ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
SALIHAH
PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT CHÍNH
CÓ TÁC DỤNG CHỐNG OXI HÓA TRONG LÁ CHÙM NGÂY
(MORINGA OLEIFERA LAM.) Chuyên ngành: Hóa Sinh
Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA SINH
anh chị, bạn bè đồng nghiệp của tr
ường THPH Thủ Thiêm đã động viên, hỗ
trợ về vật chất lẫn tinh thần, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học Cao học.
∗ Anh Văn Đức Thịnh và các bạn học viên lớp Hóa sinh K18 đã cùng chia sẽ
buồn vui, cổ vũ tinh thần cho tôi những lúc tôi gặp khó khăn.
∗ Cám ơn gia đình luôn là động lực cho tôi phấn đấu trên bước đường của
mình.
Xin chân thành cảm ơn!
Salihah.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2011 1
MỞ ĐẦU
Cuộc sống hiện nay mang nhiều yếu tố bất lợi đối với sức khỏe của con
người, càng ngày con người càng đối mặt với nhiều căn bệnh nguy hiểm. Hầu như
90% nguyên nhân của bệnh tật hay lão hóa sớm đều trực tiếp hay gián tiếp do các
gốc tự do. Các gốc tự do tích lũy nhiều trong cơ thể sẽ tấn công các mô, nội tạng
của cơ thể và gây ra b
ệnh tật. Các bệnh chứng do tác động của các chất oxy hóa
ngày càng nhiều: tiểu đường, xơ vữa động mạch, đục nhân mắt, cao huyết áp, ung
thư… Chất chống oxy hóa có khả năng ngăn chặn những tổn hại của quá trình oxy
hóa gây ra bởi các gốc tự do nên có thể ngăn chặn sự xuất hiện của bệnh tật, lão hóa.
Do đó chất chống oxy hóa có vai trò quan trọng và không thể thiếu trong phác đồ
điề
u trị cũng như liệu pháp dự phòng các bệnh thoái hóa và ác tính. Vì thế trong
thời gian gần đây, chất chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên ngày càng thu hút
nhiều sự quan tâm.
Bên cạnh đó, Chùm Ngây (Moringa oleifera Lam.) là loài cây hiện đang rất
Danh mục bảng biểu
Danh mục hình ảnh
Mở đầu 1
Chương 1: Tổng quan tài liệu 3
1.1 Tổng quan về cây Chùm Ngây 3
1.1.1 Danh pháp và phân loại 3
1.1.2 Hình thái học 3
1.1.3 Sinh thái học và phân bố 5
1.1.4 Thành phần hóa học 5
1.1.5 Công dụng và bộ phận dùng 7
1.2 Tình hình nghiên cứu cây Chùm Ngây 9
1.2.1 Trên thế giới 9
1.2.2 Tại Việt Nam 12
1.3 Gốc tự do và chất chống oxi hóa 13
1.3.1 Gốc tự do 13
1.3.2 Chất chống oxi hóa 14
1.4 Tổng quan về hợp chất flavonoid 16
1.4.1 Sơ lược về hợp chất thứ cấp flavonoid 16
1.4.1 Chiết xuất flavonoid 19
Chương 2: Vậ
t liệu – Phương pháp 22
2.1 Vật liệu 22
2.1.1 Nguyên liệu 22
2.1.2 Dung môi, hóa chất 22
2.1.3 Thiết bị 22
2.2 Phương pháp nghiên cứu 23
2.2.1 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu 23
2.2.1.1 Xác định độ ẩm bột dược liệu 23
2.2.1.2 Xác định độ tro toàn phần 23
2.2.1.3 Xác định độ tro không tan trong acid chloric 24
3.4. Phân lập các hợp chất 62
3.4.1. Xác định các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp sắc ký
lớp mỏng 62
3.4.2. Sắc ký nhanh – cộ
t khô (Dry – column flash chromatography) 65
3.4.3. Sắc ký cột cổ điển 68
3.5 Xác định cấu trúc của hợp chất tinh khiết. 72
3.6 Tái đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của các hợp chất phân lập được 76
3.6.1. Hoạt tính quét gốc tự do DPPH 76
3.6.2. Khảo sát năng lực khử 80
3.6.3 Khảo sát hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do 82
Chương 4: Kết luận – Đề nghị 86
4.1 Kết luận 86
4.1.1 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu 86
4.1.2 Quy trình chiết xuất dược liệu và thu cao phân đoạn 86
4.1.3 Định lượng phenolic tổng và khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của các phân
đoạn 86
4.1.4 Phân lập các hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa 86
4.1.5 Tái đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của các chất phân lập 87
4.2 Đề nghị 87
Tài liệu tham khảo 88
Phụ lục
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Hàm lượng dinh dưỡng của Chùm Ngây Moringa oleifera Lam.
Bảng 1.2: Các chất chống oxy hóa và cơ chế tác dụng
Bảng 2.1: Quy trình dựng đường chuẩn acid gallic
Bảng 2.2: Nồng độ các cao phân đoạn đem định lượng
Bảng 2.3: Thông số sắc ký cột cổ điển
Bảng 2.4: Dãy nồng độ của các phân đoạn cao đem thử hoạt tính quét gốc tự do
Bảng 3.21: Thông số phổ
1
H (500 MHz, DMSO) và
13
C-NMR (125 MHz, DMSO)
của chất I đối chiếu với vitexin
Bảng 3.22: Thông số phổ
1
H (500 MHz, DMSO) và
13
C-NMR (125 MHz, DMSO)
của chất II đối chiếu với isoquercitrin
Bảng 3.23: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên vitexin
Bảng 3.24: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên isoquercitrin
Bảng 3.25: Giá trị IC
50
về khả năng quét gốc tự do của vitexin và isoquercitrin
Bảng 3.26: Năng lực khử của vitexin và isoquercitrin
Bảng 3.27: Hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do của vitexin và isoquercitrin
Bảng 3.28: Giá trị IC
50
về khả năng quét gốc hydroxyl tự do của vitexin và
isoquercitrin
(hệ 1)
Hình 3.15: Sắc ký lớp mỏng phân đoạn EM từ sắc ký nhanh – cột khô (hệ 1)
Hình 3.16: Sắc ký lớp mỏng các phân đoạ
n thu được từ sắc ký cột cổ điển (hệ 1)
Hình 3.17: Sắc ký lớp mỏng chất I (hệ 1)
Hình 3.18: Sắc ký lớp mỏng chất I (hệ cloroform – metanol – nước 65 : 35 : 10, lớp
dưới)
Hình 3.19: Kết tinh hình kim màu vàng của chất II
Hình 3.20: Sắc ký lớp mỏng chất II (hệ 1)
Hình 3.21: Sắc ký lớp mỏng chất II (hệ cloroform – metanol 9 : 1)
Hình 3.22: Công thức cấu tạo của chất I và chất II
Hình 3.23: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitexin
Hình 3.24: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của isoquercitrin
Hình 3.25: Giá trị IC
50
về hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitexin và
isoquercitrin so với vitamin C
Hình 3.26: Năng lực khử của vitexin, isoquercitrin và vitamin C
Hình 3.27: Hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do của vitexin và isoquercitrin
Hình 3.28: Giá trị IC
50
về khả năng quét gốc hydroxyl tự do
Phân lớp: Sổ (Dilleniidae)
Bộ: Màn màn (Capparales)
Họ: Chùm ngây (Moringaceae)
Chi: Chùm ngây (Moringa Adans.)
Loài: Chùm ngây cải ngựa (Moriga oleifera Lam.)
Chi Chùm ngây (Moringa) là chi duy nhất trong họ Chùm ngây
(Moringaceae). Chi này có 13 loài, tất cả trong số chúng đều là các cây thân gỗ sinh
sống trong khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Loài phổ biến nhấ
t là Chùm ngây
Moringa oleifera Lam Loài cây này được trồng nhiều nơi trong khu vực nhiệt đới,
và là loài duy nhất của chi Moringa có mặt tại Việt Nam [2].
1.1.2. Hình thái học:
Cây nhỏ hay cây nhỡ, cao 5 – 10m. Vỏ cây dày, có khía rãnh. Thân non có
lông.
Lá kép, mọc so le, 3 lần lông chim, dài 30 – 60 cm, có 6 – 9 đôi lá chét hình
trứng, mọc đối.
Cụm hoa mọc thành chùy ở kẽ lá; lá bắc hình chỉ; hoa màu trắng, hơi giống
hoa họ Đậu; đài có 5 răng hình thuôn, uốn cong; tràng có 5 cánh hình thìa; nhị 5,
chỉ nhị có lông ở gốc, bầu thượng, 1 ô, có lông. Cây ra hoa vào tháng 1 – 2. 4
Quả nang treo, có thiết diện tam giác, dài 25 – 30 cm hay hơn, mở làm 3
mảnh; hạt có 3 cạnh và có màu trắng, dạng màng [2].
(c) (d) Hình 1.1: (a): Chùm ngây Moringa oleifera Lam. Và các bộ phận lá (b),
hoa (c), quả (d) 5
1.1.3. Sinh thái học và phân bố:
Chùm ngây là loài cây nhiệt đới và cận nhiệt đới, thích hợp với đất cát khô
và có khả năng chịu hạn hán. Theo một số báo cáo thì chi Chùm Ngây chịu được
nhiệt độ từ 18,7 – 28,5
o
C và pH khoảng 4,5 – 8 [6].
Cây có nguồn gốc ở Tây Bắc Ấn Độ, sau được đưa vào trồng rộng rãi ở Ấn
Độ, Hy Lạp, Philippin, Thái Lan, Malaysia, Pakistan, Singapore, Cuba, Nigeria
Hiện nay tồn tại quần thể Chùm ngây mọc hoang ở cận Hymalaya, từ vùng Chenab
đến phía đông của Sarda (Ấn Độ) [2]. Ngoài ra, người ta còn tìm thấy Chùm Ngây
phân bố ở châu Phi, Madagascar.
Ở nước ta, cây này mọc hoang hoặc được trồng ở các tỉnh phía Nam từ Đà
Nẵng, Nha Trang, Phan Thiết vào đến Kiên Giang và cả đả
o Phú Quốc. [2]
1.1.4. Thành phần hóa học:
Chùm ngây là mặt hàng thực phẩm quan trọng, được chú ý
đến như là một
nguồn dinh dưỡng tự nhiên của vùng nhiệt đới. Lá Chùm ngây giàu β-caroten,
protein, vitamin C, calcium, kali và dồi dào chất chống oxi hóa tự nhiên như acid
ascorbic, flavonoids, phenolic và carotenoid [36].
Kết quả phân tích hàm lượng dinh dưỡng của quả, lá tươi và bột khô
của lá cây Chùm Ngây có thể được tóm tắt như bảng 1.1 [13]
Bảng 1.1: Hàm lượng dinh dưỡng của Chùm Ngây Moringa oleifera Lam.
STT
THÀNH PHẦN DINH
DƯỠNG/100gr
TRÁI
TƯƠI
LÁ TƯƠI
BỘT LÁ
KHÔ
01 Nước % 86,9 %
75,0 % 7,5 %
02 Calori 26
92 205
03 Protein (g) 2,5
6,7 27,1
04 Chất béo (g) 0,1
1,7 2,3
05 Carbohydrat (g) 3,7
13,4 38,2
06 Chất xơ (g) 4,8
0,9 19,2
Rễ có vị đắng, được xem như một loại thuốc bổ cho cơ thể và phổi, điều kinh,
long đàm, lợi tiểu nhẹ. Ở Nicaragua, nước sắc rễ được dùng chữa bệnh phù thủng.
Dịch rễ được dùng ngoài để điều trị chứng mẩn ngứa do dị ứng. Trong rễ và hạt,
cũng có chất kháng sinh pterygospermin [13].
Pakistan dùng vỏ rễ dùng sắc lấy nước trị đau răng, đau tai. Hay rễ tươi của
cây
non dùng trị nóng sốt, phong thấp, gout, sưng gan và lá lách.
Vỏ thân Chùm Ngây
Vỏ cây được dùng điều trị chứng thiếu vitamin C, đôi khi dùng trị tiêu chảy.
Ở Ấn Độ, người ta hay dùng vỏ thân chùm ngây để trị nóng sốt, đau bao tử,
đau bụng khi có kinh, sâu răng, làm thuốc thoa trị hói tóc, chữa đau cổ họng (dùng
chung với hoa của cây nghệ, hạt tiêu đen), trị tiểu ra máu, trị thổ tả [17].
Vỏ cây được người dân Campuchia dùng làm thuố
c cho phụ nữ sau khi sinh
đẻ uống như là nước chóng lại sức.
Vỏ thân được Thái Lan dùng làm thuốc thông hơi.
Hay người dân Pakistan dùng vỏ thân để phá thai bằng cách đưa vào tử cung,
gây giãn nở.
Nhựa cây có công dụng giảm đau, chống sưng tấy. 8
Lá Chùm Ngây
Lá dùng uống để điều trị chứng hạ huyết áp và vò xát vào vùng thái dương
để trị chứng nhức đầu.
Lá còn được dùng để điều trị các vết cắt ở da, vết trầy xướt, sưng tấy, nổi
mẩn ngứa hay các dấu hiệu của lão hóa da.
Dịch chiết từ lá có tác dụng chống nhiễm trùng da. Nó cũng được dùng để
điều khiển lượng đường máu trong trường h
ợp bị bệnh tiểu đường. Dịch chiết từ lá
Hạt còn dùng trị chứng trướng bụng, khó tiêu và còn có tác dụng giảm đau.
Ở Philippines, chúng được xem là bạn thân của các bà mẹ vì có tác dụng làm lợi sữa.
1.2. Tình hình nghiên cứu cây Chùm Ngây
1.2.1. Trên thế giới:
Hoạt tính kháng nấm gây bệnh
Nghiên cứu tại Institute of Bioagricultural Sciences, Academia Sinica, Đài
Bắc (Đài Loan) ghi nhận dịch chiết từ lá và hạt Chùm Ngây bằng etanol có các hoạt
tính diệt được nấm gây bệnh loại Trichophyton rubrum, Trichophyton
mentagrophyte , Epidermophyton floccosum và Microsporum canis.
Rễ Chùm Ngây có hoạt tính kháng khuẩn và chứa nhiều các hợp chất kháng
khuẩn. Yếu tố kháng vi sinh vật là pterygospermin, có hoạt tính kháng khuẩn và
kháng nấm mạnh. Phức hợp tương tự, liên quan đến ho
ạt tính kháng khuẩn và
kháng nấm cũng được tìm thấy ở hoa. Dịch chiết rễ cũng có hoạt tính chống vi sinh
vật do sự có mặt của hợp chất 4- α-L-rhamnosyloxybenzyl isothiocyanat. Aglycon
của deoxy-niazimicin [N-benzyl, S-ethyl thioformat] phân lập từ phân đoạn
cloroform của dịch chiết etanol vỏ rễ cũng liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn và
kháng nấm [20].
Tác dụng của quả Chùm Ngây trên cholesterol và lipid trong máu
Nghiên cứu tại Đại học Baroda, Kalabhavan, Gujarat (Ấn Độ)
về hoạt tính
trên các thông số lipid của quả Chùm Ngây, thử trên thỏ, ghi nhận: Thỏ cho ăn
Chùm Ngây (200mg/kg mỗi ngày) hay uống lovastatin (6mg/kg/ngày) trộn trong
một hỗn hợp thực phẩm có tính cách tạo cholesterol cao, thử nghiệm kéo dài 120
ngày. Kết quả cho thấy Chùm Ngây và lovastatin có tác dụng làm hạ
cholesterol, phospholipid, triglycerid, VLDL (very low density lipoprotein), LDL
(low density lipoprotein) hạ tỷ số cholesterol/phospholipid trong máu so với thỏ
trong nhóm đối chứng [40].
Chùm Ngây là do sự có mặt của hợp chất 4-[α-[L-rhamnosyloxy] benzyl]-o-metyl
thiocarbamat [27]. Đ
ây là cơ sở để lý giải vì sao lá Chùm Ngây được dùng để chữa
bệnh tiêu chảy trong y học dân gian. Ngoài ra, hoạt tính chống co thắt từ những
thành phần khác nhau còn là cơ sở dược lý để loài cây này được sử dụng trong điều
trị rối loạn nhu động ruột. Dịch chiết metanol lá Chùm Ngây thể hiện hoạt tính 11
chống viêm loét và bảo vệ gan trên chuột. Dịch chiết nước của lá cũng có hoạt tính
chống viêm loét cho thấy rằng những phức hợp chống viêm loét là phổ biến trong
loài cây này. Cũng có những nghiên cứu công bố rễ Chùm Ngây có hoạt tính bảo vệ
gan. Dịch chiết nước và dịch chiết cồn hoa Chùm Ngây cũng có hoạt tính bảo vệ
gan đáng kể, có thể là do sự có mặt của quercetin, một loại flavonoid phổ biến với
hoạt tính bảo vệ gan [28].
Các chất gây đột biến gen từ hạt Chùm Ngây rang chínMột số các hợp chất các chất gây đột biến gen đã được tìm thấy trong
hạt Chùm ngây rang chín: Các chất quan trọng nhất được xác định là 4 (α
Lrhamnosyloxy) phenylacetonitril; 4-hydroxyphenylacetonitril và 4-
hydroxyphenyl-acetamid [6].
Khả năng ngừa thai của rễ Chùm Ngây
Nghiên cứu tại Đại học Jiwaji, Gwalior (Ấn Độ) về các hoạt tính kháng
estrogen, ngừa thai của nước chiết từ rễ Chùm Ngây ghi nhận chuột đã bị cắt
buồng trứng, cho uống nước chiết, có sự gia tăng trọng lượng của tử cung.
Khi cho chuột uống nước chiết này chung với estradiol dipropionat
(EDP) thì có sự tiếp nối tụt giảm trọng lượng của tử cung so sánh với sự gia
tăng trọ
u trên da của chuột thí nghiệm [14].
1.2.2. Tại Việt Nam:
Trong những năm gần đây, tại Việt Nam bắt đầu có những nghiên cứu tập
trung vào đối tượng Chùm Ngây, chủ yếu là các nghiên cứu về thành phần hóa học
và hoạt tính sinh học, tác dụng dược lý, nhằm có những biện pháp nghiên cứu, chế
biến và sử d
ụng hiệu quả đối tượng này. Trong số đó, một số công trình nghiên cứu
nổi bật đã được công bố:
- Đại học Y dược Tp. HCM, 2011, cũng đã có công trình nghiên cứu về
tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan của các dạng cao chiết từ lá cây
Chùm Ngây. Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao lá Chùm Ngây trồng tại
Việt Nam có khả năng chống oxy hóa và bảo vệ gan. Khả năng này thể
hiện rõ nhất là dịch chiết lá Chùm Ngây bằng cồn 60% ở liều 0,2g/kg.
Nhận định này được rút ra dựa trên các nghiên cứu MDA, GSH, AST,
ALT.
- Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. Hồ Chí Minh (2010) đã khảo sát được
trong lá Chùm Ngây có những nhóm hợp chất là: chất béo, tinh dầu,
carotenoid, triterpenoid, coumarin, flavonoid, tannin, acid hữu cơ. Đồng
thời, tác giả cũng đã khảo sát và ghi nhận được những đặc điểm về hình 13
thái và vi học, cũng như đặc điểm của bột dược liệu lá Chùm Ngây.
Ngoài ra, công trình này cũng đã định lượng được flavonoid toàn phần
có trong lá cây Chùm Ngây mọc tại Tp. Hồ Chí Minh và Đồng Nai,
giữa lá non và lá già. Từ đó, rút ra được mối tương quan giữa hàm lượng
flavonoid trong lá với nơi cây mọc, cụ thể là hàm lượng flavonoid sẽ gia
tăng khi cường độ chiếu sang vào cây (cường độ tia UV) tăng và hàm
lượng flavonoid trong cây non sẽ cao hơn trong cây già [6].
- Gốc tự do ngoại sinh có trong môi trường sống xung quanh, có
thể được sinh ra do bức xạ mặt trời, tia X; sinh ra trong quá trình
chế biến thực phẩm như chiên, nướng, cũng có trong thành phần
của rượu bia, thuốc lá; hay có trong các chế phẩm hóa học như
thuốc xịt côn trùng… Các gốc tự do này thường đa dạng và phức
tạ
p hơn.
Trong cơ thể sinh vật luôn tồn tại một cơ chế cân bằng nhất định các gốc tự
do được sinh ra lẫn dung nạp vào cơ thể nhờ các chất chống oxy hóa. Tuy nhiên,
khi vì một lý do nào đó làm phá vỡ hệ thống cân bằng này, các gốc tự do sẽ khởi
động những chuỗi phản ứng dây chuyền oxy hóa những chất nền trong cơ thể,
đáng chú ý là các lipid màng tế bào. Lipid màng tế bào khi đã bị oxy hóa s
ẽ bị
thay đổi các đặc tính lý hóa, làm thay đổi các hoạt tính đặc hiệu, ảnh hưởng đến
quá trình trao đổi chất qua màng tế bào. Đồng thời, khi vào trong tế bào, các gốc
tự do sẽ có thể tấn công DNA, RNA, protein, lipid, tấn công ty thể và các bào
quan khác, hay làm biến đổi enzyme và rối loạn nội tiết tố (hormone) cũng thông
qua phản ứng oxy hóa khử.
Theo ThS. BS. Phan Bích Nga- Viện dinh dưỡng, tổn thương do các gốc tự
do gây ra cho tế bào là cơ sở sinh bệnh học của nh
ững trạng thái bệnh thường gặp
ở những người có tuổi như vữa xơ động mạnh, bệnh tiểu đường, bệnh ung thư…
Các nghiên cứu khoa học gần đây cũng cho thấy các phân tử sinh học bị tổn
thương sẽ gây ra tình trạng bệnh lý của tế bào và cơ thể sống như bệnh ung thư,
chứng xơ vữa động mạch, các bệnh tim mạch, bệnh
đái tháo đường, bệnh viêm
nhiễm, bệnh về da, bệnh Alzheimer…
1.3.2. Chất chống oxy hóa:
Chất chống oxi hóa là những chất có khả năng nhường điện tử cho những
gốc tự do hay đưa các gốc tự do về trạng thái cân bằng, làm mất đi tính thiếu ổn
hóa (quinon)
- Dạng oxy hóa của chúng có thể chuy
ển thành dạng lưỡng gốc và
như vậy chúng có thể phản ứng với hai gốc tự do nữa. Tuy nhiên,
phản ứng này yếu.
- Đặc biệt là dạng khử và dạng oxy hóa có thể phản ứng với nhau
Copyright: Tài liệu đại học ©