trng không b khô, không b oxy hoá hoc có nhng bin đi v pH,
đng thi gi cho môi trng không b nhim tp. Chú ý: thi gian BQ không quá dài

+ i vi vi khun lactic, nng đ 8-12
o
B
Nc mch nha đc kh trùng 0,5atm/20-30 phút
Môi trng khoai tây: đc s dng ch yu đ phân lp và nuôi cy các loài trong
ging Clostriodium và các đi din vi khun phân gii tinh bt khác.
Cách làm

Khoai tây gt v, ct nh : 200 g + 1 lít nc -> đun sôi (15 phút) -> phân phi vào
dng c nuôi cy -> kh trùng (1,5 atm/30 phút) -> CaCO
3
môi trng nuôi cy
2. Môi trng tng hp
Môi trng Hansen : s dng đ nuôi cy nm men
Nguyên liu (g/l)
Glucose(maltose, saccharose) : 50 g Pepton : 10g KH
2
PO
4
: 3g
MgSO
4
: 2-5g Thch : 20g pH : …
Cách làm

Hoà tan hn hp các nguyên lieu trong nc, đun cho tan ht thch, hp kh trùng,
121
o
C/15 phút
Môi trng Saburaud

Chun b dãy ng nghim cha 9ml nc vô trùng hoc dung dch NaCl 9% vô
trùng, s lng ng tu theo s c đoán s vi sinh vt trong mu nhiu hay ít.
Cách làm
(hình)
Chú ý: khi chuyn chuyn sang nng đ mi, cn thay pipet
Cy trên môi trng thch đa: các môi trng này đã đc chun b và kim
nghim t bài trc.
Cy t các đ pha loãng nào đó ph thuc vào s lng vi sinh vt có trong. Dùng
pipet vô trùng ly mt th tích nht đnh (thng là 0,05; 0,1; 0,2 ml)  các dch có
đ pha loãng tng ng, cy lên b mt thch có cha trong đa Petri, dùng que gt
dàn đu lên khp b mt môi trng.
T mi đ pha loãng cn lp li t 3-5 ln. Mi ln ch s dng 1 pipet và 1 que gt
vô trùng
Các đa cha môi trng đã cy đc đt vào t đnh ôn vi nhit đ thích hp đ
theo dõi s phát trin ca các vi sinh vt cn phát hin
Nói chúng, sau 24 gi, vi sinh vt đã sinh trng và phát trin tt, hình thành các
khun lc trong môi trng.  đm bo cho vi sinh vt mc ht, có th xác đnh
Thc tp VSV N.T.T.Thy
19
thi gian nuôi cy nh sau: vi khun 36-48 gi, nm men 48-72 gi, nm mc 96-
120 gi.
Ni dung thc tp và tng trình
Phn làm môi trng
- Chia thành các nhóm thc tp làm môi trng: canh tht. Pepton, môi trng khoai
tây, môi trng Hansen và môi trng Saburaud
- Tin hành đ môi trng thch nghiêng, thch đa đi vi môi trng Hansen và
Saburaud
- Nêu tóm tt cách làm môi trng và xác đnh hiu qu kh trùng môi trng trên.

Dng c, hoá cht và nguyên liu

Phn phân lp

- Chia thành các nhóm thc tp phân lp vi sinh vt trên môi trng rn: Bánh
biscuit, thóc, m; môi trng lng: nc sinh hot, nc da chua, sa ti. - - -
Tin hành làm các ng nghim có cha dung dch nc mui sinh lý tit trùng đ
pha loãng mu.
- Theo dõi s xut hin khun lc kh nng phát trin ca chúng. Xác đnh các đc
đim hình thái khun lc cng nh hình thái t bào. V hình minh ho
Thc tp VSV N.T.T.Thy
20