- 1 -
MỞ ĐẦU
- Acrylamide là một hoá chất công nghiệp sử dụng chủ yếu là để sản
xuất polyacrylamide; nó cũng vừa được phát hiện trong thực phẩm với
hàm lượng khá cao. Acrylamide được hình thành trong quá trình chiên,
nướng và đút lò của nhiều loại thực phẩm khác nhau, đặc biệt là các
thực phẩm giàu tinh bột như khoai tây và các sản phẩm ngũ cốc. Các
nhà khoa học trên thế giới quan tâm đến acrylamide vì tính độc hại của
nó trong thực phẩm, chính là khả nă
ng gây ung thư và phá huỷ DNA.
Nó là nguyên nhân gây ra những khối u ở chuột phòng thí nhiệm, dù
chưa có bằng chứng chứng minh phơi nhiễm acrylamide qua thực phẩm
là nguyên nhân gây ung thư ở người. Nó cũng được biết đến là chứng
độc thần kinh ở người và ảnh hưởng đến quá trình sinh sản của con
người. Nhiều quốc gia và các hiệp hội quốc tế thực hiện đánh giá nguy
cơ độc hại của acrylamide trong thực phẩ
m và đưa ra kết luận rằng cần
có nhiều nỗ lực giảm hàm lượng chất này xuống thấp nhất có thể [15]
- Acrylamide được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm chiên, nướng,
đút lò, nó tồn tại trong những sản phẩm thực phẩm chế biến công
nghiệp cũng như nấu tại nhà. Acrylamide có phổ biến trong các sản
phẩm chế biến từ khoai tây ở nhiệt độ cao (khoai tây chiên, snack
khoai tây…), ngũ
cốc, bánh mì nướng, bánh quy, các sản phẩm bánh
công nghiệp, cà phê. Chưa có tổ chức cũng như quốc gia nào đưa ra
được hàm lượng tối đa cho phép của Acrylamide trong thực phẩm [15]
- Trong cuộc sống bận rộn ngày nay, thực phẩm ăn nhanh, chế biến sẵn
trở nên được ưa chuộng ở Việt Nam đặc biệt là snack khoai tây, mì ăn
liền…, ẩn trong nó là những mối nguy tiềm tàng ảnh hưởng đến sức
khoẻ
người tiêu dùng. - 3 -
TỔNG QUAN
CHƯƠNG 1: ACRYLAMIDE
1.1.Cấu tạo, tính chất và ứng dụng của acrylamide [8], [46]
Acrylamide là chất hóa học có công thức phân tử C
3
H
5
NO, công thức cấu tạo

phân tử lượng 71.08g/mol và tên IUPAC là prop-2-enamide, với tính chất vật lý
và hóa học:
+ Là tinh thể rắn màu trắng, không mùi
+ Nhiệt độ nóng chảy: 84.5 ± 0.3
o
C
+ Áp suất hơi: thấp (0.007 mmHg ở 25
o
C, 0.03 mmHg ở 40
o
C, 0.07 mmHg ở
50
o
C và 0.14 mmHg ở 55
o
C)

Carbon tetrachloride 0.038
n-Heptane 0.0068
- 4 -
Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lựa chọn phương pháp phân tích acrylamide có thể
kể đến là: độ tan, khối lượng phân tử nhỏ, độ bay hơi thấp…
Acrylamide là sản phẩm công nghiệp do sự thủy phân của acrylonitrile
Acrylamide được sử dụng để tổng hợp các polyacrylamide làm chất keo tụ: dùng
trong xử lý nước uống và nước thải, làm môi trường điện di, sử dụng trong công
nghiệp làm giấy, tinh chế quặ
ng…Một vài acrylamide được dùng trong sản xuất
thuốc nhuộm và sản xuất các monomer khác
1.2. Sự hình thành Acrylamide trong thực phẩm
Acrylamide trong thực phẩm được Swedish National Food
Administration công bố lần đầu tiên vào tháng 4 năm 2002. [14] Cơ quan
này đã sử dụng máy sắc ký lỏng 2 lần khối phổ (LC-MS/MS) để phát hiện
và khảo sát trong diện rộng các loại thực phẩm với số lượng hơn 100 mẫu
thực phẩm các loại. Các nhà nghiên cứu nhận thấy acrylamide không
được
tìm thấy trong các loại thực phẩm chưa qua chế biến và thực phẩm luộc.
Trong các sản phẩm khoai tây chiên hoặc các sản phẩm ngũ cốc được
chiên hoặc nướng như bánh bích qui … hàm lượng acrylamide nằm trong
khoảng từ 100-2300 µg/kg. Hơn một nửa số mẫu khoai tây chiên được
khảo sát có hàm lượng acrylamide trên 1000 µg/kg.
Nghiên cứu tiên phong trên đã mở đầu cho hàng loạt các nghiên cứu
khác nhau về khảo sát đánh giá thực trạng hàm lượng acylamide trong các
sả
n phẩm thực phẩm khác nhau, trong đó tập trung chủ yếu vào các đối
tượng thực phẩm giàu tinh bột và được chế biến ở nhiệt độ cao ở các quốc
gia khác nhau như Na Uy, Anh, Mỹ, Úc, Hồng Kông… Năm 2003,
Australia đã tiến hành khảo sát 112 mẫu thực phẩm giàu tinh bột trên thị

µg/kg
Maximum
µg/kg
Bánh biscuit 227 169 313-317 4200
Bánh mỳ 272 46-50 126-136 2430
Các loại ngũ cốc
dùng ăn điểm tâm
128 79-100 135-156 1600
Thực phẩm ngũ cốc
dành cho trẻ em
76 5-42 52-74 353
Cà phê 208 188 249-253 1158
Khoai tây chiên 529 253 348-350 2668

Sản phẩm khác 854 160-169 305-313 4700
Snack khoai tây 216 490 626-628 4180
Các sản phẩm khoai
tây nấu tại nhà
121 150 310-319 2175
- 6 -
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy acrylamide được hình thành trong phản ứng
Maillad và chất chính để hình thành acrylamide là asparagine (một acid amine)
và đường khử (glucose, fructose, sucrose…) [45]

Hình 1.1: Cơ chế hình thành acrylamide theo phản ứng Maillard
Hàm lượng acrylamide phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lượng đường
và asparagine trong thực phẩm, nhiệt độ chế biến thực phẩm, thời gian chế
biến… Nhiệt độ càng cao thì acrylamide hình thành càng nhiều, thời gian
- 7 -
chế biến, hàm lượng đường và asparagine cũng tỉ lệ thuận với sự hình

(15%), còn lại là cà phê (13%), bánh bích qui, bánh mì
Phơi nhiễm của quần thể dân số trung bình là 1μg/kg khối lượng cơ
thể/ngày) (JECFA 2005) thấp hơn 500 lần so với 0,5 mg/kg khối lượng cơ
thể/ngày (lượng cao nhất không gây ảnh hưởng
đến hệ thần kinh) [11]
Tuy nhiên IARC kết luận: acrylamide thuộc nhóm 2A là chất có thể
gây ung thư cho con người mặc dù không có bằng chứng đầy đủ về khả
năng này đối với con người. Nhưng có bằng chứng đầy đủ trên thực
nghiệm về khả năng gây ung thư trên động vật do acrylamide và chất
chuyển hóa glycidamide phản ứng cộng hóa trị với DNA ở chuột.
Acrylamide và glycidamide cộng hóa trị với haemoglobin ở nhữ
ng người
bị phơi nhiễm và ở chuột; đồng thời acrylamide gây đột biến gen và sai
hình (đột biến) nhiễm sắc thể trong tế bào mầm của chuột [23].
1.4. Các qui định về acrylmide:
Sau đây là một vài tiêu chuẩn cho phép của hàm lượng acrylamide
Bảng 1.3: Một vài tiêu chuẩn cho phép về hàm lượng acrylamide [8]
Nguồn Giới hạn cho phép Tham khảo
Vật liệu bao gói thực phẩm
10 μg/kg EU Commission, 2002b
Nước uống
1 μg/l
WHO-World Health
Organization

0.5 μg/l

EPA- Environmental
Protection Agency


Tuy nhiên, do sự phức tạp của các nền mẫu thực phẩm các phương pháp
này không hiệu quả để phân tích acrylamide ở hàm lượng vết. [43]
- Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS ) cũng là phương pháp
lựa chọn ưu tiên khi hàm lượng Acrylamide thấp hơn 50 µg/kg ở sản
phẩm ngũ cốc sau tạo dẫn xu
ất (brom hóa) [33]
- Đầu dò khối phổ được ưu tiên chọn lựa khi kết hợp với sắc ký lỏng để dễ
dàng khẳng định lại cấu trúc vì acrylamide là chất có khối lượng phân tử
nhỏ mà nền mẫu thực phẩm lại vô cùng phức tạp [17] [43]

Một số các qui trình phân tích acrylamide trong một vài sản phẩm thực phẩm,
sử dụng các dung môi chiết khác nhau, các cách làm sạch khác nhau được
trình bày ở bảng 1.4
- 10 -
Bảng1. 4: Một số các phương pháp xác định acrylamide trong thực phẩm:
Sản phẩm
Dung môi
chiết
Làm sạch &
dẫn xuất
Thiết bị đo Tham khảo
Khoai tây chiên,
bánh cookies,
cacao, cà phê
H
2
O (70

Bromate hóa
EtOAc
GC-ECD
GC-MS
[44]

Ngũ cốc
H
2
O
Carrez I +
Carrez II
Bromate hóa
EtOAc-
Hexane (4:1)
Cột Florisil
GC-MS
[33]

Khoai tây chiên,
snack khoai tây
H
2
O
SPME
GC-PCI-
MS/MS
[28]

Snack khoai tây

Snack khoai tây,
thịt, bánh mì
H
2
O
SPE Isolute
Multi-Mode
300mg
LC-MS/MS

[40]
- 11 -
Sản phẩm
Dung môi
chiết
Làm sạch &
dẫn xuất
Thiết bị đo Tham khảo
Snack khoai tây,
ngũ cốc, bánh mì,
cà phê
H
2
O (80
o
C)
CH
2
Cl
2

Carrez II
SPE Oasis
MCX
LC-MS

[34]
Sản phẩm từ khoai
tây và ngũ cốc
H
2
O
SPE Oasis
HLB
SPE Bond
Elu
t
-Accucat
LC-MS/MS
[18]
Ghi chú:
SPE Oasis HLB: cột chiết pha rắn C18 nối silicagel HLB của Oasis
SPE Bond Elut-Accucat: cột chiết pha rắn với chất mang là hỗn hợp mạch C8 và
chất trao đổi cation (SCX) và cả anion mạnh (SAX) của Agilent
SPE Isolute Multi-Mode: cột chiết pha rắn với chất mang là hỗn hợp mạch C18
và chất trao đổi cation (SCX) và cả anion mạnh (SAX)
SPE MAX/MCX: kết hợp 2 cột chiết pha rắn với chất mang là chất trao đổi
cation (MCX) và anion trung bình (MAX)
* Ưu và nhược điểm của các phương pháp xác định acrylamide:
Thiết bị sắc ký lỏng LC với các đầu dò UV, DAD:
• Ưu: thiết bị rẻ tiền, xử lý mẫu đơn giản

c đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền. Do đó, sắc ký lỏng pha đảo
được sử dụng nhiều.
1.6.1.2. Nguyên tắc: Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng
dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên
tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu
trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất khác nhau, nên khả năng tương
tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do đó, chúng di chuy
ển
với tốc độ khác nhau trong cột tách và tách khỏi nhau.
- 13 -
1.6.1.3. Sơ lược các bộ phận chính của thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng
cao:
Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận chính sau: bơm, bộ
tiêm mẫu, cột sắc ký, đầu dò, bộ phận điều khiển và xử lý số liệu

Hình 1. 3: Sơ đồ một thiết bị HPLC
• Bơm: tạo áp lực giúp pha động di chuyển trong hệ thống, tạo dòng ổn định
khi thành phần pha động thay đổi. Áp lực bơm sử dụng tùy thuộc vào tốc
độ dòng, độ nhớt pha động và kích thước pha tĩnh.Gồm 2 chế độ:
o Chế độ đẳng dòng: thành phần pha động không thay đổi, thời gian
phân tích dài, độ phân giải kém
o Chế độ gradient dòng: thành ph
ần pha động thay thổi trong quá
trình phân tích.
• Bộ tiêm mẫu: Dùng đưa mẫu vào hệ thống, bao gồm van 6 cổng, vòng
mẫu (loop) cho phép tiêm một thể tích giống nhau vào thiết bị…
• Cột sắc ký: thường làm bằng thép không rỉ; có đường kính 2.1 – 7.6mm,
chiều dài cột 1 – 30cm, đường kính hạt 3 - 10µm; trơ, có thành phẳng và
chịu được áp suất cao
BƠM 1

đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z. Các tín hiệu
thu được sẽ chuyển vào máy tính thông qua phần mềm xử lý và lưu trữ.
1.6.2.3. Cấu tạo của thiết bị khối phổ: gồm 3 phần chính: nguồn ion hóa,
bộ phận tách ion và đầu dò ion
• Nguồn ion hóa: là nơi tạo ion, sử dụng các kỹ thuật: ion hóa phun
điện tử (ESI-electrospray ionization), ion hóa hóa h
ọc ở áp suất
thường (APCI-atmospheric pressure chemical ionization), ion quang
hóa học ở áp suất khí quyển (APPI- atmospheric pressure
photoionization)
o Kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI):
• Ion được tạo ra trong pha dung dịch
• Thích hợp cho chất không bền nhiệt, chất khá phân cực, chất có
phân tử khối lớn
• Quá trình tạo ion: Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc
ký được đưa vào một ống mao quản bằng kim loại áp thế cao và sau
đó được phun mịn bằng khí nitơ thoát ra xung quanh ống mao quản.
Dưới tác dụng của
điện thế cao, có sự tạo thành những hạt nhuyễn
mang điện tích thoát ra từ đầu ống mao quản. Các phân tử dung
môi từ từ bốc hơi, các hạt mang điện tích có thể tích nhỏ dần và do
sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu sẽ dần thành những hạt
mang điện nhỏ hơn. Các ion dương hoặc âm tạo thành được đưa
vào bộ phận tách ion qua một cửa r
ất nhỏ, dung môi và khí N
2
bị
bơm hút ra ngoài. Điện thế dương ở đầu kim tạo ion dương, điện
thế âm ở đầu kim tạo ion âm và được quyết định tùy theo chất khảo
sát. Các chất có tính acid tạo ion âm ở pH cao, các chất có tính baz

O
+
+ 2e
-
H
2
O + H
2
O
+
→ H
3
O
+
+
•
OH
M + H
3
O
+
→ MH
+
+ H
2
O
Cơ chế tạo ion âm: với những phân tử có H linh động, trong vùng
phóng điện, có sự ion hóa của phân tử bằng cách mất đi H+, phần
còn lại là một anion:


nhiều điện cực bao xung quanh, điện cực đầu cột ở trên và ở dưới.
Các ion sau khi đi vào bẫy ion được bẫy lại cho đến khi một điện áp
tần số radio (Rf) được áp lên trên điện cực vòng, các ion khác m/z
trở nên không ổn định và sẽ đi về hướng đầ
u dò. Do điện áp Rf
khác nhau trong hệ mà thu được một phổ khối lượng đầu đủ. Các
ion tồn tại trong bẫy có thể được chọn riêng và phân tích theo sự
khác nhau về m/z, đồng thời có thể thực hiện quá trình bắn phá để
- 19 -
thu được các mảnh con, từ đó phân tích theo m/z của ion con. Về
nguyên tắc các ion con có thể tồn tại trong bẫy thời gian đủ lâu để
thực hiện MS n lần, tuy nhiên thực tế chỉ có khả năng thực hiện
đến khối phổ 3 lần.
o Bộ phân tích thời gian bay (TOF-time of flight): dựa trên cơ sở gia
tốc các ion tới đầu dò với cùng một năng lượng. Do các ion có cùng
năng lượng nhưng khác nhau về khối lượng nên thờ
i gian đi tới đầu
dò sẽ khác nhau. Các ion nhỏ hơn sẽ đi nhanh hơn do có vận tốc
lớn hơn, các ion lớn sẽ đi chậm hơn. Thời gian bay tới đầu dò của
một ion phụ thuộc vào khối lượng, điện tích và năng lượng động
học của ion đó. Độ phân giải của bộ phân tích thời gian bay thấp
nhưng có thể phân tích không hạn chế khối lượng ion
•
Bộ phận phát hiện ion:
o Nguyên lý: tạo tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ
cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng điện do điện tích di
chuyển.
o Có 2 loại bộ phát hiện phổ biến: nhân electron và nhân quang điện
• Bộ phát hiện nhân electron: là đầu dò phổ biến, có độ nhạy cao.
Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron, các electron

xử lý số liệu
Khối phổ AB Sciex
TripleQuad 5500MS

- 21 -
Bộ phân tích khối: với tứ cực cong (Qurved LINAC Collision Cell)
buồng va chạm áp suất cao, tăng tốc ion xuyên qua buồng va chạm,
làm tăng tốc độ phân tích, loại bỏ hiệu quả phân tử không mang điện
nền, phù hợp với kỹ thuật UHPLC

Hình 1.12: Bộ phân tích khối của thiết bị Khối phổ AB Sciex TripleQuad
5500MS (với thiết kế mới Qurved LINAC Collision Cell)
*Một vài chế độ quét phổ sử dụng ở thiết bị Triple Quad
Chế độ quét phổ MRM-multiple reaction monitoring: Q1 chọn mảnh
ion mẹ [M+H]
+
, Q2 phân mảnh ion được chọn, Q3 giám sát một mảnh ion
con được chọn, chỉ ion con được chọn mới được phát hiện tại đầu dò. Độ
nhạy của chế độ quét MRM chính là khả năng bao nhiêu ion con được tạo
ra. Kỹ thuật này sẽ làm giảm nhiễu nền
Chế độ quét ion con-Product ion scanning: Q1 lựa chọn mảnh ion mẹ,
Q2 phân mảnh ion được chọn, Q3 bẫy và quét tất cả các ion con được phân
mảnh. Kỹ thuật này cho phép xác đị
nh các hợp chất có cùng thời gian rửa
giải.
- 22 -
1.7. Tiêu chuẩn để đánh giá khả năng sử dụng của phương pháp thử:

niệm tính chọn lọc thường mang tính khái quát hơn.
- Khoảng tuyến tính: là khoảng của đường thẳng thể hiện sự tương quan
tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích với tín hiệu của thiết bị được thể
hiện qua hệ s
ố tương quan gần bằng 1 (0.995 cho đa số các chất phân tích)
- 23 -
- Giới hạn phát hiện của phương pháp: là nồng độ chất phân tích thấp nhất
có trong mẫu mà phương pháp có khả năng phát hiện được với độ tin cậy
là 99% khác biệt so với mẫu trắng
- Giới hạn định lượng: là mức nồng độ mà phương pháp cho kết quả định
lượng với độ tinh cậy nhất định
- Độ chính xác: là sự gần đúng giữa giá tr
ị kết quả thử nghiệm và giá trị
chấp nhận (giá trị thực). Độ chính xác được xác định thông qua 2 thông
số: độ đúng (truenesss) và độ chụm
• Độ đúng: là sự gần đúng giữa giá trị trung bình của một loạt thí
nghiệm với giá trị thực. Độ đúng thường được biểu diễn thông qua
độ chệch (bias)
o Độ chệch (bias): là sự lệch giữa giá trị trung bình của k
ết
quả thí nghiệm so với giá trị thực
• Độ chụm: là sự gần nhau giữa các kết quả thử nghiệm độc lập thu
được dưới các điều kiện qui định. Độ chụm thường được tính bằng
độ lệch chuẩn của các kết quả kiểm nghiệm. Độ lệch chuẩn càng
lớn độ chụm càng kém.
• Độ lặp lại: là độ chụm đượ
c xác định dưới cùng điều kiện thí
nghiệm (cùng phòng thí nghiệm, cùng người thực hiện, cùng thiết
bị, …)
• Độ tái lặp trong phòng thí nghiệm: là độ chụm đươc thực hiện dưới

ứng của nền mẫu, hóa chất
và
m
ẫu kiểm soát)
< 30% tại LOQ
5
Độ thu hồi của phương
p
háp (%)-đơn cấu tử
80 - 120 RSDwr < 20%

Độ thu hồi của phương
p
háp (%)-đa cấu tử
60 - 140 RSDwr < 20%
6 Độ lặp lại_RSDwr (%) ≤ 20 Tại mỗi mức khảo sá
t
7
Độ tái lặp nội bộ PTN_
RSDwR (%)
≤ 20 Tại mỗi mức khảo sát
8 Giá trị mẫu trắng (blank)
< 30% giới hạn định
lượng công bố của
phương pháp thử
+ Autosampler SIL – 20AD XR
+ Degasser DGU – 20 A5
+ Interface CBM – 20A
+ Cột sắc ký phân tích: Inertsil ODS – 3V, 5 µm, 150 mm x 4,6 mm
- Đầu dò khối phổ 2 lần(MS/MS) AB Sciex TripleQuad 5500
Turbo V source: kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI)
2.1.3. Hoá chất, chất chuẩn
Chất chuẩn:
- Acrylamide 99.5%, hãng sản xuất Fluka, mã đặt hàng 01696, số lô
1254876

Trích đoạn Hoá chất, chất chuẩn Chất chuẩn: Khảo sát các thông số khối phổ: Xác định tính chọn lọc/đặc hiệu:

---