Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

THI NGUYÊN - 2011

1

TCH DÕNG V THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ
HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG CHU
CỦA ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill] Chuyên ngà nh: Di truyề n họ c
M s: 62.42.70
Hc viên: Bnh Th Mai Anh
Ngườ i hướ ng dẫ n: PGS.TS. Chu Hoà ng Hà

THI NGUYÊN - 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

i

MC LC
Trang
Lờ i cam đoan

Lờ i cả m ơn

Mc lc
i
Danh mụ c chƣ̃ viế t tắ t
iv
Danh mụ c bảng
vi
Danh mụ c hình
vii
MỞ ĐẦU……………………………………………………………………………
1
I. Đt vấn đ
1
II. Mc tiêu nghiên cứu………………………………………………………
2
III. Nộ i dung nghiên cƣ́ u…………………………………………………………
2

24
2.2. PHƢƠNG PHP NGHIÊN CỨU
25
2.2.1. Phƣơng pháp sinh học phân tử
25
2.2.1.1. Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA…………………………
25
2.2.1.2. Phương pháp tổng hợp cDNA………………………………………………
26
2.2.1.3. Phản ứng PCR ……………………………………
27
2.2.1.4. Phương pháp tách dòng gen………………………………………………
27
2.2.1.5. Thiết kế cấu trúc pBI101:: rd29A :: DREB3……………………………….
29
2.2.2. Phƣơng phá p tá i sinh và chuyển gen thông qua Agrobacterium
30
2.2.2.1. Phương phá p chuyể n gen vào cây đu tương thông qua Agrobacterium
30
2.2.2.2. Phương phá p chuyể n gen và o cây thuốc lá thông qua Agrobacterium
32
2.2.3. Phƣơng phá p phân tí ch cây chuyể n gen
33
2.2.3.1. Phương phá p PCR
33
2.2.3.2. Phương phá p gây hạ n nhân tạ o
33
2.2.4. Phƣơng pháp tính toán và xử lý s liệu
33
2.2.5. Phƣơng phá p xƣ̉ lý trình tƣ̣ gen và amino acid

TƢƠNG……………………………………………………………………………
52
3.4.1. Kết quả chuyển cấu trúc promoter rd29A vào đậu tƣơng……………………
52
3.4.2. Kết quả phân tch cây đậu tƣơng chuyển gen bng k thuật PCR……
55
KẾ T LUẬ N VÀ ĐỀ NGHỊ …………………………………………………
56
DANH MỤ C CÔNG TRÌ NH LIÊN QUAN ĐẾ N LUẬ N VĂN…………………
57
TI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………
58
PH LC…………………………………………………………………………
iv

DANH MC CHỮ CI VIẾT TẮT
ABA
Abscisic acid
ABR
ABA/stress responsive
ABRE
ABA responsive element
AP2/EREBP
APETALA2/Ethylene Response Elements Binding Proteins

E. coli
Escherichia coli
GA
3

Gibberellic acid
GM
Germination medium – môi trƣờng nảy mầm hạt

v

Gus
β –Glucuronidase gene (Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase)
IBA
Indole-3-butyric acid
IPTG
Isopropylthio-beta-D-galactoside
Kb
kilo base
LB
Luria Bertani
LEA
Late embryogenesis abundant
MAP kinase
Mitogen-activated protein kinases
MES
2-[N-morpholino] ethanesulfonic acid
MS
Môi trƣờng muối cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)
NSL


DANH MỤ C BẢ NG

Trang
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ năm 2003 đến 2010…
6
Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm tách chiết……………………………
25
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR…………………………………….
27
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng……………….
27
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng colony – PCR……………………………….
28
Bảng 2.5. Thành phần hoá chất tách plasmid………………………………….
29
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt bằ ng enzyme BamHI, SacI
29
Bảng 2.7. Môi trƣờ ng nuôi cấ y đậ u tƣơng…………………………………….
31
Bảng 2.8. Môi trƣờ ng nuôi cấ y thuố c lá ……………………………………….
32
Bảng 3.1. Sƣ̣ sai khá c về trình tƣ̣ nucleotide và amino acid củ a 3 trình tự gen
DREB3 thu đƣợ c vớ i gen GmDREB3 mã số DQ055133………………………

38
Bảng 3.2. Tỷ lệ số ng só t của của các mảnh thuốc lá biến nạp qua các giai
đoạn chọ n lọ c

48

Hnh 3.4. Điệ n di sả n phẩ m cắ t kiể m tra plamid bằ ng enzyme BamHI …………
36
Hnh 3.5. Kế t quả so sánh trình tự nucleotide …………………………………
37
Hnh 3.6. Kế t quả phân tích trình tƣ̣ amino acid củ a protein DREB3 …………
39
Hnh 3.7. Kế t quả phân tí ch trình tƣ̣ amino acid suy diễ n cá c gen họ AP 2/ERF
trên phầ n mề m Clustal W ………………………………………………………

40
Hnh 3.8. Phân tích cây phả hệ cá c gen họ AP2/ERF sƣ̉ dụ ng phầ n mề m Cobalt
41
Hnh 3.9. Mô hình mô tả cá c bƣớ c thiế t kế vector chuyể n gen …………………
42
Hnh 3.10. Kế t quả điệ n di sả n phẩ m PCR vớ i cặ p mồ i DREB3-BamHI/DREB3-
SacI ………………………………………………………………………………

43
Hnh 3.11. Kế t quả điệ n di sả n phẩ m phả n ƣ́ ng cắ t pBI::rd29A::gus bằ ng BamHI
và SacI

44
Hnh 3.12. Hình ảnh điện di sản phm colony-PCR vớ i cặ p mồ i đặ c hiệ u ……
45
Hnh 3.13. Hình ảnh điện di sản phm cắt kiểm tra plasmid ……………………
46
Hnh 3.14. Kế t quả điệ n di sả n phẩ m colony-PCR vớ i cặ p mồ i đặ c hiệ u ………
47
Hnh 3.15. Các giai đoạn phát triển của mảnh thuốc lá biến nạp …………………
49

mặ n là hai trong số nhƣ̃ ng nhân tố quan trọ ng nhấ t kì m hã m sƣ̣ phá t triể n sản xuất nông
nghiệ p. Những năm gần đây, thế giới cũng nhƣ Việt Nam thƣờng xuyên phải gánh chịu
những biến động lớn; sự gia tăng nhiệt độ trái đất, hạn hán, lũ lt, xói mòn, thoái hóa đất
gây ảnh hƣởng không nhỏ tới năng suất, sản lƣợng, chất lƣợng cây trng.
Đậu tƣơng là cây chịu hạn kém [3], [10], khi thiếu nƣớc ở các thời kỳ khác đu có
ảnh hƣởng xấu đến năng suất. Nhƣ vậy, việc chn và tạo đƣợc các giống đậu tƣơng có
khả năng chống chịu hạn là một nhu cầu cần thiết trong sản xuất và đƣợc xem nhƣ định
hƣớng nghiên cứu phát triển cây đậu tƣơng ở Việt Nam.
Cách tiếp cậ n hƣớ ng nghiên cƣ́ u về stress thƣ̣ c vậ t hiệ n nay đang tậ p trung và o
phân lậ p và nghiên cƣ́ u đặ c tính mộ t tậ p hợ p gen liên quan đế n tá c độ ng bấ t lợ i củ a môi
trƣờ ng và mố i liên hệ vớ i cá c stress mặ n , hạn và nhiệt độ . Hàng trăm gen đƣợ c cả m ƣ́ ng
trong cá c điề u kiệ n bấ t lợ i khá c nhau và sả n phẩ m củ a cá c gen cả m ƣ́ ng vớ i điề u kiệ n bấ t
lợ i đƣợ c chia là m hai nhó m : (1) nhóm các protein giúp thực vật chống lại bất lợi của môi
trƣờ ng; (2) nhóm các prot ein là m nhiệ m vụ điề u hò a biể u hiệ n gen và truyề n tín hiệ u

2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

trong quá trình đá p ƣ́ ng điề u kiệ n bấ t lợ i , nhóm này chnh là cá c nhân tố phiên mã . Gầ n
đây, dƣ̣ a trên nhƣ̃ ng thà nh tƣ̣ u củ a chƣơng trình nghiên cƣ́ u chƣ́ c năng hệ gen thƣ̣ c vậ t
cùng với sự phát triển các k thuật microarray , proteomic…, các nhà khoa hc đã phát
hiệ n và chƣ́ ng minh vai trò quan trọ ng củ a cá c nhó m gen điề u khiể n (Transcription factor,
Kinase) trong việ c tăng cƣờ ng tí nh chịu hạ n ở th ực vậ t . Nhóm gen điu khiển mc dù
không tham gia trƣ̣ c tiế p và o phả n ƣ́ ng đá p ƣ́ ng vớ i điề u kiệ n hạ n củ a thƣ̣ c vậ t , nhƣng sƣ̣
biể u hiệ n củ a chú ng lạ i có vai trò kí ch hoạ t sƣ̣ biể u hiệ n củ a rấ t nhiề u gen chƣ́ c năng khá c
tham gia và o quá trình đá p ƣ́ ng hạ n, dẫ n tớ i là m tăng cƣờ ng khả năng chịu hạ n ở thƣ̣ c vậ t.
Phát hiện này đã mở ra một hƣớng nghiên cứu mới cho lnh vực chn giống chuyển gen ở
thƣ̣ c vậ t, đó là chỉ chuyể n mộ t hay và i gen điề u khiể n, thay vì và i trăm gen chƣ́ c năng và o
cây để tăng cƣờ ng tí nh chố ng chịu củ a cây trồ ng [8].
Xuất phát từ nhƣ̃ ng cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đ tài: “Tách dng và thiế t kế

Philippin, Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam,… vài thế kỷ sau đó. Đậu tƣơng đƣợc trng ở châu
Âu vào thế kỷ 17 và ở Hoa Kỳ thế kỷ 18. Và ngày nay, Hoa Kỳ là quốc gia sản xuất đậu
tƣơng hàng đầu thế giới, chiếm 50% sản lƣợng trên toàn thế giới, tiếp theo là các nƣớc
Trung Quốc, Ấn Độ…[41]
Cây đậu tƣơng thuộc bộ Phaseoleae, h Đậu Fabaceae, h ph cánh bƣớm
Papilionoideae, chi Glycine. Đậu tƣơng có tên khoa hc là Glycine Max (L) Merr. Có
nhiu hệ thống phân loại khác nhau, trong đó hệ thống phân loại căn cứ vào đc điểm
hình thái, sự phân bố địa lý và số lƣợng nhiễm sắc thể do Hymowit và Newell (1984) xây
dựng đƣợc công nhận rộng rãi. Theo cách phân loại này thì ngoài chi Glycine còn có chi
ph Soja. Chi Glycine đƣợc chia thành 7 loài hoang dại lâu năm, chi Soja gm 2 loài
trong đó có loài đậu tƣơng trng Glycine Max (L) Merr [3].
1.1.2. Đc điểm sinh học của cây đậu tƣơng
Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merril) là cây hai lá mầm, thân thảo. Thân cây có
nhiu lông nhỏ, khi còn non thân có màu xanh hoc tm, khi v già chuyển màu nâu nhạt.
Màu sắc của thân cây cho ta biết màu của hoa sau này. Nếu thân có màu xanh, hoa sẽ có
màu trắng, nếu thân có màu tm thì sau hoa sẽ có màu tm đỏ. Chiu cao của thân từ 0,3 –
1m tùy theo giống. Khác với những cây trng khác thân cây đậu tƣơng phát triển mạnh
nhất lại chnh vào lúc cây ra hoa rộ nhất. Đây là lúc mà giai đoạn sinh trƣởng sinh dƣỡng

4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

và sinh trƣởng sinh thực cạnh tranh nhau dn đến khủng hoảng dinh dƣỡng. Vì vậy, trng trt
cần chú ý cung cấp đầy đủ dinh dƣỡng cho cây trƣớc khi chúng bƣớc vào giai đoạn này [3].
Cây đậu tƣơng có ba loại lá: lá mầm, lá đơn, lá kép. Mỗi lá kép thƣờng có 3 lá chét.
Lá kép mc so le, trên phiến lá có nhiu lông tơ. Hình dạng của lá thay đổi theo giống,
những giống có lá dài và nhỏ chịu hạn tốt nhƣng cho năng suất thấp. Những giống lá to
thƣờng cho năng suất cao hơn nhƣng cũng chịu hạn kém hơn [3].
Hoa đậu tƣơng đƣợc phát sinh từ nách lá, đầu cành hoc đầu thân. Hoa đậu tƣơng
mc thành chùm, mỗi chùm thƣờng có từ 3-5 hoa. Hoa lƣỡng tnh nên đậu tƣơng là cây tự

trị có trong hạt đậu khiến nó trở thành một trong những loại thực phm quan trng nhất
trên thế giới. Hàm lƣợng protein trong đậu tƣơng cao hơn trong cá, thịt và cao gấp 2 lần
các loại đậu đỗ khác, protein trong hạt đậu chiếm khoảng 35-50% (ph thuộc vào giống
và điu kiện chăm sóc), dễ tiêu hóa hơn thịt và không có thành phần tạo cholesterol. Đậu
tƣơng còn đƣợc xem là cây cung cấp dầu thực vật quan trng, lipid đậu tƣơng chứa thành
phần các acid béo không no cao, tổng số chất béo chiếm khoảng 18%. Ngoài ra trong hạt
đậu còn chứa sắt, canxi, phospho và các thành phần chất xơ tốt cho tiêu hóa. Vitamin
trong đậu tƣơng có nhiu nhóm B, đáng kể là vitamin B1, B2, B6, ngoài ra còn có vitamin
E, pholic acid. Thành phần có trong đậu tƣơng đƣợc nhắc tới nhiu và giúp ch cho sức
khỏe con ngƣời gm có phytosterol, lecithin, isoflavon và phytoestogen và những sản
phm ức chế phân hủy protein [3].
Giá trị về mt nông nghiệp: toàn bộ cây đậu tƣơng cả khi tƣơi và khô đu có thể
dùng làm thức ăn cho gia súc, sản phm ph công nghiệp nhƣ khô dầu có thành phần dinh
dƣỡng khá cao: N 6,2%; P
2
O
5
0,7%; K
2
O 2,4% là ngun thức ăn rất tốt cho gia súc. Một
kilogram hạt đậu tƣơng tƣơng đƣơng với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi. Đậu tƣơng còn
có vai trò quan trng trong cải tạo đất trng. Một hecta đậu tƣơng nếu sinh trƣởng và phát
triển tốt sẽ để lại trong đất 30-60kg N. Thân, lá với hàm lƣợng đạm cao có thể dùng để
bón cho đất thay cho phân hữu cơ. Việc luân canh đậu tƣơng với cây trng khác có thể
xem là biện pháp cải tạo đất trng hữu hiệu [3].
6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

183,8
204,1
185,6
187,4
192,1
146,2
197,8
Năng suất (tạ/ha)
13,3
13,3
14,3
13,9
14,7
14,0
14,6
15,0
Sản lƣợng (1000 tấn)
219,7
245,9
292,7
258,1
275,2
267,6
213,6
296,9
(Nguồn: Tổng cục thống kê, 2011)
V diện tch , đậu tƣơng đƣợ c gieo trng trên diệ n tí ch chỉ chiếm 1 tỉ lệ rất thấp
khoảng 1,5-1,6 %, xét v tốc độ thì diện tch gieo trng vn tăng qua các năm. Năm 1980,
diện tch trng đậu tƣơng là 48,8 nghìn ha, nhƣ vậy tnh đến năm 2010, diện tch đã tăng


sinh trƣở ng và phá t triể n , tƣ̀ nả y mầ m đế n ra hoa , tạo hạt cũng nhƣ chất lƣợng hạt đƣợc
tạo thành [23], [29].

8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Tác đng của hạn đến hệ r : Đậu tƣơng thƣờng xuyên chịu đựng s ự thiếu nƣớc
lớ n. Thƣ̣ c vậ t nó i chung , đậ u tƣơng nó i riêng có thể thích ƣ́ ng bằ ng cá ch phá t triể n rễ
chnh dài hơn, hệ thố ng lông rễ lớ n có thể tìm nƣớ c ở cá c lớ p đấ t phía dƣớ i ẩ m hơn và hú t
dinh dƣỡ ng nhƣ phospho. Mộ t trong cá c yế u tố chính ả nh hƣở ng đế n độ sâu củ a hệ rễ đậ u
tƣơng là tỉ lệ ké o dà i rễ . Rễ cá i là dạ ng rễ đầ u củ a đậ u tƣơng, xác định kiểu hình của rễ cái
dƣớ i điề u kiệ n không stress có thể cho phé p xá c định khả năng đâm sâu củ a rễ . Kaspar và
cs đã lấ y ra 105 kiể u hình khá c nhau củ a đậ u tƣơng tƣ̀ cá c nhó m có tí nh trƣở ng thà nh
khác nhau. Độ dài của rễ cái trong mỗi nhóm trƣởng thành biến thiên vào khoảng 1,3 cm
d
-1
. Các kết quả trên cho thấ y nhó m cá c giố ng có tỉ lệ ké o dà i rễ nhanh hơn thƣờ ng có thể
hút nƣớc trong đất ở sâu 120 cm dƣớ i bề mặ t . Dƣớ i điề u kiệ n hạ n , số lƣợ ng rễ mớ i /mộ t
đơn vị chiề u dà i rễ cá i tăng lên đá ng kể , nhƣng không tăng chiề u dà i h ay đƣờ ng kính rễ
cái. Bở i vì , sƣ̣ sinh trƣở ng rễ và sƣ̣ phân phố i nƣớ c là quyế t đị nh để duy trì chƣ́ c năng
trong cá c điề u kiệ n môi trƣờ ng khá c nhau , đặ c tính mề m dẻ o củ a rễ là yế u tố quyế t định
khả năng tìm đƣợc các ngu n nƣớ c. Stress nƣớ c hƣớ ng tớ i sƣ̣ gia tăng phân chia khố i
lƣợ ng hợ p chấ t sinh họ c đế n rễ , gia tăng tỉ lệ rễ : thân. Các cây không đƣợ c tƣớ i nƣớ c cho
thấ y sƣ̣ gia tăng kích thƣớ c rễ khi so sá nh vớ i cây đƣợ c tƣớ i nƣớ c, xuấ t hiệ n tƣơng quan
đặ c trƣng giƣ̃ a sƣ́ c chịu đƣ̣ ng hạ n vớ i cá c đặ c điể m đa dạ ng củ a rễ nhƣ khố i lƣợ ng khô ,
kch thƣớc toàn bộ hệ rễ , khố i lƣợ ng và số lƣợ ng rễ phụ [23]. Phân tch proteomic của rễ
cây đậ u tƣơng xƣ̉ lý hạ n, phát hiện 35 protein đƣợ c tạ o ra và có nhiề u thay đổ i quan trọ ng
ở vùng rễ bị stress mất nƣớc khi so sánh với điu kiện bình thƣờng . Số lƣợ ng của mộ t số
protein gia tăng , nhƣ là ferritin, trong khu vƣ̣ c ké o dà i củ a rễ bị xƣ̉ lý stress , có vai trò
quan trọ ng bả o vệ tế bà o chố ng lạ i cá c dạ ng oxy hoạ t hoá . Thông tin tƣ̀ proteomic đã cho

điề u kiệ n chiế u sá ng cao. Độ dày lông tơ lá là đc điểm thch ứng quan trng cho cây đậu
tƣơng dƣớ i điề u kiệ n hạ n . Lông tơ dà y đặ c đƣợ c tăng cƣờ ng sƣ́ c sinh trƣở ng , rễ dà y đặ c
hơn và mở rộ ng xuố ng sâu hơn . Sƣ̣ gia tăng độ dà y lông tơ lá có thể là m tăng lớ p ranh
giớ i chố ng lạ i stress lên hơn 50%, giảm nhiệt độ của lá , hạn chế thoát hơi nƣớc và tăng
cƣờ ng quá trình quang hợ p. Hơn nƣ̃ a, sƣ̣ gia tăng độ dà y lông tơ có thể là m giả m đi đá ng
kể phạ m vi ả nh hƣở ng bệ nh khả m virus củ a đậ u tƣơng [29].
Tác đng củ a hạ n đế n đặ c điể m sinh lý củ a t hân: Mộ t trong nhƣ̃ ng đặ c điể m
sinh lý liên quan đế n thân có thể tá c độ ng đế n khả năng chịu hạ n là sƣ̣ suy giả m lƣợ ng
nƣớ c sƣ̉ dụ ng trong toà n bộ cơ thể thƣ̣ c vậ t khi đấ t bị thiế u nƣớ c . Khi sƣ̣ mấ t nƣớ c ở đấ t
gia tăng, thƣ̣ c vật phải chịu đựng một thời kỳ chuyển tiếp từ trạng thái bão hòa nƣớc , khi

10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

mà lƣợng nƣớc toàn bộ cơ thể thực vật sử dng không ph thuộc vào lƣợng nƣớc trong
đấ t; sang trạ ng thá i thƣ́ hai khi mà nƣớ c sƣ̉ dụ ng liên quan tr ực tiếp tới lƣợng nƣớc dùng
đƣợ c trong đấ t . Việ c chuyể n trạ ng thá i nà y đƣợ c kế t hợ p vớ i sƣ̣ giả m chỉ số dẫ n truyề n
trung bình ở khí khổ ng, và có thể xảy ra ph thuộc lƣợ ng nƣớ c trong đấ t khá c nhau, trong
nhiề u loà i khá c nhau. Tnh dn truyn của kh khổng tác động quan trng đến sự thay đổi
sƣ̣ trao đổ i khí củ a lá và thoá t hơi nƣớ c . Các tác động của hạn đến sinh trƣởng của lá , sƣ̣
dẫ n truyề n củ a khí khổ ng và mố i quan hệ vớ i lƣợ ng n ƣớc trong cây đã đƣợc nghiên cứu
trong cây đậ u tƣơng . Nó cho thấy rng hạn làm giảm tƣơng đối tỉ lệ mở rộng của lá , sƣ̣
dẫ n truyề n củ a khí khổ ng và sƣ́ c căng củ a lá , trong khi đó nó tăng cƣờ ng lƣợ ng abscisis
acid trong lá và mạch xylem. Sƣ̣ giả m tí nh dẫ n củ a khí khổ ng xả y ra đồ ng thờ i vớ i sƣ̣ gia
tăng abscisis acid trong xylem và xả y ra trƣớ c bấ t cƣ́ sƣ̣ thay đổ i quan trọ ng nà o về sƣ́ c
căng củ a lá , nó chỉ ra rng các dấu hiệu hóa hc (abscisis acid - nguồ n gố c tƣ̀ rễ ) điề u
khiể n hoạ t độ ng khí khổ ng ở trạ ng thá i mấ t nƣớ c vƣ̀ a phả i [9], [29].
Tác đng của hạn đến áp suất thẩm thấu : Khả năng điu chỉnh áp suất thm
thấu có mối liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nƣớc của tế bào rễ cây đối với
đất. Trong điu kiện hạn, áp suất thm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu đƣợc các phân

các protein hoạt tnh sinh hc (Shinozaki và Yamaguchi-Shinozaki, 2007). Các cơ chế
bảo vệ tham gia vào quá trình này là khá giống nhau trong giới thực vật. Do đó, nghiên
cứu sử dng cây mô hình, nhƣ A.thaliana và thuốc lá (Nicotiana tabacum), có thể giúp
xác định những gen có chức năng quan trng trong cơ chế bảo vệ trong các loài thực vật
khác. Các gen mã hóa protein tham gia và o phả n ƣ́ ng củ a thƣ̣ c vậ t vớ i cá c tá c nhân stress đƣợ c
phân thà nh hai nhóm dựa vào chức năng của các sản phm mà chúng mã hóa [8], [19], [25].
(1) Nhóm protein chức năng tham gia trực tiếp đáp ứng điu kiện hạn , bảo vệ các
đạ i phân tƣ̉ và mà ng (protein LEA, osmotin, protein chố ng đông , chaperonin và protein
liên kế t mRNA…) và duy trì nƣớc tự do qua màng (protein kênh vậ n chuyể n nƣớ c và cá c
kênh xuyên mà ng…), các enzyme xúc tác các quá trình sinh tổng hợp các chất thm thấu
(proline, betain và đƣờ ng ) và các enzyme khƣ̉ độ c cho phé p cá c hoạ t độ ng sinh lý trong
tế bà o hay sƣ̣ chuyể n hó a sinh họ c duy trì mƣ́ c bình thƣờ ng (glutathinone S-transferase,
epoxide hydrolase hò a tan, catalase, superoxide và ascorbic peroxidase…) [16], [25]. Khả
năng chố ng chịu vớ i hạ n hay mặ n có thể đƣợ c tăng cƣờ ng bằ ng cá ch chuyể n gen mã hó a
protein LEA, protein trong tổ ng hợ p hoặ c tổ ng hợ p betain…[25].

12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

(2) Nhóm protein điu khiển sự biểu hiện của các gen chức năng liên quan đến tnh
chịu hạn , các nhân tố phiên mã bá m và o trình tƣ̣ DNA đặ c hiệ u trên vù ng khở i độ ng
(promoter) của các gen chức năng tham gia vào tnh chịu hạn và hoạt hóa sự biểu hiện của
các gen này và kết quả là tăng cƣờng tnh chịu hạn của thực v ật. Các nghiên cứu v gen
đã chƣ́ ng minh vù ng khở i độ ng củ a nhiề u gen chƣ́ c năng chƣ́ a mộ t hoặ c nhiề u trình tƣ̣
DNA đặ c hiệ u là điể m bá m củ a mộ t nhân tố phiên mã . Điề u nà y chƣ́ ng tỏ mộ t nhân tố
phiên mã có thể hoạ t hó a biể u hiệ n củ a nhiề u gen chƣ́ c năng . Các nghiên cứu biểu hiện
gen đã chƣ́ ng minh nhiề u nhân tố phiên mã biể u hiệ n mạ nh trong điề u kiệ n hạ n , chƣ́ ng tỏ
nhóm protein này đóng vai trò quan trng trong cơ chế điu hòa và biểu hiện của các gen
tăng cƣờ ng tính khá ng hạ n ở thƣ̣ c vậ t [8]. Sản phm gen thuộc nhóm hai bao gm các yếu
tố phiên mã (bZIP, MYC, MYB và DREB… ); protein kinase (MAP kinase và CDP

thƣ̣ c vậ t, phản ứng lại điu kiện bị tổn thƣơng và tác nhân gây hại tấn công [9]. Hệ gen
Arabidopsis có t nhất 100 gen họ NAC, và hệ gen lúa có 75 gen đã đƣợ c phân lậ p nhƣng
chỉ một số t gen trong số này đƣợc nghiên cứu chức năng [34], ở đậu tƣơng cũng có hơn
100 gen NAC đƣợ c tìm thấ y trong hệ gen [30]. Phầ n lớ n protein củ a cá c gen trong họ
NAC có chƣ́ a mộ t vù ng liên kế t DNA ở tậ n cù ng đầ u N có độ bả o thủ cao, mộ t trình tƣ̣ tín
hiệ u định vị nhân và mộ t vù ng tậ n cù ng đầ u C biế n đổ i.
Nhm nhân t DREB: trình tự đc hiệu của nhóm nhân tố DREB1/CRT có trình tự
li là A /GCCGAC lầ n đầ u tiên đƣợ c phá t hiệ n nằ m trong vù ng điề u khiể n gen rd29 ở
Arabidopsis và sau này đƣợc phát hiện trên rất nhiu vùng điu khiển gen của các gen
biể u hiệ n trong điề u kiệ n hạ n và l ạnh khác. Các gen điu khiển quá trình phiên mã thuộc
nhóm AP2 (APETALA2)/ethylene – responsive element-binding factor (ERF) bám vào
trình tự DRE và đƣợc đt tên là : DREB1/CBF và DREB2 [19]. AP2/ERF là mộ t họ lớ n
bao gồ m cá c yế u t ố phiên mã quan trng . Các protein AP 2 của Arabidopsis đƣợ c chia
thành 5 nhóm dựa vào sự giống nhau trong vùng gắn DNA của chúng : h AP2 (14 gen),
h RAV (liên quan tớ i ABI3/VP1) (6 gen), h DREB (55 gen; nhóm A), h ERF (65 gen,
nhóm B), và các gen khác (4 gen), mộ t gen rấ t đặ c biệ t AL079349 [14], [15], [16], [18]. Ở
đậ u tƣơng cũ ng có 5 nhóm gen tƣơng tự , hiệ n nay có hơn 380 gen AP2/ERF đƣợ c phá t
hiệ n ở hệ gen đậ u tƣơng [30]. Các protein h AP 2 chƣ́ a đƣ̣ ng hai vùng AP2/ERF, và các
gen trong họ nà y tham gia điề u tiế t cá c quá trình phá t triể n . H protein RAV chứa một

14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

vùng AP2/ERF và mộ t vù ng B3, cái mà khác với các chức năng sinh hc và liên quan đến
các loại khác của quá trình ph iên mã . Trong thƣ̣ c tế , các thành viên h RAV liên quan
phản ứng lại ethylene , brassinosteroid, và các stress môi trƣờng và sinh hc . Đối lập với
các thành viên h AP 2 và RAV, các protein h DREB/CBF và ERF chỉ chƣ́ a mộ t vù ng
AP2/ERF. Hệ gen Arabidopsis mã hóa 145 protein liên quan DREB/CBF. Các gen của h
DREB/CBF giƣ̃ vai trò quyế t định trong sƣ̣ chố ng lạ i stress vô sinh ở thƣ̣ c vậ t bằ ng cá ch
nhậ n ra nhân tố phả n ƣ́ ng lạ i sƣ̣ mấ t nƣớ c và lạ nh (DRE/CRT) vớ i mô hì nh trung tâm