KILOBOOKS.COM
1

LI M U Sa l mt thc phm cú giỏ tr dinh dng cao, giỳp cho s hp th
phospho v canxi cao, cú tớnh khỏng th mnh, do vy rt tt cho tr em v
ngi gi. Lactoza l disccarit chim ch yu trong thnh phn sa. S cú mt
ca lactoza trong quỏ trỡnh ch bin thc phm ủụi khi khụng cú li, gõy sm
mu v to ra mựi khụng mong mun ủi vi sn phm khi gia nhit, lm nh
hng ti cht lng cm quan do s tỏi kt tinh ca chỳng. Sau khi dựng sa,
lactoza ủc enzym -galactosidaza trong rut non ca ngi phõn gii thnh
glucoza v galactoza. Tuy nhiờn nng lc tng hp enzym trờn ngi b mt
dn khi qua tui cai sa. Kt qu l ủi ủa s ngi trng thnh v ngi gi
trờn th gii ủu mc bnh thiu nng chuyn húa lactoza. Ngha l, nhng
ngi ny khi s dng nhiu sa s cú cỏc triu chng nh ủy hi, chng
bng, ủau bng, tiờu chy, bun nụn. Vỡ vy cỏc hng gii quyt ủc ủt
ủõy l:
Phỏt trin cỏc sn phm sa cú hm lng lactoza gim ủ nhng ngi
mc bnh thiu nng chuyn húa lactoza cú th s dng ủc.
Dựng trc tip cỏc ch phm enzym di dng thc phm nhm tng hot
ủ enzym -galactosidaza trong rut non.
thu phõn chuyn húa lactoza thnh glucoza v galactoza cú th dựng
axit hoc enzym -galactosidaza. Vic thu phõn bng axit dn ủn mt s bt
li nh hao mũn thit b, ụ nhim mụi trng, gõy khú khn cho vic ủm bo
an ton thc phm m phng phỏp enzym hon ton cú th khc phc ủc.
Ngoi ng dng trong cụng nghip thc phm, tim nng ng dng ca
enzym -galactosidaza trong cỏc lnh vc nghiờn cu c bn, trong sinh hc
phõn t v k ngh protein (lm cỏc gen thụng bỏo, ch th, cỏc phõn t cm
bin ), trong sn xut dc phm v trong y hc l rt ln.

THÖ VIEÄN ÑIEÄN TÖÛ TRÖÏC TUYEÁN
KILOBOOKS.COM
3

PHẦN I
TỔNG QUAN

I.1. SƠ LƯỢC VỀ ENZYM β-GALACTOSIDAZA:
Enzym β-galactosidaza là enzym xúc tác cho q trình thuỷ phân và
chuyển hóa các gốc β-D-galactozyl, trong đó có sự thủy phân lactoza thành
glucoza và galactoza [6].
Enym β-galactosidaza có trong nhiều tổ chức bao gồm các vi sinh vật, thực
vật và động vật. Các enzym này đã được ứng dụng trong nhiều q trình cơng
nghệ sinh học, đặc biệt là các enzym từ vi sinh vật được sử dụng để thủy phân
lactoza nhằm làm tăng khả năng tiêu hóa sữa hoặc để cải thiện các đặc tính chức
năng của các sản phẩm từ sữa. Phản ứng chuyển hố galactozyl cũng thường
được sử dụng để tạo ra các galacto-oligosaccrit nhằm cải biến về mặt chức năng
và cấu trúc của ngun liệu thực phẩm, dược phẩm và các hợp chất có hoạt tính
sinh học khác [6].
Trên thế giới hiện nay đã có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về enzym β-
galactosidaza, chủng vi sinh vật tổng hợp nên nó, đặc tính enzym, phương pháp
tách chiết, tinh chế và ứng dụng nó trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong
cơng nghiệp thực phẩm, trong y học và dược phẩm cũng như cả trong lĩnh vực
nghiên cứu cơ bản. Mặc dù vậy, ở nước ta, việc nghiên cứu về enzym này mới
chỉ là bước đầu và ứng dụng của chúng rất ít được đề cập đến.
I.1.1. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp β-galactosidaza :
Hiện nay các nhà nghiên cứu đã tìm ra được nhiều chủng loại vi sinh vật có
khả năng sinh tổng hợp enzym β-galactosidaza với hoạt lực cao. Enzym khi được
tổng hợp có thể ở dạng ngoại bào (tiết ra ngồi mơi trường) hoặc nội bào (tích tụ
trong tế bào, có thể ở dạng tự do hoặc ở dạng liên kết với màng, với plasma hoặc

Cu trỳc di phõn t ca cỏc enzym ny bao gm nhiu loi khỏc nhau t
monomer (enzym t Kluyveromces lactic) ủn octamer (enzym t E.coli) [4].
Tu thuc vo ngun thu enzym m tớnh ủc hiu phõn t ca tng loi
enzym l khỏc nhau. Cỏc enzym -galactosidaza cú ngun gc t vi khun cú pH
ti u thuc vựng trung tớnh, trong khi ủú hu ht cỏc enzym -galactosidaza t
nm mc cú pH thuc vựng axit, cú mt s chng ủt ti pH ti u l pH=2 [15].
Mt s enzym -galactosidaza t vi khun ủ cú hot tớnh cn phi cú mt
cỏc ion hoỏ tr 1 v cỏc ion hoỏ tr 2, vớ d nh enzym -galactosidaza t S.
rectivirgula cn phi cú mt nhiu ion kim loi hoỏ tr 2 ủ ủt ủn ủ bn nhit v
hot tớnh ti ủa. Tuy nhiờn mt s enzym -galactosidaza khỏc li khụng cn s cú
mt ca cỏc ion kim loi nh enzym t Rhizobium melioti [15].
Nhng ủim trờn cho ta thy tớnh ủa dng ca enzym -galactosidaza vi
sinh vt.

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM
5 I.2. CC NGUN ENZYM -GALACTOSIDAZA:

Mc dự rt nhiu enzym -galactosidaza t vi sinh vt ủc bit ủn
nhng ch cú mt s ớt cỏc vi sinh vt ủc la chn lm ngun sinh enzym
trong cụng nghip. Hu ht cỏc vi sinh vt ny cú ngun gc t nm mc nh l
Kluyveromyces lactic, K.fragilis, Aspergillus niger v A.oryzae hoc t vi
khun nh E.coli. Nhng loi vi sinh vt ủú ủc la chn chớnh vỡ chỳng cú th
to ra enzym -galactosidaza vi giỏ r v an ton khi cho thờm vo thc phm
[5].
Enzym t vi sinh vt, thc vt ủc ng dng rt rng rói trong cỏc quỏ
trỡnh cụng ngh sinh hc.

I.2.3. Enzym t thc vt lỏ bina:
Cỏc nh khoa hc ủó tỏch chit v tinh ch ủc enzym -galactosidaza
t lỏ cõy bina. Enzym -galactosidaza tỏch t ngun thc vt ny cú kh nng
thy phõn cỏc loi c cht khỏc nhau cỏc tc ủ khỏc nhau. C th l thy
phõn lactoza vi tc ủ bng 2% so vi thy phõn p-nitrophenyl--galactozit.
Monogalactozyldiglyxerit ủc hp th vo trong celit b thy phõn bi -
galactosidaza ti tc ủ nh hn 250 ln so vi thy phõn p-nitrophenyl--
galactozit [8].

I.3. MT S C CH CA CC PHN NG C XC TC BI
ENZYM -GALACTOSIDAZA :
I.3.1. C ch ủng hc ca phn ng vi ONPG:
C ch ủng hc ca phn ng vi s xỳc tỏc ca enzym -galactosidaza
t Escerichia coli cú th ủc th hin ủn gin nht bng phn ng vi 2-
nitrophenyl--D-galatopyranozit (ONPG). ONPG l c cht tng hp trong
ủú aglycon ủúng vai trũ l nhúm chuyn di. ONPG (ủc ký hiu l S) gn vi
enzym ủ hỡnh thnh phc cht Michaelis ES (bc a). 2-nitrophenolat nhanh
chúng ủc gii phúng ủ to thnh hp cht trung gian enzym-galatozyl (bc b),
mt phn hp cht ny ủc thu phõn tip theo (bc c) v phn cũn li ủc
chuyn hoỏ galatozyl (g,h). i vi phn ng thu phõn phõn t H
2
O phn ng
vi hp cht trung gian enzym galatozyl ủ to ra galatoza v enzym dng t
do (bc c). i vi phn ng chuyn hoỏ galatozyl, cht nhn galatozil (kớ hiu

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM
7

l Nu) cú mt trong hn hp phn ng gn vo v trớ glucoza ca enzym ủ to

ủc hỡnh thnh tm thi do nú cng l mt c cht trong enzym ny.


THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM
8

Khi nng ủ lactoza tham gia phn ng cao, lactoza cng ủúng vai trũ
cht nhn lactozyl (Nu) v sn phm chuyn hoỏ l lactozyllactoza. Ngc li,
galactozyllactoza cú th ủúng vai trũ lm cht nhn galactozyl ủ to ra cỏc
tetrasaccarit. Bng cỏch ny, hn hp cỏc oligosaccarid bao gm cỏc di-, tri- v
cỏc saccarit cao hn s ủc hỡnh thnh t lactoza.
I.3.3 C ch thu phõn lactoza ca -galactosidaza cú pH trung tớnh:
Nhúm sulfhydryl nm v trớ hot húa ca -galactosidaza ủúng vai trũ
lm axit chung ủ proton hoỏ nguyờn t oxy ca liờn kt galactozyt, mt nhúm
imidazol ủúng vai trũ lm nhúm ỏi nhõn v tn cụng vo v trớ C-1 ca glycon
ny. Phn ng ủó dn ủn s hỡnh thnh mt phc cht trung gian enzym-
galactozyl nh liờn kt ủng húa tr. Galatoza sau ủú tỏch khi enzym nh s
hp th mt proton t nc bi anion sulfhydryl ủúng vai trũ nh mt baz v
giỳp cho nhúm OH tn cụng vo v trớ C-1 (hỡnh bờn).
Hỡnh 2: C ch thu phõn lactoza ca -galactosidaza cú pH trung tớnh

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM
9
đó hoặc một nhóm enzym cùng tham gia vào việc xúc tác một trình phản ứng
dưới ảnh hưởng của hợp chất hóa học (mà thường là cơ chất phản ứng) gọi là sự
phản ứng sinh tổng hợp. Chất gây nên sự cảm ứng sinh tổng hợp (gây nên sự gia
tăng enzym nào đó) gọi là chất cảm ứng (yếu tố cảm ứng), còn enzym được tạo
thành bằng cơ chế cảm ứng được gọi là enzym cảm ứng. Chất gây kìm hãm sự
sinh tổng hợp một enzym nào đó gọi là chất kìm toả phụ, các enzym bị kìm hãm
khơng được tổng hợp gọi là enzym bị kìm toả.
Sự tạo thành các enzym dị hố (enzym xúc tác sự phân giải cơ chất) được
điều chỉnh bằng cơ chế cảm ứng sinh tổng hợp. Một trong những ví dụ điển hình
về cơ chế cảm ứng sinh tổng hợp enzym đã được nghiên cứu khá cặn kẽ là sự
tổng hợp enzym β-galactosidaza cần để sử dụng lactoza của tế bào E.coli. Các tế
bào E.coli ngun thuỷ có thể sinh trưởng trên nhiều cơ chất chỉ chứa một lượng
rất nhỏ β-galactosidaza. Nếu cho thêm vào mơi trường lactoza hay β-
galactosidaza khác trong trong một ít thời gian thì hoạt lực β-galactosidaza của
chúng tăng lên 1.000 lần. Trong trường hợp như vậy có đến 3% tồn bộ protein
tế bào là β-galactosidaza.

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM
11

I. 5. TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ ENZYM :
I.5.1 Tách chiết:
Để tách chiết và thu hồi enzym cần phải sử dụng nguồn ngun liệu có
khả năng tách chiết được một lượng lớn enzym bằng các quy trình thơng
thường. Đối với enzym từ một số nguồn cơ chất nhất định cần phải sử dụng
phương pháp tách chiết nhất định, khơng thay thế bằng phương pháp khác.
Ngun tắc chung của q trình tách chiết enzym là cần phải biết rõ vị trí
enzym nằm trong tế bào (enzym có mặt ở dạng tự do hoặc dạng liên kết với
màng) để xác định phương pháp tách chiết phù hợp. Đặc biệt trong trường hợp

)
2
SO
4
dựa trên cơ sở sự khác
nhau về khả năng kết tủa các protein ở một nồng độ muối (tính theo phần trăm
nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp
của các dịch enzym. Cũng có thể kết tủa phân đoạn bằng các dung mơi hữu cơ.
tuy nhiên phương pháp này chỉ dùng với những enzym ít bị biến tính bởi các
dung mơi hữu cơ chọn dùng. Để giữ cho enzym khỏi bị mất khả năng hoạt động,
q trình kết tủa phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (0
0
C).
Phương pháp hấp thụ chọn lọc được dùng phổ biến trong việc tách và làm
sạch enzym. Chất hấp thụ chủ yếu thường được dùng là hydroxyapatit cho hiệu quả
phân tách đặc biệt cao. Hấp thụ chọn lọc enzym có thể thực hiện bằng một trong hai
cách là chất hấp thụ protein tạp hoặc hấp thụ enzym. Q trình hấp thụ thường được
tiến hành ở 0
0
C. Enzym sau đó dược chiết bằng các dung mơi thích hợp.
Phương pháp sắc ký và trao đổi ion dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi
ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm lỗng và các tác nhân
trao đổi ion. Tác nhân trao đổi ion có thể là nhựa trao đổi ion hoặc dẫn xuất este
của xelluloza. Phương pháp sắc ký trên dietylaminoetylxelluloza (DEAE –
xenlluloza) có ưu điểm là với dịch chiết thích hợp ngồi tạp chất protein còn có
khả năng loại bỏ cả các tạp chất axit nucleic. Điều đó cho phép khơng cần dùng
đến các biện pháp nhằm loại bỏ axit nucleic khó và phức tạp như kết tủa
protamin hoặc streptomixinsufat thường dùng trước đây.
Sephadex là dẫn xuất của polysacarit dextran trong đó các phân tử của
chúng liên kết với nhau bởi các liên kết ngang xuất hiện nhờ tác dụng của

biến phomat. Q trình sản xuất phomat tạo ra một lượng lớn dịch sữa “whey”
dưới dạng sản phẩm phụ, dịch sữa này chứa lactoza có sẵn trong sữa tự nhiên.
Dịch sữa này là nguồn cacbonhydrat tốt và có tiềm năng lớn đối với lĩnh vực
thực phẩm cũng như thức ăn gia súc. Vấn đề là lactoza khơng hồ tan hồn tồn
và có xu hướng kết tinh từ dung dịch này. Điều này làm cho việc vận chuyển
dich sữa là khó khăn, đồng thời làm hạn chế việc tái sử dụng dịch sữa này, do
vậy mỗi năm người ta phải đổ đi một lượng lớn dịch sữa.
Lactoza có thể được thuỷ phân bằng cách sử dụng axit, song việc thuỷ
phân bằng axit gây ra màu và làm tắc nghẽn nhựa trao đổi ion trong q trình
chế biến.
Cách tốt hơn là sử dụng enzym β-galactosidaza. Enzym này đã được tìm
thấy trong nhiều hệ vi sinh vật. Tuy nhiên để sử dụng cho mục đích này thì nấm
men, nấm mốc và vi khuẩn vẫn là những nguồn khai thác thương mại chính.

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM
14

Một q trình khả thi về mặt kỹ thuật và cơng nghệ khi sử dụng enzym
này để thuỷ phân lactoza cũng cho phép sử dụng dịch sau đơng tụ sữa chua hoặc
dịch permeate, đồng thời hạn chế một số khó khăn về cơng nghệ như hiện tượng
“lên cát” ở kem, hoặc hiện tượng tái kết tinh các sản phẩm từ sữa như dịch sau
đơng tụ phomat. Một trong những tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực cơng nghệ
sinh học của enzym β-galactosidaza là khả năng thuỷ phân lactoza – thành phần
chính phụ của ngành cơng nghiệp chế biến sữa.
Đặc biệt các nghiên cứu về lâm sàng đã cho thấy những người bệnh bị
thiểu năng chuyển hố lactoza có thể sử dụng các sản phẩm sữa đã qua thuỷ
phân này, đồng thời làm giảm triệu chứng bệnh. Vì vậy, người ta mong muốn
sản xuất ra sữa có hàm lượng lactoza thấp sao cho mọi người đều có thể dụng
các sản phẩm từ nó.

phân giải liposom với sự có mặt của các muối hố trị 2 và được hồn ngun
gần như hồn tồn bằng cách hydrat hố lại [10].
• Sử dụng vi sinh vật chịu nhiệt để sinh tổng hợp nên enzym có tính bền
nhiệt cao có thể sử dụng trong các q trình chế biến đòi hỏi nhiệt độ cao.
Hạn chế lớn nhất của các enzym này là để vơ hoạt enzym sau q trình chế
biến cần phải gia nhiệt ở nhiệt độ cao, điều này đơi khi dẫn đến chất lượng sản
phẩm thay đổi.
• Sử dụng vi sinh vật có khả năng phát triển ở nhiệt độ thấp để sinh tổng
hợp enzym có khả năng ở nhiệt độ thấp.
Người ta mong muốn các enzym hoạt động ở nhiệt độ thấp này có phân tử
linh động hơn, cho phép biến đổi thuận nghịch về cấu tạo nhằm tạo điều kiện
cho hoạt động xúc tác. Tính linh động hơn về cấu trúc cũng khiến cho enzym
này nhạy đối với sự phá huỷ bởi nhiệt và hóa chất. Các enzym này cũng góp
phần đáng kể trong việc nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và sự ổn định của
các phân tử protein. Khi sản xuất các enzym này thì cơng nghệ tách cần phải
thực hiện trong các điều kiện nhẹ nhàng và giảm thiểu số bớt tinh chế nhằm hạn
chế sự hao hụt enzym [8].
1.6.2 Sử dụng phản ứng chuyển hố galactozyl tạo ra các oligosacarit từ lactoza:
Oligosaccharid còn được gọi là galactoligosacchatit (GO), là sản phẩm
của chuyển hố nội phân tử.
Trong những thập kỷ qua người ta đã phát hiện ra GO có tác dụng tốt đối
với sức khoẻ con người, GO có khả năng chống lại được chất gây ung thư, giảm

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM
16

lượng cholesterol và tốt cho đường ruột, GO còn được sử dụng làm chất tạo
ngọt, chất hồ tan… Vì vậy nó được dùng làm ngun liệu thực phẩm.
Để có sản phẩm GO lactoza, rất nhiều thử nghiệm được nghiên cứu trên


kh nng ng dng rng rói lm cỏc gen thụng bỏo trong nhiu h thng, chỳng
thng liờn quan ủn cỏc bnh di truyn ca ngi nh bnh GMY-
gangliosidosis v bnh Morquio typ B.
K ngh Protein l mt lnh vc cc k phỏt trin nhm to ra cỏc protein
ủa chc nng, to ra cỏc dng ủt bin ca enzym vi cỏc ủc tớnh tt v s
lng ngy mt gia tng. Enzym -galactosidaza t E.coli t lõu ủó ủc ng
dng rng rói lm cỏc maker phõn t. Bng cỏch ci cho phộp xỏc ủnh rừ v trớ
dung np ủi vi s ủiu tit ca cỏc peptit chc nng l v s biu hin ca
chỳng trờn b mt tip xỳc vi dung dch ca enzym cú hot tớnh. Hn na vic
ủnh v peptit khỏng th t virut trờn vũng hot hoỏ ca -galactosidaza to ra
mt phõn t cm bin nhm phỏt hin ủnh tớnh cỏc khỏng th ủc hiu. Vic
gn kt ca enzym ny vi huyt thanh hoc khỏng th ủn dũng ủc cho l
ngn chn s ci gn peptit. Hot tớnh ủc phc hi ny cú th ủc xỏc ủnh
mt cỏch chớnh xỏc, nhanh chúng v d dng bng phng phỏp so mu quang
ph. Vỡ cỏc lý do trờn, -galactosidaza trc ủõy ủc gi l phosphataza kim
cú th tr thnh nn tng cho mt th h phõn t cm ng mi t enzym .
I.7. NGUN THU T ENZYM CễNG NGHIP TRONG TNG LAI:
Mc dự vic sn xut v ng dng -galactosidaza ngy mt phỏt trin,
ngi ta vn c gng gim chi phớ sn xut, ti thiu hoỏ lng enzym cn s dng,
nhng nõng cao tc ủ v hiu sut thu phõn. Ngun enzym trong tng lai s l
enzym ủc s dng dng vi nng, enzym ủc ci bin bng phng phỏp hoỏ
hc hoc phng phỏp di truyn ủi vi chng vi sinh vt tng hp nờn nú.

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM
18

I.8. KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYM β-GALACTOSIDAZA TRONG
TƯƠNG LAI:

Agar: 15
÷
20g
Nước thêm ñạt 1000 ml
Thanh trùng ở 110
o
C/ 30 phút
II.1.1.2 Môi trường nuôi cấy cơ bản (môi trường Lactoza):
Lactoza: 20g
Pepton: 3g
NaCo
3
: 3g
KCl: 0.5g
MgSO
4
.7H
2
O: 0.5g
KH
2
PO
4
: 0.1g
FeSO
4
.7 H
2
O: 0.01g
ZnSO

2
SO
4
.
- Nguồn Nitơ hữu cơ sử dụng: Pepton, cao thịt bò.
II.2.3 Các hố chất khác:
- Cơ chất ONPG (o-nitrophenil-β-D-galactopyranoside): sản phẩm của
hãng Sigma Alrich-Germany.
- Thuốc thử X-Gal (5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-D-galactoside): sản
phẩm của hãng USB
TM
- Italia.
- Clorofrom tinh khiết.
- Dung dịch SDS (sodium dodecyl sunfate): 0.1%.
- Dung dịch Na
2
C0
3
. 1M.
- 2-mecaptoetanol.
- Các hố chất khác.
Ghi chú: Tất cả các hố chất phân tích đều là hố chất tinh khiết.
II.3 THIẾT BỊ:
- Kính hiển vi Nikon eclipse E800, camera Fujix Digital HC-300Zi,
Japan.
- Thiết bị so màu quang phổ Ultrospec

2000, Amersham pharmacia
biotech, Germany.
- Máy ly tâm lạnh Allegra TM 64R Centrifuge-Beckman, Germany.

+
): gm hu ht cỏc loi cu khun, trc
khun hiu khớ cú nha bo;
- Vi sinh vt gram õm (G
-
): gm vi khun ủng rut v vi khun axetic.
Hoỏ cht:

+ Dung dch tớm gential
+ Dung dch lugol
+ Cn 95
0

+ Dung dch fucsin
+ Du sộc
+ Toluen
Tin hnh:

+ Lm tiờu bn vi sinh vt, c ủnh vt bụi
+ Nhum bng tớm gential (gential violet): nh tớm gential lờn vt bụi, gi
trong 1-2 phỳt ri ủ ht thuc nhum ủi.
+ Nhum bng dung dch lugol: nh lugol lờn tiờu bn, ủ trong 1 phỳt ri
ủ thuc nhum ủi.

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM
22

+ Rửa bằng cồn 95
0

C chỉ thị này khơng bền và sẽ bị phân huỷ.
Đĩa thạch chỉ thị này được dùng để ni vi khuẩn. Sau một thời gian
ni cấy (tùy thuộc vào đặc tính của mỗi chủng riêng biệt), các chủng vi
khuẩn tạo khuẩn lạc có màu xanh trên đĩa chỉ thị là chủng có khả năng sinh
tổng hợp enzym β-galactosidaza.
Cần chú ý là các đĩa thạch sau khi đã thêm chất chỉ thị phải được bảo
quản trong tối ở 4
o
C và chỉ dùng được trong khoảng thời gian là 1 tháng.
II.4.3 Xác định hoạt độ enzym β-galactosidaza nội bào [9]:
Hố chất:

- Dung dịch đệm Z (pha cho 1 lít, bảo quản ở 4
0
C vơ hạn định), thành
phần trong dung dịch đệm Z là như sau:
+ Na
2
HPO
4
0,06M (ở dạng ngậm 12H
2
O, phân tử lượng là 358,14)
+ NaH
2
PO
4
0,04M (ở dạng ngậm 2H
2
O, phân tử lượng là 156.01)

.H
2
O 0,04M
iu chnh ủn pH 7,0 bng NaOH hoc H
3
PO
4
. Dung dch ny n ủnh
nhit ủ phũng v khụng cn phi pha mi hng ngy.
Dung dch c cht nng ủ 4 àg/ml ủc pha trong ủm photphat 0,1M,
pH 7,0 nờu trờn, ủc lc v bo qun 4
0
C cho ủn khi bt ủu ng sang mu
vng. tt hn l dung dch c cht ny ủc pha mi hng ngy.
- Dung dch SDS 0.1%
- Dung dch clorofom tinh khit.
Thit b v dng c:

- Thit b li tõm
- Thit b so mu quang ph
- Thit b n nhit
- Cỏc dng c khỏc
Tin hnh:

- Chun b sinh khi vi sinh vt:
+ Ly tõm ớt nht 2ml dch nuụi cy vi sinh vt, quỏ trỡnh ly tõm 4
0
C vi
tc ủ 6000 vũng/phỳt.
+ Loi b phn dch trong, phn cn bó ủc tỏi to huyn phự bng cựng

- c mt ủ quang ti 420 nm v 550 nm vi mu trng cú thnh phn
ging nh mu phõn tớch nhng th t thờm c cht v thờm cht dng phn ng
l ngc nhau, ngha l ban ủu thờm cht dng phn ng, thờm tip c cht ri
mi 28
0
C.
Tớnh kt qu:

Tớnh toỏn s ủn v hot ủ cú trong 1 ml dch nuụi cy theo cụng thc
sau:
1000 (OD
420
1,75.OD
550
)
E =
V.T.OD
600

Trong ủú: E: Hot ủ enzym (MU/ml)
V: th tớch ca mu ủem phn ng (ml)
T: thi gian phn ng (phỳt)
OD
420
v OD
550
: giỏ tr ủo mt ủ quang ca dung dch mu mu
sau phn ng cỏc bc súng 420 nm v 550 nm so vi mu trng.
OD
600