Tách dòng và thit k vector biu hin gen mã
hóa cho th th neurokinin-1  i Vit Nam Lê Hng Thu

i hc Khoa hc T nhiên
Luchuyên ngành: Sinh hc thc nghim; Mã s: 60 42 30
ng dn: PGS. TS. Võ Th 
o v: 2012 Abstract: Tng quan v G protein; h tachykinin  ng vt có vú; th th h tachykinin
và th th neurokinin-1; ng dng ca th th neurokinin-u tr bnh; vector
biu hin gen mã hóa cho th th neurokinin-1. Trình bày nguyên li
nghiên cu: Tách RNA tng s; phn c; phn ng PCR (Polymerase
Chain Reaction); Tinh sch DAN b n DNA
vào vector; k thut bin np; sàng lc khun l    t ct s dng
enzyme gii hn; ký thun di; phân tích trình t cDnA ca cDNA-t
qu và tho lun: Tách dòng gen mã hóa cho th th neurokinin-1 t phi; thit k
vector biu hin gen mã hóa cho th th neurokinin-1.

Keywords: Sinh hc thc nghim; Gen mã hóa; i Vit Nam; Th th
neurokinin-1; Cu trúc protein Content
M U
Th th neurokinin  1 thuc nhóm các th th xuyên màng liên kt vi G protein. Khi th th
 i cu t gc hiu SP s dn truyn cn t vùng thn kinh
ngoi vi v n kinh, gây ra trng thái lo âu và các triu chng ging trm cm, mt

  ng v     c phân lp t  ng vt không
ng [15, 45].


                 

 


ha                

 
ptide

1.3 THỤ THỂ HỌ TACHYKININ VÀ THỤ THỂ NEUROKININ-1
1.3.1. Giới thiệu chung về thụ thể họ tachykinin
Th th ca h tachykinin (TACR) thuc lp A trong h th th liên kt vi G protein (Hình 1).
  th rhodopsin, TACR có cu trúc gc ni
vi nhau bi các vòng phía ngoài và phía trong màng sinh cht (exoloop và cytoloop). Nhng
vòng  phía ngoài màng t bào ca th th liên kt vi G protein có cha chn cu t
gc hiu trong khi các vùng xuyên màng có ch nh hot tính ca th th.
i ta phân loi TACR da vào s sai khác trong các trình t này [45].
1.4 ỨNG DỤNG CỦA THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH
T nhng hiu bit v cha th th neurokinin 1 ha h ng hiu
qu u tr mt s c
nhiên khi nhic phm ln tp trung nghiên cu v th th tachykinin nhm tìm ra các
chi vn c ng du tr bnh: làm thuc ging lo âu, trm
cm, cha các bng hô h phát hin ra các chi vn vi th th 
mt mt xích quan trng trong viu tr trong via chng bun nôn
và s nôn ma do tác dng ca hóa tr lin nay các nghiên cu v chi vn



cDNA
-NK1
-NK1
Tách -NK1
-NK1
Hình 5  nghiên cu tách dòng và thit k vector biu hin cDNA mã hóa cho
th th neurokinin  1  phi Vit Nam.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 TỪ PHỔI NGƢỜI

RNA tng s t mu phc tách chit bng kit AccuPrep® Viral RNA Extraction Kit
c tng hp nh phn c s dng RNA tng s và
mi hexamer. Thành phu kin ca phn ng tng hc trình bày trong Bng
9.
Bảng 9: Thành phu kin phn ng tng hp cDNA ca gen neurokinin-1
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện



Hình 6:   khu-NK1 ca gen mã hóa cho neurokinin-1
 khu-NK1, chúng tôi s dc tng hp t phn ng phiên
 làm khuôn cho phn ng PCR vi cp mc hiu NK1 F/ NK1 R1. Thành phn
u kin ca phn c trình bày trong Bng 10.
Bảng 10: Thành phu kin phn ng PCR khu-NK1 ca cDNA mã hóa
cho th th neurokinin-1
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
H
2
O
10.4
- Thi gian biu tiên:
94
o
C, 5 phút
- Lp li 45 chu kì:
+Biến tính: 94
0
C, 30 giây
+Gắn mồi : 60
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 150 giây
- Thi gian tng hp sau cùng:


CCCGG
G

76 bp
CCCGG
G
Đoạn 3’- NK1 (728 bp)
72
0
C, 10 phút
Sn phn di trên gel agarose. Kt qu n di cho mc
xp x -NK1.

Hình 7: n di sn phm PCR khu   -NK1 ca cDNA mã hóa cho th th
neurokinin-1. Gii chng âm không có cDNA; Gin phm PCR khui
-NK1; Ging M: thang chun SY-500.
Sn phc tinh sch bng High Pure PCR Product Purificati
chun b cho phn -NK1 ca cDNA.
3.1.3. --1
 i v-NK1, chúng tôi s dng cDNA làm khuôn cho phn ng
PCR vi cp mi NK1 F1/ NK1 R  khu-NK1 ca cDNA mã hóa cho th th
neurokinin-1. Tuy nhiên, sn phm PCR gc hi
DNA vi (Hình 8).

Hình 8n di sn phm PCR khu-NK1 ca cDNA mã hóa cho th th
neurokinin-1. Gin phm PCR khu-NK1; Ging M: thang chun SY-500.
Lp li phn ng nhiu l u kin v n cDNA, nhi gn m
chúng tôi vn. Vì vy, chúng tôi quynh thc hin phn
c vi m tng hp li cDNA t RNA tng s. Thành phu
kin ca phn c thc hing 11, ch i mi hexamer

(MgCl
2
20 mM)
1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F1 (2 µM)
0.5
NK1 R (2 µM)
0.5
Pfu polymerase
0.1
cDNA
1.0
Tổng
15.0
Sn phn di trên gel agarose (Hình 9). Kt qu cho thy bên c
c hit hic lp vc
NK1. S dng kit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) chúng tôi tinh sch
-NK1.

Hình 9n di sn phm PCR dùng khuôn cDNA tng hp t mi oligo T khui
-NK1. Ging  n phm PCR khu-NK1, Ging M: thang chun SY-
100.
---1
ch, t--ng
phn ng ni s dng kit Gene JET
TM
PCR Cloning Kit (Fermentas). Thành phn ca phn ng
nc trình bày trong Bng 12.

H
2
O
10.0
- Thi gian biu tiên:
94
o
C, 5 phút
- Lp li 40 chu kì:
+Biến tính: 94
0
C, 30 giây
+Gắn mồi : 60
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 150 giây
- Thi gian tng hp sau cùng:
72
0
C, 10 phút

1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F (2 µM)
0.5
NK1 R1 (2 µM)
0.5

94
o
C, 5 phút
- Lp li 40 chu kì:
+Biến tính: 94
0
C, 30 giây
+Gắn mồi : 60
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 150 giây
- Thi gian tng hp sau cùng:
72
0
C, 10 phút

1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F1 (2 µM)
0.5
NK1 R (2 µM)
0.5
Taq DNA polymerase (1 u/µl)
0.5
DNA khuôn
1.0
Tổng

10.4
- Thi gian biu tiên:
94
o
C, 5 phút
- Lp li 40 chu kì:
+Biến tính: 94
0
C, 30 giây
+Gắn mồi : 60
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 120 giây
- Thi gian tng hp sau cùng:
72
0
C, 10 phút

2
20 mM)
1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 R1 (2 µM)
0.5
pJET R (2 µM)
0.5
Pfu polymerase (1 u/µl)

n -NK1)
8.0
SmaI
2.0
XbaI
2.0
Các sn phm ct vn di kim tra trên gel polyacrylamide 8% (Hình 14A).
Kt qu cho thy phn ng cc thc hic cc
c 700 bp c-
c 3341 bp g-Nc tinh sch bng kit ca QIAquick Gel
Extraction (QIAGEN) rn di kim tra trên gel polyacrylamide 8% (Hình 14B). Kt qu cho
thm bo cho phn ng ni tip theo.

99
7
Hình 14 n di sn phm c c và sau khi tinh sch bng kit QIAquick Gel Extraction
(QIAGEN). A: sn phm cc khi tinh sch; B: sn phm ct sau khi tinh sch; 1: sn phm
PCR ch-NK1 sau khi ct; 2: sn ph -NK1-6 ct; M: thang chun-100;
M1: thang chun 1 kb.
-NK1 và vector có ch-c ni vi nhau theo thành phn trình bày trong
Bng 17.
Bảng 17:Thành phn phn ng n-NK1 vào vector pJET1.2--NK1
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
m 2x
10.0
 16
0


C, 30 giây
+Gắn mồi : 60
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 150 giây
- Thi gian tng hp sau cùng:
72
0
C, 10 phút

2
20 mM)
1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F (2 µM)
0.5
NK1 R (2 µM)
0.5
Taq DNA polymerase (1u/ µl)
0.5
Khuôn
1.0
Tổng
15.0 Hình 15n di sn phm PCR sàng lc các khun l n cDNA NK1 hoàn chnh.

3
/ NK1 R
3
c thit k da vào trình t cDNA hoàn chnh tách
dòng t phi Vi a mi NK1 F
3
c thit k mang trình t
nhn bit cho enzyme ct gii hn HindIII và mi NK1 F
3
mang trình t nhn bit cho enzyme
Bam
+ NK1 F
3
- -  - - 
Hình 16:  thit k mi NK1 F
3
/R
3
 khui cDNA-NK1 t vector pNK1-3.
Mt khác, chúng tôi s dng mã m u trong trình t cDNA ca NK1 thay vì mã m c
thit k sn trên vector biu hin nên trong quá trình thit k mi chúng tôi phi chèn thêm trình
t Kozak (ACCATGG)   c phiên mã và dch mã ca gen trong t
bào nhn.
Vi hai mc thit k mi, chúng tôi khui cDNA t pNK1-3. Thành phu kin

2
O
10.4
- Thi gian biu tiên: 94
o
C, 5 phút
- Lp li 4 chu kì:
+Biến tính: 94
0
C, 30 giây
+Gắn mồi : 50
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 150 giây
- Lp li 35 chu k
+Biến tính: 94
0
C, 30 giây
+Gắn mồi : 60
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 150 giây
- Thi gian tng hp sau cùng:
72
0
C, 10 phút






 1-3  1
F3/NK1 R3. Ging 1: sn phm PCR khui cDNA NK1; M: thang chun SY-500; : 


 .
y cp mi mi thit k c hin cDNA hoàn chnh mã hóa cho th
th neurokinin-ng thn DNA mc nhân bn có mang v trí nhn bit ca cp
enzyme HindIII/ BamHI  n phc tinh sch bng kit High Pure
c kí hiu là eNK1 (expression NK1).
3.2.2.  -1
Chúng tôi tách chit và tinh sch hai loi plasmid pCDNA3 và pEGFP-N1. Hai plasmid
c ct lt vi enzyme HindIII. Sn phm cn di và tinh sch
bn phm tinh sch tip tc ct
vi BamHI. Thành phu kin phn ng ct vi tc trình bày trong Bng
20 và Bng 21.
Bảng 20: Thành phu kin cho phn ng ct sn phm PCR cha gen NK1 bng enzyme
HindIII
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
H
2
O
60.0
 37

Qua mc ct sn phc tinh sch bng High Pure Product Purification kit
n di kim tra. K



 c th hin trong Hình 18.

Hnh 18: 





 3, pEGFP-N1  1 vi hai enzyme Hind III
và Bam HI. Ging 1, 2, 3 



 3, pEGFP-N1 1 ; 1, 2, 3:




 3, pEGFP-N1 1 ; M1: marker 1 kb; M2: thang chun
SY-500.
Sau khi tinh sng vector pCDNA 3  -N1 vi thành
ph

 22.
Bảng 22: Thành phu kin ca phn ng ni cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1 vào







 





 E. coli DH5
 c nhit (Mc 2.2.2.6). Khun lc nhn plasmid pCDNA3 s m   ng có
kháng sinh ampicillin (50µg/ml). Khun lc nhn plasmid pEGFP-N1 s mng có
kháng sinh Kanamycin (50µg/ml). Trên c hai long, 
  nh mã hóa cho NK1, chúng tôi chn 14 khun
lng cha kháng sinh ampicillin và 15 khun lng cha kháng sinh
kanamycin làm khuôn cho phn ng PCR v

 1 F3/ NK1 R3.  u
ki









C, 10 phút

1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F3 (10 µM)
0.5
NK1 R3 (10 µM)
0.5
Taq DNA polymerase (1 u/ µl)
0.5
Khuôn
1.0
Tổng
15.0
Sn phn di trên gel agarose (Hình 19 và Hình 20). Kt qu cho thy vi
các dòng vi khun mang vector tái t hc 8 trong 15 khun lc
n chèn cDNA-n (Hình 19).Vi các dòng cha vector
tái t hp peGFP-c 13 trong 15 khun lc chn chèn cDNA-NK1 có
 c mong mun (Hình 20).

Hnh 19: 









 1-NK1.
1E-15E:  nh s ng; ging M: thang chun SY-500.








 





 3-NK1 1-
NK1 mang cDNA hoàn chnh mã cho NK1. Da vào n di, chúng tôi la chn hai khun
lc 11A và 5E. Các vector tái t hp ca hai khun lc kí hiu là pCDNA3-NK1-11 
pEGFP-N1-NK1-5. Chúng tôi tách chit hai loi plasmid tái t h  .
3.2.3. Giải trnh tự gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 trong vector biểu hiện
 khnh s có mt ca cDNA-NK1 trong các vector biu hin, 




pCDNA3-NK1-11  -N1-NK1-5 














 1-3. 














 u hin mang cDNA hoàn chnh mã hóa cho th th neurokinin-1  i Vit
Nam
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN