ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -1- GVHD: TS. Đặng Đức Long
LỜI MỞ ĐẦU
Probiotic là những vi sinh vật sống có ảnh hưởng tốt đến vật chủ bằng
cách giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Vi khuẩn probiotic giúp hoàn
thiện hệ tiêu hóa, giảm nhiều bệnh về tiêu hóa do vi khuẩn gây ra, giúp cải thiện
tình trạng không hấp thụ thức ăn…Đặc biệt vi khuẩn probiotic không gây hại
cho vật chủ.
Với sự phát triển của khoa học công nghệ cũng như trình độ dân trí ngày
càng được nâng cao nên probiotic đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực như thực phẩm, dược phẩm, chăn nuôi…Sử dụng probiotic trong dược
phẩm và chăn nuôi có thể hạn chế được việc sử dụng kháng sinh, giảm tác động
đến sức khỏe con người.
Trong số các vi sinh vật được dùng để sản xuất probiotic thì các vi khuẩn
lactic được sử dụng phổ biến như : Lactobacillus plantarum, Lactobacillus
casei, Lactobacillus acidophilus…Để phân lập và nuôi cấy vi khuẩn
Lactobacillus thì chế phẩm MRS vẫn được coi là môi trường chuẩn. Tuy nhiên
chế phẩm MRS rất đắt tiền làm cho sản phẩm vi khuẩn tạo thành có giá thành
cao và khó được áp dụng rộng rãi. Với mục đích tận dụng nguồn nguyên liệu
rẻ tiền để thay thế cho môi trường MRS trong sản xuất sinh khối Lactobacillus
plantarum chúng tôi chọn đề tài “ Nghiên cứu tối ưu môi trường thay thế rẻ
tiền nuôi Lactobacillus plantarum để phục vụ sản xuất chế phẩm probiotic”.
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -2- GVHD: TS. Đặng Đức Long
PHẦN 1:
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lịch sử của probiotic
Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cường sức khỏe con người không
phải là mới. Theo Ayurveda, một trong số ngành y học lâu đời nhất là vào
khoảng 2500 năm trước công nguyên, sự tiêu thụ sữa chua (một sản phẩm sữa
lên men) đã được ủng hộ để duy trì sức khỏe tốt. Các nhà khoa học đầu tiên,
như Hippocrates và những người khác cũng chỉ định sữa lên men với tính chất

phải là một chất bổ nhưng nó thật sự rất quan trọng. [7]
1.3. Cơ chế tác động của probiotic
 Tác động kháng khuẩn của probiotic
Sở dĩ các vi khuẩn probiotic có khả năng kháng khuẩn là do trong quá trình
trao đổi chất đã tạo ra các sản phẩm có tính kháng khuẩn như axit hữu cơ (axit
lactic và axit acetic), hydroperoxide, ethanol, diacetyl, acetaldehyde, CO
2
,
reuterin, bacteriocin Các sản phẩm trao đổi chất này chính là “vũ khí” kháng
khuẩn của probiotic. [8]
- Khả năng kháng khuẩn của các acid hữu cơ
Các acid hữu cơ được sinh ra bởi vi khuẩn lactic chủ yếu là acid lactic và
acid acetic, các acid này góp phần làm giảm pH tiêu diệt các vi khuẩn có hại
như E.coli, Clostridium perfringens, Staphilococcus aurius Do nội bào vi
khuẩn có pH=7 nên khi có sự chênh lệch pH so với môi trường acid bên ngoài,
H
+
từ môi trường sẽ đi vào bên trong tế bào vi khuẩn làm pH nội bào giảm. Vi
khuẩn phải sử dụng cơ chế bơm ATPase để đẩy H
+
ra khỏi tế bào làm cho vi
khuẩn mất năng lượng. Mặt khác pH giảm thì ức chế quá trình đường phân làm
cho tế bào vi khuẩn cạn kiệt năng lượng dẫn đến bị tiêu diệt. Ngoài ra, các
anion của acid còn gây rối loạn sự thẩm thấu của màng tế bào. Những nguyên
nhân này làm cho vi khuẩn bị chết. [8]
- Khả năng kháng khuẩn của probiotic nhờ tiết ra độc tố bacteriocin
Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein được ribosome tổng
hợp từ các chuỗi peptide hoặc protein ở cả vi khuẩn Gram (-) và Gram (+).
Bacteriocin có tác dụng kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây thối rữa và các
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT

tạm thời của hệ sinh thái đường ruột và giúp
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
Hình 1.2. Tác dụng của probiotic
lên vi khuẩn đường ruột
Hình 1.1. Tác động của probiotic lên hệ
miễn dịch
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -5- GVHD: TS. Đặng Đức Long
cho sự tiêu thụ thức ăn. Tuy nhiên, các lợi khuẩn này chỉ lưu trú tạm thời ở đây,
và khi thức ăn đã được tiêu thụ thì số lượng vi khuẩn probiotic sẽ giảm xuống.
Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật đường
ruột. Chúng có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa, do đó sẽ gây cản trở cho
hoạt động tiết ra enzyme của vi sinh vật đường ruột. Đồng thời tăng sự dung
nạp đường lactose, giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu
những loại thức ăn có chứa nhiều lactose và làm tăng vi khuẩn có lợi và giảm vi
khuẩn gây hại.
1.4. Chức năng của probiotic
 Thủy phân lactose, tăng sự hấp thụ lactose
Suốt quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh enzyme thủy phân lactose thành
glucose và galactose.
Các vi khuẩn đường ruột giúp chuyển hóa hầu hết lượng lactose không
được hấp thụ ở ruột non. [9]
 Làm giảm một số bệnh đường tiêu hóa:
- Bệnh ung loét
Bệnh ung loét trong hệ thống tiêu hóa (do vi khuẩn Helicobacter pylori gây
ra) có liên quan đến chế độ ăn uống hàng ngày do ít sử dụng các sản phẩm sữa
lên men và rau quả, sử dụng quá nhiều sữa, thịt, tinh bột.
Vi khuẩn lactic có thể ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh và
làm giảm hoạt tính của enzyme urease cần thiết cho các vi sinh vật gây bệnh
lưu trú trong môi trường acid của dạ dày. [9]
- Bệnh tiêu chảy do vi sinh vật

B (folic acid, niacin, riboflavin, B12, B6, acid pantothenic) và vitamin K.
Theo các nghiên cứu, L.Brevis có khả năng tổng hợp vitamin D và vitamin
K; B.longum tổng hợp vitamin B; B.bifidum và L.acidophillus tổng hợp được
các vitamin B như niacin, folic acid, biotin, B6 và vitamin K. [9]
 Giảm cholesterol
Vi khuẩn đường ruột chuyển cholesterol sang dạng khó hấp thu hơn
(coprostanol) do đó sẽ cản trở việc hấp thu cholesterol vào hệ thống ruột.
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -7- GVHD: TS. Đặng Đức Long
Theo các nhà nghiên cứu, các vi khuẩn probiotic khống chế làm cho
cholesterol khó hấp thu được vào máu thông qua các cơ chế chủ yếu sau:
- Hấp thụ một lượng cholesterol có mặt trong hệ thống ruột
- Tăng chuyển hóa cholesterol thành chất khác và giảm sự hấp thu của chất
này vào cơ thể.
- Giảm sự hấp thu cholesterol của ruột và tăng sự bài tiết của phân.
- Giới hạn sự biến đổi cholesterol thành acid mật cho gan dự trữ.
- Nếu hàm lượng chất béo cao trong các bữa ăn, gây ra sự tăng cholesterol,
việc sử dụng bổ sung các vi khuẩn có lợi này là một phương pháp giúp cân
bằng mức lipid và chất béo, giữ hệ thống tim mạch mạnh khỏe. [9]
 Ngăn chặn ung thư
- Kết hợp, ngăn chặn hoặc làm mất hoạt tính của các yếu tố gây ung thư.
- Giảm hoạt tính của các enzyme ở phân, là nơi khơi nguồn của các mầm
mống gây ung thư.
- Kích thích hệ thống miễn dịch, ngăn chặn sự tạo thành khối u.
- Các vi khuẩn có lợi có thể giảm các enzyme liên quan đến các tác nhân
gây ung thư (β-gulucoronidase, azoreductase, nitroreductase và β-glucosidase)
và do đó làm giảm nguy cơ gây ung thư ruột kết. [9]
1.5. Các chỉ tiêu để chọn một vi sinh vật làm Probiotic
 Về mặt sản xuất:
- Có thể phát triển nhanh chóng với số lượng lớn trong điều kiện lên men

- Khả năng tổng hợp hay sử dụng vitamine (Nhóm B, folate, vitamin K)
- Có khả năng ngăn chặn các mầm bệnh: Samonenella typhimurium,
Clostridium pefringens, Escherichia coli…
- Có khả năng tổng hợp acid, hydrogen peroxide, các bacteriocin
- Có thể sử dụng kết hợp với các vi sinh vật khác. [9]
 Tính an toàn
- Không gây độc, không ảnh hưởng xấu đến sức khỏe. [9]
1.6. Một số lĩnh vực ứng dụng của probiotic
 Trong dược phẩm
- Probiotic là những thực phẩm chức năng y tế, nâng cao chất
therapeutically sử dụng để ngăn ngừa tiêu chảy, cải thiện khả năng sử dụng
lactose và kháng khuẩn. Chúng cũng có tiềm năng để ngăn ngừa bệnh ung thư
và giảm cholesterol. Lactobacillus, Bifidobacterium và một số vi khuẩn có lợi
khác được đưa vào cơ thể và tạo ra hiệu quả bằng cách thay đổi thành phần của
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -9- GVHD: TS. Đặng Đức Long
hệ vi sinh vật đường ruột. Chế phẩm sinh học probiotic có khả năng chống
nhiễm trùng do vi khuẩn và vius, chống ung thư, kích thích hoạt động của hệ
miễn dịch, làm giảm cholesterol… [10]
- Ứng dụng của probiotic trong điều trị các chứng bệnh dạ dày, viêm ruột
kết (gọi chung là IBS): nguyên nhân của bệnh này là do hiện tượng không dung
nạp thức ăn, gây lên men và tạo ra các chất độc nhưng không có đủ các enzyme
để phân hủy hết các chất độc này và ảnh hưởng đến sức khỏe.
Theo điều tra nghiên cứu thì sự ổn định của hệ vi sinh vật đường ruột phụ
thuộc vào nhiều yếu tố như : acid dạ dày, nhu động ruột, muối mật, pH trong
môi trường ruột và sự cạnh tranh dinh dưỡng của giữa lợi khuẩn và hại khuẩn.
Thuốc kháng sinh có thể chữa được các bệnh do vi khuẩn gây ra. Nhưng người
ta đã chứng minh rằng kháng sinh làm ảnh hưởng đến sự cân bằng hệ vi sinh
vật đường ruột bằng cách ức chế quá trình trao đổi chất của cả lợi khuẩn và hại
khuẩn.

nhiên có tác động mạnh lên tế bào da, chúng kích thích và điều chỉnh tế bào da
tương tự như các probiotic đã thực hiện trên tế bào ruột.[13]
 Trong nuôi trồng thủy sản
Trong nuôi trồng thủy sản, probiotic còn là chế phẩm xử lý môi trường.
Thay cho mục đích chủ yếu là kích thích sự gia tăng của các vi sinh vật có lợi
trong ao nuôi
Một thành phần khác cũng được thấy trong chế phẩm probiotic đó là tập
hợp các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật như : amylase, protease, lipase , một
số vitamin thiết yếu hoặc acid amine và chất khoáng…nhằm kích thích hoạt
tính ban đầu của vi sinh vật trong chế phẩm và xúc tác cho sự hoạt động của
enzyme trong môi trường. Hiện nay, việc sử dụng chế phẩm sinh học là giải
pháp ưu việt nhất để có được năng suất, chất lượng, sự bền vững của thủy sản
nuôi. [14]
 Trong bảo vệ môi trường
Do có tác dụng tiêu diệt các vi sinh vật gây thối (sinh ra các loại khí như
H
2
S
,
SO
2
,NH
3…
) nên khi phun chế phẩm probiotic vào rác thải, cống rãnh,
chuồng trại chăn nuôi…sẽ khử mùi hôi một cách nhanh chóng. Đồng thời số
lượng ruồi, muỗi, ve,các loại côn trùng khác sẽ giảm số lượng đáng kể. [15]
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -11- GVHD: TS. Đặng Đức Long
1.7. Tình hình nghiên cứu các sản phẩm probiotic:
1.7.1. Những nghiên cứu ở nước ngoài

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -12- GVHD: TS. Đặng Đức Long
1.7.2. Những nghiên cứu trong nước
Các sản phẩm probiotic đã bắt đầu được người tiêu dùng biết đến trong thời
gian gần đây, tuy nhiên các sản phẩm này còn rất mới mẻ và nhất là các sản
phẩm sử dụng trong thực phẩm còn chưa được nghiên cứu nhiều, chủ yếu mới
được nghiên cứu trong chăn nuôi như:
Trần Quốc Việt của bộ môn dinh dưỡng và thức ăn chăn nuôi – Viện chăn
nuôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung probiotic vào khẩu phần đến
khả năng tiêu hóa thức ăn, tốc độ sinh trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và tỷ lệ
mắc bệnh tiêu chảy ở lợn con và lợn thịt. [24]
Viện công nghệ sinh học – Công nghệ dược phẩm của Đại Học Bách Khoa
Hà Nội đã nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu sử dụng phối hợp prebiotic và
probiotic trong thực phẩm chức năng”.[24]
Hiện nay trên thị trường đã có nhiều sản phẩm probiotic do Việt Nam sản
xuất như: sữa chua bổ sung probiotic, men vi sinh, chế phẩm chăn nuôi bổ sung
probiotic…
1.8. Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotic
Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ yếu
thuộc Lactobacillus và Bifidobacterum, ngoài ra Enterococcus và Streptococus
cũng được sử dụng ít hơn. Những vi khuẩn này thường cư trú trong ruột. [9]
Chủng
Lactobacillus
Chủng
Bifidobacterium
Các chủng vi
khuẩn lactic
khác
Các loài vi sinh
vật khác
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT

Sporolactobacill
us inulinus
Streptococus
thermophilus
Bacillus cereus
Escherichia coli
Propionibacteriu
m freudenreichii
Saccharomyces
cerevisiae
Saccharomyces
boulardii
Bảng 1.1.Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic ở người [9]

1.8.1.Chủng Bifidobacterium
Bifidobacterium có chủ yếu trong ruột kết của người và động vật, nhất là ở
trẻ mới sinh được nuôi bẳng sữa mẹ. Số lượng của chúng trong ruột kết khá ổn
định cho đến khi về già thì số lượng giảm đi.
Một số đặc tính chung của các loài thuộc Bifidobacterium:
- Gram (+), kỵ khí, không chuyển động, không sinh bào tử
- Có nhiều hình dạng: que cong ngắn, hình gậy, hình chữ Y.
- Sinh acid lacic, không tạo CO
2
trừ quá trình phân giải gluconate.
1.8.2. Các chủng vi khuẩn Lactic
 Đặc điểm chung
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -14- GVHD: TS. Đặng Đức Long
- Về mặt hình thái, vi khuẩn lactic có dạng lưỡng cầu, tứ cầu, lien cầu và
dạng que, đứng đơn lẻ hoặc tạo thành chuỗi.

Hình 1.3. Vi khuẩn
Lactobacillus plantarum
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -15- GVHD: TS. Đặng Đức Long
các acid dịch mật trong ruột non khi ăn uống, và có thể lưu trú trong đường tiêu
hóa bằng cách gắn vào niêm mạc ruột và đại tràng. Vì vậy có thể sử dụng nó để
điều trị bệnh viêm ruột kết, đầy hơi, khó tiêu. [16]
- Tính chất đặc trưng duy nhất của L. plantarum là khả năng dị hóa arginine
và sinh ra NO. L. plantarum không có khả năng phân giải amino acid nào ngoại
trừ tyrosine và arginine. Có đến 6 con đường chuyển hóa arginine khác nhau và
đều sinh ra NO. Việc sinh ra NO giúp ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh như
Candida abicans, E.coli, Shigella, Helicobacter pylory, các amip và kí sinh
trùng.
1.9.2.Vai trò của L.plantarum
- Bằng cách ngăn chặn sự bám dính của E.coli vào màng nhầy, L.plantarum
làm giảm độc tố do E.coli tiết ra.
- Lactobacillus plantarum làm giảm đáng kể vi sinh vật kị khí Gram (-),
Enterobacteriaceae, Clostridia.
- Nghiên cứu gần đây cho thấy L.plantarum có khả năng phân hủy acid mật
làm giảm cholesterol.[16]
1.9.3. Các hoạt tính của Lactobacillus plantarum
 Hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus plantarum
- Từ xa xưa con người đã biết ứng dụng lên men lactic để muối chua rau, củ,
quả. Quá trình lên men lactic chủ yếu là nhờ sự hoạt động của vi khuẩn sinh
acid lactic. Người ta đã phân lập các sản phẩm như nem chua, xúc xích, rau, củ,
quả muối chua điển hình là dưa chuột muối chua sau đó nuôi trên môi trường là
chế phẩm MRS và đã cho kết quả có sự hiện diện của vi khuẩn Lactobacillus
plantarum.
Đối với quá trình lên men chua thì các nguyên liệu tươi sống rất khó khử
trùng. Trong nghiên cứu này người ta đã chứng minh được rằng, chính vì có sự
cạnh tranh dinh dưỡng giữa vi khuẩn lactic với các hệ vi sinh vật tạp nhiễm. Do

Khả năng chịu acid của L.plantarum được kiểm tra bằng cách ủ vi khuẩn
trong môi trường chế phẩm MRS ở các giá trị pH từ 2 đến 6, điều chỉnh pH
bằng HCl. Sau đó, nuôi vi khuẩn ở 37
0
C trong 48h. Lượng vi khuẩn sống sót
được đánh giá bằng phương pháp đo OD ở bước sóng 600nm kết hợp đếm
khuẩn lạc.
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -17- GVHD: TS. Đặng Đức Long
Kết quả cho thấy, L.plantarum có thể sống sót trong môi trường có pH từ
2-3 nhưng đạt lượng sinh khối lớn nhất ở môi trường có pH 6,5.
Như vậy, L.plantarum đã được chứng minh là hội tụ đầy đủ ba hoạt tính
quan trọng của một vi sinh vật được dùng làm probiotic đó là: khả năng kháng
khuẩn, khả năng kháng dịch mật và khả năng chịu acid. Do đó, có thể kết luận
L.plantarum có hoạt tính probiotic. [20]
1.9.4. Ứng dụng của L.plantarum
- Nó quan trọng trong việc bảo vệ các chất chống vi sinh vật và chống lại
một cách hiệu quả các vi sinh vật gây bệnh nội bào và ngoại bào.
- L.plantarum có khả năng giúp tiêu hóa các chất xơ có trong củ hành, tỏi,
lúa mì, trứng, lúa mạch đen và trong men bia. Do đó chúng giúp đỡ những vấn
đề về tiêu hóa như đầy hơi, khó tiêu…
- Ngoài ra, L. plantarum còn có khả năng giảm nhất định một số triệu chứng
phụ trong quá trình điều trị bằng thuốc kháng sinh. [9]
- Gần đây L. plantarum đã được dùng để gắn kháng nguyên mảnh C của độc
tố uốn ván (đã làm mất độc tính) dùng làm vaccine chống uốn ván.
PHẦN 2:
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Quy trình thực hiện đề tài
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT

- Máy đo pH - Máy đo mật độ quang
- Lò vi sóng
Các thiết bị chính được trình bày ở phần phụ lục 1
2.2.3. Môi trường nuôi cấy
Môi trường dinh dưỡng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động
sống và hoạt tính của vi sinh vật. Vì vậy, để đảm bảo những yêu cầu tối thiểu
cho sự sinh trưởng cũng như hoạt tính của vi sinh vật thì trong thành phần môi
trường cần có các nguyên tố như carbon, nito, hidro, oxy, các chất vô cơ như
canxi, phospho, lưu huỳnh, sắt và các nguyên tố vi lượng. [1]
- Môi trường nhân giống cấp 1: là môi trường MRS (do Deman và cộng sự
tìm ra năm 1960) dạng chế phẩm có thành phần như sau: [28]
Pepton từ Casein 10g/l Cao thịt bò 10g/l
Cao nấm men 5g/l Glucose 20g/l
Natri – acetate 5g/l Tween 80 1ml/l
Diamon citrate 2g/l MgSO
4
.7 H
2
O 0,2g/l
MgSO
4
0,2g/l Agar 2%
- Môi trường thử nghiệm dùng để nhân sinh khối: gồm 3 môi trường như
trong bảng 2.1 dưới đây
Bảng 2.1. Thành phần của 3 môi trường thử nghiệm [2]
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -20- GVHD: TS. Đặng Đức Long
Do môi trường dinh dưỡng dùng để nuôi cấy vi sinh vật có chứa hàm lượng
chất dinh dưỡng cao, thích hợp cho nhiều loài vi sinh vật sinh trưởng và phát
triển. Vì vậy để đảm bảo cho môi trường nuôi cấy chỉ chứa loài vi sinh vật

2
HPO
4
1g/l Cao nấm men 10g/l
MgSO
4
0,5g/l MgSO
4
0,5g/l
Cao nấm men 5g/l
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -21- GVHD: TS. Đặng Đức Long
Để đồng nhất lượng giống khi cấy vào các môi trường thì giống được nuôi
trên đĩa petri không phù hợp. Do đó, phải tiến hành cấy chuyển vi khuẩn từ đĩa
petri sang dạng lỏng trong bình tam giác. [2]
Dùng que cấy lấy khoảng hai khuẩn lạc to, rõ nhất ở đĩa petri vừa hoạt hóa
rồi khuấy vào bình tam giác chứa 100ml môi trường MRS vô trùng. Sau đó
nuôi cấy ở 30
0
C trong 48h.
2.3.2. Phương pháp xác định mật độ tế bào
2.3.2.1.Phương pháp trải đĩa đếm khuẩn lạc
Phương pháp đếm khuẩn lạc là phương pháp cho phép xác định số lượng vi
sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân
chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Trong phương pháp này cần
thực hiện pha loãng thập phân sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích
hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn
để hạn chế sai số khi đếm và tính toán. Các thao tác được thực hiện trong điều
kiện vô trùng. [3]
2.3.2.2. Phương pháp đo mật độ quang
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa theo định luật Lambert-Beer, độ

0
C,
200vòng/phút
Bước 2: Xác định mật độ tế bào trong từng môi trường
- Để xác định mật độ tế bào trong các môi trường, sử dụng phương pháp đo
mật độ quang. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa theo định luật
Lambert-Beer, các môi trường nghiên cứu có nồng độ sinh khối vi khuẩn khác
nhau sẽ cho giá trị OD khác nhau ở cùng bước sóng 600nm.
Dựa vào kết quả OD thu nhận được ở các thời điểm khác nhau của cùng một
loài vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng có thể xây dựng được đường cong
sinh trưởng. Từ đó biết được mức độ sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật
trong các môi trường thử nghiệm, đồng thời có thể khảo sát sự ảnh hưởng của
yếu tố thời gian đến sự sinh trưởng và phát triển của L.plantarum
Bước 3: Xây dựng đường cong sinh trưởng của L.plantarum trong từng môi
trường
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -23- GVHD: TS. Đặng Đức Long
- Để xây dựng đường cong sinh trưởng của L.plantarum trong từng môi
trường, tiến hành lấy mẫu và đo OD tại các mốc thời gian nuôi cấy khác nhau,
các mốc thời gian cách nhau 12 tiếng đồng hồ.
Bước 4: So sánh kết quả và chọn ra môi trường tốt nhất trong 3 môi trường
trên
- Sau khi đã xây dựng được đường cong sinh trưởng của L.plantarum trong
3 môi trường thử nghiệm, so sánh mức độ sinh trưởng của nó trong từng môi
trường để tìm ra môi trường tốt nhất trong 3 môi trường thử nghiệm.
2.3.3. Phương pháp tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
Sau khi chọn ra môi trường dinh dưỡng tốt nhất trong 3 môi trường thử
nghiệm, tiến hành tối ưu hóa môi trường bằng phương pháp “Quy hoạch thực
nghiệm” và tìm điều kiện tối ưu bằng cách sử dụng phần mềm Excel Solve.Với
mục đích là thu sinh khối vi khuẩn L.plantarum, do đó hàm mục tiêu là sinh

- Về đặc tính bề mặt: bề mặt lồi, trơn nhẵn, không nhăn
- Không sinh bào tử.
3.2. Quan sát hình thái vi khuẩn L.plantarum dưới kính hiển vi
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -25- GVHD: TS. Đặng Đức Long
Làm tiêu bản để quan sát L.plantarum, vi khuẩn được nhuộm màu với xanh
metylen.
Dưới kính hiển vi, có thể quan sát được hình thái vi khuẩn L.plantarum có
dạng hình que, không di động.
3.3.Kết quả cấy chuyển vi khuẩn sang môi trường lỏng
Nhận xét: Do L.plantarum là loài vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, có thể sống trong
điều kiện có hoặc không có oxi. Nên trong quá trình nuôi cấy lắc vừa được cung
cấp oxi và tác động lắc của thiết bị, vi khuẩn phân bố đều trong môi trường. Sau
48h nuôi cấy lắc, giống được bảo quản ở tủ lạnh 4
0
C lúc này vừa thiếu oxi vừa
không có lực lắc nên sinh khối vi khuẩn lắng xuống đáy bình.
3.4. Kết quả khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của Lactobacillus
plantarum trên các môi trường thử nghiệm
SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT
Hình 3.2. Hình thái vi khuẩn L.plantarum quan sát dưới kính hiển vi
Hình 3.3. Cấy chuyển L.plantarum từ môi trường MRS trên
đĩa thạch sang môi trường MRS lỏng