ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
Phụ lục
PHẦN 1 GIỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP PCR
1.1 Khái niệm
PCR (Polymerase Chain Reaction) là phương pháp invitro để tổng hợp và khuếch
đại một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi oligonucleotide gắn vào 2 sợi đôi
của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase.
1.2 Lịch sử phát triển
1.2.1 Lịch sử ra đời phương pháp PCR
Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis và cộng sự phát minh năm
1985, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này.
1
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ

Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần
một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase. DNA
polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực hiện chức năng nhân DNA
khi tế bào phân chia. Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA và tạo sợi bổ sung. Theo
quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực hiện trong
ống nghiệm (in vitro). Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở 96°C. Tuy
nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy vì vậy cần bổ sung enzyme sau mỗi
giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quả
cao vì nó mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục lưu
ý suốt trong quá trình PCR.
Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymerase lấy từ
vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên 110°C.
DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao) và khi dùng
trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA. Từ đó,
không cần phải thêm DNA-polymerase vào mỗi chu kỳ, quá trình sao chép DNA có thể
đơn giản và tự động hơn.
Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ

hiệu hơn. Cho đến nay, đã có hàng chục loại polymerase chịu nhiệt đã được phát hiện
và tổng hợp ra. Có những men polymerase trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt như
Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus thermophilus (rTth), Thermus lithoralis
(Vent), Pyrococcus furiosus (Pfu),. Có những men polymerase chịu nhiệt được tổng
hợp từ các vi khuẩn không chịu nhiệt nhưng mang gen tái tổ hợp từ các vi khuẩn chịu
nhiệt như Ampli Taq, Vent (exo),. Có những men polymerase chịu nhiệt có hoạt tính
sửa sai (proofreading) khi tổng hợp chuỗi nucleic acid bổ sung (3’-5’exonuclease) như
Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu,. Nhờ vậy mà người dùng có rất nhiều chọn lựa để sử
dụng cho đúng mục đích của mình.
3
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ

Thermus aquaticus Thermus thermophiles
b, Máy chu kỳ nhiệt

Máy PCR
Trước đây, khi chưa có máy chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR được thực hiện bằng
cách liên tục chuyển các ống nghiệm phản ứng PCR vào các máy cách thủy có nhiệt độ
khác nhau để tạo ra được các chu kỳ nhiệt cho phản ứng. Sau đó công việc bằng tay
nhàm chán và nặng nhọc này được thay thế bằng các robot tương đối cồng kềnh và đắt
tiền. Ngày nay, thử nghiệm PCR được thực hiện trong các buồng ủ PCR của máy chu
kỳ nhiệt, còn gọi là máy luân nhiệt. Một cách tổng quát, máy luân nhiệt gồm các bộ
phận chính như sau:
• Một bàn phím đơn giản để lập các chương trình chu kỳ nhiệt và ra các mệnh
lệnh để máy thực hiện.
• Một bộ vi xử lý để ghi nhớ các chương trình đã nạp vào máy, thực hiện các
mệnh lệnh đến buồng ủ PCR, cũng như ghi nhận cách thay đổi nhiệt độ buồng ủ
PCR trong các chu kỳ nhiệt để điều chỉnh cho đúng với chương trình đang được
thực hiện.
• Buồng ủ PCR là nơi mà các chu kỳ nhiệt được thực hiện qua sự điều khiển của

Một phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu
kỳ gồm ba giai đoạn: Giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp và giai đoạn kéo dài chuỗi.
Giai đoạn biến tính (denaturation): Tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành dạng mạch
đơn.
Phân tử DNA sợi đôi được hình thành bởi mối liên kết hydro giữa hai mạch đơn. Trong
quá trình biến tính, nhiệt độ phản ứng gia tăng lên nhanh chóng đến 95oC và giữ ở
nhiệt độ này trong khoảng 15-50 giây. Ở nhiệt độ này mối liên kết hydro giữa hai mạch
5
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
đơn của phân tử DNA sợi đôi bị phá vỡ. Trong giai đoạn bắt cặp tiếp theo, nhiệt độ
phản ứng giảm nhanh chóng làm cho mối liên kết hydro ban đầu không hình thành lại
được kết quả làm tạo thành hai phân tử DNA mạch đơn.
Tuy nhiên, việc tăng nhiệt độ đột ngột hoặc thời gian biến tính kéo dài có thể làm giảm hoạt
tính của enzyme DNA polymerase. Đối với những enzyme DNA polymerase được sử dụng
trong phản ứng PCR, nhiệt đô ở giai đoạn biến tính thường từ 95
0
C đến 98
0
C. Về thời gian
biến tính, đối với các genome lớn như thực vật thường giai đoạn biến tính được kéo dài trong
5 phút. Ngoài ra, sau khi đã tối ưu phản ứng PCR, để giảm sự ảnh hướng của nhiệt độ và thời
gian biến tính đối với sự hoạt động của enzyme DNA polymerase, enzyme này có thể được bổ
sung sau khi kết thúc giai đoạn biến tính ban đầu. Đối với mỗi hệ thống luân nhiệt của các
hang sản xuất khác nhau, tốc độ gia nhiệt và chế độ điều khiển nhiệt độ là khác nhau.
Giai đoạn bắt cặp (anealation): Gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung.
Trong giai đoạn bắt cặp, nhiệt độ lai thường duy trì khoảng 50- 600C, trong thời
gian 15-60 giây. Quá trình này giúp cho các mồi (primer) tìm kiếm và bắt cặp bổ sung
đặc hiệu với trình tự đích (DNA hoặc cDNA) tại vị trí mong muốn. Nhiệt độ bắt cặp
phụ thuộc vào số lượng G, C có trong mồi (primer).
Đối với primer dài hơn 22 nucleotide, nhiệt độ bắt mồi thường hoạt động ở Tm thấp

1.4.1 Mồi
Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu
quả cao. Việc lựa chọn mồi tuân theo các quy tắc đơn giản sau: chiều dài mồi khoảng 18 -
24bp hoặc hơn và phần trăm GC chiếm 35%-60%, do vậy, nhiệt độ gắn mồi vào khoảng
55-58
0
C hoặc cao hơn. Những mồi dài hơn (mồi DMD, 28-30bp) cho phép phản ứng được
thực hiện ở nhiệt độ gắn mồi cao hơn và thu được ít sản phẩm không đặc hiệu hơn. Để
kiểm tra các trình tự có khả năng lặp lại, các mồi sử dụng đã được đối chiếu với cơ sở dữ
liệu trình tự tại Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học (National Center for
Biotechnology Information - NCBI) sử dụng các công cụ tìm kiếm (Basic Local
Alignment Search Tool - BLAST).
1.4.2 DNA mẫu
Kết quả phản ứng PCR lệ thuộc rất lớn vào DNA mẫu.
• Phản ứng PCR tối ưu khi DNA thật tinh sạch. Bụi bẩn sẽ làm giảm đáng kể hiệu
suất của phản ứng. Tuy nhiên nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết
quả đối với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào hoặc ngay cả mẫu DNA
không được bảo quản tốt
• Phản ứng PCR tối ưu cũng lệ thuộc vào lượng bản mẫu. Lượng DNA mẫu sử
dụng cũng có khuynh hướng giảm (1µg xuống còn 100ng) khi sử dụng các
DNA polymerase cho hiệu quả cao. Việc giảm lượng mẫu còn hạn chế được sự
khuếch đại ký sinh tạo những sản phẩm phụ không mong muốn.
8
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
1.4.3 Enzyme
Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I. Ðây là
enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp. Hiện nay, một số
enzyme mới có hiệu quả hơn.
DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vi khuẩn hiện diện trong suối
nước nóng, Thermus aquaticus. Enzyme này được viết tắt Taq polymerase.

1.4.6 Chu kỳ của phản ứng PCR
Trong thực tế, số lượng chu kỳ của phản ứng PCR không vượt quá 40 chu kỳ do
hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng,
sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa được tổng hợp không
kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau.
1.4.7 Biến tính
• Việc tăng nhiệt độ hoặc thời gian kéo dài thời gian biến tính có thể làm tăng tính
đặc hiệu của PCR nhưng làm giảm tuổi thọ của enzyme DNA polymerase.
• Đối với những enzyme DNA polymerase bền nhiệt thường nên sử dụng nhiệt độ
biến tính 95ºC-98ºC. Bao gồm bước biến tính dài lúc khởi đầu và một bước biến
tính ngắn trước từng chu kỳ nhiệt.
• Đối với từng genome lớn như thực vật thường sử dụng bước biến tính dài đến
5min. Để làm giảm ảnh hưởng đối với enzyme thì có thể bổ sung enzyme DNA
polymerase sau khi biến tính ban đầu.
• Khi đã tối ưu phản ứng PCR thì cần giảm tối thiểu thời gian biến tính mỗi chu
kỳ để tăng lượng sản phẩm. Thông thường là từ 10s-30s.
• Tốc độ gia nhiệt và chế độ điều khiển nhiệt độ ở mỗi hệ thống luân nhiệt là khác
nhau phụ thuộc hãng sản xuất. Một số hệ thống cho phép thay đổi thông số này
khi PCR tối ưu.
1.5 Giải pháp tối ưu hóa cho phản ứng PCR
Do PCR rất nhạy, nên phải tránh ô nhiễm các DNA khác có trong phòng thí
nghiệm (vi khuẩn, virus, DNA , ). Vì vậy các mẫu DNA, hỗn hợp phản ứng và quy
trình DNA, ngoài ra còn có phản ứng phân tích sản phẩm, nên được thực hiện trong
một khu vực riêng biệt. Ở giai đoạn chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, phải chuẩn bị phòng
riêng biệt với đèn UV. Phải sử dụng găng tay sạch cho mỗi bước PCR cũng như thay
thế các pipet. Thuốc thử dùng trong PCR phải được chuẩn bị riêng biệt và chỉ được
dùng cho mục đích này. Các mẫu phải được giữ riêng biệt với các mẫu DNA khác.
Phản ứng có kiểm soát (kiểm soát bên trong), ngoại trừ DNA khuôn mẫu, phải luôn
được htực hiện, để kiểm tra sự nhiễm bẩn.
Các giải pháp cụ thể:

11
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
Băng sản phẩm phụ rõ nét với kích thước thấp hơn sản phẩm mong muốn:
1. Tăng nhiệt độ bắt mồi 2°C và/hoặc tăng thời gian bắt mồi
2. Tăng thời gian kéo dài thêm 30s.
3. Giảm nồng độ DNA polymerase.
4. Tối ưu hóa nồng độ Mg
2+
.
5. Tinh sạch DNA template bằng thôi gel. Hoặc thủy phân DNA bằng một số RE
trước khi dùng làm template (hiệu quả khi băng sản phẩm phụ kích thước khá
lớn >= 1kb).
6. Giảm nồng độ primer.
7. Thiết kế cặp primer mới.
1.6 Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật PCR
1.6.1 Ưu điểm
• Thời gian thực hiện cực nhanh: chỉ cần mất 3h để khuếch đại một trình tự AND
được quan tâm, so với phương pháp tao dòng của kỹ thuật tái tổ hợp AND phải
mất cả tuần hoặc lâu hơn.
• Đơn giản và ít tốn kém: nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm
các thành phần tối thiểu được sử dụng đồng thời. Trong khi đó phương pháp tạo
dòng điển hình cần các vật liệu đắt tiền như: màng, nucleotide triphosphate
mang dấu phóng xạ và việc thực hiện cần các thao tác đặc biệt.
• Độ tinh sạch của mẫu không cần cao: PCR có thể thực hiện các mẫu nucleic
acid thô. Ví dụ: mẫu này hay các dấu vết phân tích trong pháp y.
• Điều nay ngược với kĩ thuật tái tổ hợp ADN, đoạn gen hay vector đều cần tương
đối tinh khiết.
• PCR có thể giúp phân biệt được gen đột biến do mất đoạn, thêm đọa hay đột
biến điểm.
• Dùng để định lượng so sánh bằng cách cho tiến hành khuếch đại đòng thời trình

phát hiện PCR.
e. Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết, do vậy có thể dẫn
đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết.
f. Chi phí cho việc phát hiện các vi sinh vật đơn lẻ trong thực phẩm thường tốn kém.
Do vậy để giảm chi phí người ta thường sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứng
PCR (gọi là phản ứng Multiplex PCR) để có thể phát hiện đồng thời nhiều vi sinh vật
khác nhau.
13
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
1.7 Ứng dụng của PCR
• Sử dụng PCR để tạo nhanh các gen tổng hợp.
• Tạo dòng cDNA.
• Gây đột biến điểm.
• Xác định kiểu gen của các đột biến.
• So sánh mức độ biểu hiện của gen.
• Vân tay di truyền.
• Kiểm tra huyết thống.
• Ưng dụng trong chẩn đoán lâm sàng.

PHẦN 2 ỨNG DỤNG CỦA PCR TRONG KỸ THUẬT DGGE
1.Khái niệm DGGE
Kỹ thuật điện di biến tính gradient trên gel (denaturing gradient gel
electrophoresis, DGGE) một dạng kỹ thuật ”dấu vân tay” (fingerprinting) phân tử cho
phép phân biệt các trình tự DNA khác nhau dựa trên sự khác nhau về tỷ lệ (G+C)/
(A+T) giữa các trình tự. Khi được điện di trên một gel có građien chất biến tính, tùy
14
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
theo thành phần nucleotit mà một phân tử DNA sẽ dừng lại ở một vị trí nhất định đặc
trưng: trong phân tử càng nhiều G và C thì phân tử càng lâu bị biến tính và do đó càng
lâu dừng lại trên gel điện di. Vì vậy, vị trí khác nhau trên điện di đồ DGGE phản ánh

khử halogen các hợp chất hữu cơ chứa halogen khó phân hủy trong đó có dioxin. Điều
kiện của quá trình khử loại halogen nói chung và Clo nói riêng được thực hiện trong
môi trường hoạt động của vi khuẩn kị khí như: vi khuẩn khử sắt, khử sunfat, vi khuẩn
sinh methan. Từ các nghiên cứu đã được công bố, chúng tôi đã thống kê được một số
loại có khả năng loại Clo trong điều kiện kị khí: dehalobacter,
desulfomonile,desulfitobacterium, dehalococcoides.
Phân hủy hiếu khí DD và DBF diễn theo hai cơ chế oxi hóa vị trí bên và vị trí góc
của nhân thơm, trong đó oxi hóa vị trí đầu tiên là ở vị trí góc được thực hiện bởi enzim
dioxygenaza, quá trình này chuyển hóa thành DD và DBF.
Ở việt nam, công nghệ chôn lấp tích cực là tổ hợp của phương pháp cô lập hấp
phụ và phân hủy sinh học đã được nghiên cứu và đang được triển khai khử độc ‛điểm
nóng’ nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Tuy nhiên để nâng cao hiệu quả khử độc của quy trình
công nghệ và áp dụng rộng rãi ở các ‛điểm nóng’ khác cần có thêm hiểu biết sâu về đa
dạng, khả năng phân hủy sinh học và các gen tham gia quá trình phân hủy các chất độc
bởi tập đoàn vi sinh vật bản địa.
Để tìm hiểu vai trò của vi sinh vật trong điều kiện chôn lấp tích cực mà ở đó môi
trường chủ yếu là kị khí và kị khí không bắt buộc, cần tiến hành nuôi cấy tập đoàn vi
sinh vật kị khí ở điều kiện vẫn có ít oxy trong môi trường. Khả năng phân hủy các chất
độc đặc biệt là 2, 3, 7, 8 – TCDD của các vi sinh vật bản địa đã được xác định thông
qua hỗn hợp chủng vi khuẩn kị khí không bắt buộc SETDN20. Ở đây sẽ trình bày kết
quả nghiên cứu khả năng phát triển cũng như khả năng phân hủy của vi sinh vật trên
môi trường chứa dịch chiết đất (chứa 2, 3, 7, 8 – TCDD) đồng thời nghiên cứu sự đa
dạng của hỗn hợp chủng. Sự phát triển gen chức năng dioxin dioxygenaza trong hỗn
hợp chủng vi khuẩn kị khí không bắt buộc SETDN20 cũng đã được công bố trong bài
báo này.
2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
16
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
2.1 Nguyên liệu
 Hỗn hợp chủng SETDN20 được phân lập bằng phương pháp làm giàu nhiều lần từ

 Mẫu cho shock nhiệt 3 lần trong nito lỏng và bể nhiệt 65ºC.
17
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
 Bổ sung 100µl proteinase K vào ống mẫu và ủ ở 37ºC trong nửa giờ.
 Bổ sung 1,5 ml SDS 20% vào tất cả các mẫu, lắc đều và ủ ở 65ºC trong 2 giờ. Ly
tâm 6000 rpm trong 10 phút thu dịch bên trên. Phần tủa còn lại, bổ sung tiếp 4,5 ml
đệm tách và 0,5 ml SDS 20 %, tiếp tục ủ ở 65ºC thêm 10 phút.
 Lặp lại quá trình ly tâm như trên để thu dịch.
 Phần dung dịch chứa DNA thu được sau hai lần ly tâm đó được làm sạch với
chloroform / isoamyl alcohol (24 : 1).
 Kết tủa DNA bằng isopropanol, rửa sạch bằng ethanol 70 % và hòa tan trở lại bằng
100 µl dung dịch TE 10 mM.
 Thu nhận được dung dịch DNA rồi tiếp tục làm sạch bằng phenol, đem kết tủa và
hòa tan trở lại bằng 50 µl dung dịch TE 10 mM.
d. PCR và nhân dòng đọc trình tự
 Nhân đoạn gen 16S ARN ribosom có độ dài khoảng 550bp bằng kỹ thuật PCR sử
dụng cặp mồi 907R, 341F kẹp GC với nhiệt độ gắn mồi là 65ºC.
 Nhân đoạn gen mã hóa cho enzyme dioxin – dioxygenaza có độ dài khoảng 700 bp
bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi DF, DR với thể tích là 25 µl, thành phần phản
ứng gồm 2,5 µl PCR buffer 10x, 4 mM MgCl2, 0,25 mM hỗn hợp dNTPs, 20 pM
mỗi loại mồi DF và DR, 1 đơn vị Taq AND polymeraza, nhiệt độ gắn mồi là 50ºC.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agaroza nồng độ 0,8 %, sau đó gắn trực tiếp
vào vector PCR
R
2.1 nhờ biến nạp vào chủng E.coli INV F' và chọn lọc trên môi
trường LB đặc có chứa 100 mg/l ampixillin, nuôi cấy ở 37ºC qua đêm.
e. Phương pháp điện di gel gradient biến tính (DGGE) để xác định mứa độ đa dạng của
vi sinh vật trong tập đoàn
Sau khi thu được PCR đảm bảo chất lượng, tiếp tục sử dụng phương pháp điện di
gel biến tính, nồng độ của gel là 6 % với dải biến tính từ 20 – 70 % để nghiên cứu sự

1,2,3,4,6,7,8,9 OCDD 0,89 0,737
PCDFs
2,3,7,8 TCDF 8,433 7,313
1,2,3,7,8 PeCDF 0,040 0,037
2,3,4,7,8 PeCDF 0,923 0,744
1,2,3,4,7,8 HxCDF 0,098 0,082
1,2,3,6,7,8 HxCDF 0,036 0
1,2,3,7,8,9 HxCDF 0 0
2,3,4,6,7,8 HxCDF 0,031 0,038
1,2,3,4,6,7,8 HpCDF 0,038 0,031
1,2,3,4,7,8,9 HpCDD 0 0
1,2,3,4,6,7,8,9 OCDF 0,002 0,001
Tổng số độc 4299,243 3528,742
Phần trăm phân hủy 0 17,9%

Bảng 1.Khả năng sử dụng các đồng phân PCCDs và PCDFs của hỗn hợp vi khuẩn
SETDN20
Hỗn hợp chủng SETDN20 sau 60 ngày nuôi cấy trên môi trường xử lý có bổ sung
dịch chiết đất đã loại bỏ 17,9% tổng độ độc, trong đó 2,3,7,8-TCCD giảm từ 4299,243
pg TEQ/ml xuống còn 3528,742pg TEQ/ml.
So với một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy dioxin hiếu khí như
Streptomyces danangiensis XKDN19 có khả năng phân hủy 85,97% lượng 2,3,7,8-
TCDD sau 14 ngày với hàm lượng ban đầu 333pg/ml thì khả năng phân hủy của hỗn
hợp chủng SETDN20 thấp hơn nhiều.Tuy nhiên do dioxin hòa tan trong nước rất thấp,
nó tích tụ nhiều trong các trầm tích thiếu oxy, vì vậy phân hủy dioxin ở điều kiện
20
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
không phải hiếu khí cũng rất có ý nghĩa.
Các kết quả nghiên cứu khả năng xử dụng dioxin cho thấy, SETDN20 thuộc vi
sinh vật sử dụng nguồn chất độc này như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất. Như

xác định gen mã hóa cho enzyme dioxin dioxygenaza trong hỗn hợp chủng SETDN20.
ADN tổng số của hỗn hợp chủng SETDN20 sau khi tách chiết và làm sạch được dung
làm khuôn cho phản ứng nhân đoạn gen mã hóa dioxin dioxygenaza với cặp mồi DF và
DR như đã nêu ở trên phần phương pháp.
Hình 3. Điện di đồ sản phẩm PCR của gien mã hóa cho enzim dioxin deogienaza ở
SETDN20 MK. Marker phân tử 1kb; giếng 1. sản phẩm PCR lần 1; giếng 2. sản phẩm
PCR lần 2.
Sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng hơn 700 bp và khá đặc hiệu (hình
3,giếng 1, 2). Sau đó, sản phẩm PCR này được gắn vào vector PCR 2.1 và biến nạp vào
tế bào E.coli INV F’. Sản phẩm này được kiểm tra bằng enzyme giới hạn EcoRI. Kết
quả đã chỉ ra rằng, một băng ADN có kích thước khoảng 700 bp đã được phát hiện. Để
khẳng định rõ hơn điều này AND plasmit có mang đoạn gen 16S ARN Ribosom có
kích thước khoảng 700 bp (sản phẩm PCR) đã được sử dụng làm khuôn và chạy lại
PCR ở cùng điều kiện phản ứng như lần đầu. Kết quả vẫn chỉ được một đoạn ADN
(sản phẩm PCR) có kích thước như ban đầu khoảng 700 bp (hình 3, giếng 2).
22
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
ADN plasmit có mang sản phẩm PCR như mong muốn đã được tách và làm sạch
lượng lớn phục vụ cho đọc trình tự. Trình tự gen dioxin dioxygenaza của SETDN20
được xác định tren máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyse,
sử dụng bô Kit Bibdye Terminator V3.1 Cycle Sequencing. Kết quả đã nhận được một
đoạn trình tự nucleotit khoảng hơn 700 bp rõ ràng. Trình tự đoạn gen này đã được đưa
vào khung đọc mở (ORE) để dịch mã ra trình tự axit amin. Trình tự axit amin này đã
được so sánh với các trình tự axit amin trong ngân hàng Protein thế giới EMBL. Kết
quả cho thấy enzyme phenylpropionate dioxygenaza (99%). Điều đó chứng tỏ, trong
hỗn hợp vi khuẩn SEDTN20 đã có mang nhóm gen mã hóa cho các enzyme dioxin
dioxygenaza mà chúng tôi rất quan tâm trong công nghệ tẩy độc dioxin.
4. KẾT LUẬN
1. Hỗn hợp chủng SETDN20 có thể bao gồm 3 loài khác nhau và có khả năng phát
triển thêm nguồn chiết dịch đất với hàm lượng cao trong điều kiện kị khí bắt buộc.

nhiểm chất diệt có chưa dioxin tại sân bay Đà Nẵng.
24
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
1. MỞ ĐẦU
Trong khoảng 10 năm từ 1961 đến 1971 quân đội Mỹ đã rải khoảng 80 triệu lit
các chất diệt cỏ có chứa dioxin xuống nhiều vùng ở miền Trung và miền Nam Việt
Nam.Căn cứ quân sự cũ của Mỹ ở sân bay Đà Nẵng là một trong các điểm nóng hiện
nay vẫn bị ô nhiễm nặng các chất diệt cỏ chứa dioxin. Một kết quả phân tích gần đây
cho thấy không những đất mà cả bùn hồ tiếp nhận nước chảy từ bãi nhiễm đã chứa
dioxin ở các nồng độ khác nhau. Vi khuẩn kị khí tùy tiện và vi khuẩn kị khí bắt buộc
trong đó có vi khuẩn khử sunfate (KFS) đóng vai trò rất quan trọng trong phân hủy tự
nhiên hoặc làm sạch bằng phân hủy sinh học trầm tích bị ô nhiễm.
Tuy nhiên, phân lập vi khuẩn KSF từ các mẫu môi trường đôi khi không dễ dàng.
Hiện nay , các phương pháp dựa trên nuôi cấy thường chỉ xác định được một phần nhỏ
tập đoàn vi khuẩn ngoài tự nhiên. Các phương pháp không phụ thuộc nuôi cấy khác
nhau trong đó có PCR kết hợp với điện di trên gel chứa dải nồng độ biế tính thích hợp
(PCR-DGGE) đã được sử dụng rộng rã trong nghiên cứu đa dạng vi sinh vật. Trong
nghiên cứu này kỹ thuật PCR-DGGE đã sử dụng để đánh giá sợ bộ vi khuẩn KSF trong
mẫu bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Đà Nẵng.
2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Mẫu bùn hồ
Mười ba mẫu bùn được lấy từ ba hồ A, B, C. Hai mẫu B1 và B2 được lấy ở hồ B
và mẫu C1 được lấy ở hồ C ở thời điểm 3/2007. Đây là 2 hồ không nhận trực tiếp
nguồn nước chảy từ các bãi nhiểm nặng chất diệt cỏ chưa dioxin ở khu vực sân bay Đà
Nẵng. Hồ A là hồ tiếp nhận trực tiếp nguồn nước từ khu vực bãi nhiểm. Năm mẫu bùn
A1-A5 ở hồ A được lấy ở thời điểm 1/2007 và năm mẫu A6-A10 được lấy ở thời điểm
3/2007. Nồng độ dioxin trong một số mẫu lấy ở hồ B và C không cao, tuy nhiên ở hồ A
khoảng 10.000ppt.
2.2 Xác định tập đoàn vi khuẩn KSF bằng kĩ thuật PCR-DGGE
a, Tách chiết và làm sạch DNA