TẠO DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTƠ BIỂU HIỆN GEN
KHÁNG NGUYÊN LÕI CỦA VIRUT VIÊM GAN B
(HBcAg) PHÂN LẬP TỪ KHỐI U CỦA BỆNH NHÂN
UNG THƯ GAN

Đặng Trường Minh, Lê Thị Tâm, Bạch Như Quỳnh,
Đồng Văn Quyền, Đinh Duy Kháng
Viện Công nghệ sinh học

I. MỞ ĐẦU

Viêm gan do virus viêm gan B (HBV) hiện đang được xem
là một căn bệnh nguy hiểm và phổ biến nhất trên thế giới.
Trên cơ sở điều tra rộng rãi về kháng nguyên bề mặt của
virus viêm gan B (HBsAg) và kháng thể kháng kháng
nguyên này (anti-HBsAg) người ta đã có thể nhận định
HBV đã và đang lưu hành trên toàn thế giới. Bệnh này
thường để lại hậu quả nghiêm trọng là xơ gan và ung thư
gan với tỷ lệ tử vong cao. Do vậy viêm gan B hiện là một
vấn đề đang được chú trọng trong chương trình bảo vệ sức
khoẻ cộng đồng toàn cầu [1].
Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới (WHO), hiện nay
có khoảng 400 triệu người bị nhiễm HBV trên toàn cầu,
như vậy HBV có thể được xem như một trong những mầm
bệnh phổ biến nhất đối với con người. Số người chết liên
quan trực tiếp đến nhiễm HBV hàng năm lên tới khoảng 2
triệu người. Ở Việt Nam, theo báo cáo của bộ Y tế từ năm
1978 đến năm 1990, số mắc viêm gan B khoảng 20.000
người/năm và tỷ lệ tử vong là 0,7% - 0,8%. Hiện tại, Việt
nam vẫn đang được xếp vào một trong những quốc gia có
tỷ lệ người nhiễm HBV cao nhất trên thế giới [3]. Điều

Thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR: Cặp mồi dùng cho
phản ứng PCR được thiết kế nhờ chương trình phần mềm
PC/Gene dựa trên trình tự của đoạn ADN thuộc genôm của
virus viêm gan B chứa gen hbc đã được công bố trong
Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế [2]. Vị trí bám của mồi vào
vùng chứa gen hbc được nêu ở hình 1.

Hình 1: Vị trí của cặp mồi HBCP1, HBCM1 trong một
vùng ADN genôm của virus viêm gan B, chứa toàn bộ gen
kháng nguyên lõi của virus viêm gan B với chiều dài 552
cặp bazơ (phần in đậm). Theo lý thuyết, cặp mồi HBCP1,
HBCM1 tạo ra sản phẩm PCR với chiều dài là 619 cặp
bazơ. Kỹ thuật PCR: Kỹ thuật PCR được tiến hành với 100 ng
ADN tách từ khối u làm sợi khuôn và cặp mồi đặc hiệu
HBCP1 và HBCM1, có trình tự như sau:

HBCP: 5'-TGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGC-3'
HBCM1:5'-TCCCACCTTATGAGTCCAAGGG-3'

Sử dụng 1 đơn vị Taq Polymeraza của công ty Perkin
Elmer cho mỗi ống phản ứng. PCR được tiến hành nhờ
máy chu kỳ nhiệt MJ PTC-100 (Mỹ) với chương trình như
sau: Biến tính ADN trong 3 phút rồi chạy 30 chu kỳ (95
0
C
50 giây, 55
0


Tiến hành PCR với cặp mồi HBCR1 và HBCH3, sau đó
gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR 2.1 để tạo
dòng phụ. Gen hbc được cắt ra khỏi vector tách dòng pCR
2.1 bằng EcoR I và Hind III, sau đó gắn vào vectơ pMAL-
c2 để thu nhận vectơ tái tổ hợp. Vectơ mang gen hbc được
biến nạp vào E. coli chủng BL21 và cho biểu hiện để thu
protein tái tổ hợp.

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Để nhân bản gen mã hoá cho kháng nguyên lõi của virut
viêm gan B, chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR với cặp
mồi HBCP1, HBCM1 và khuôn là 100 ng ADN tách từ
khối u của bệnh nhân ung thư gan. Với cặp mồi này, sản
phẩm PCR thu được có chiều dài tính theo lý thuyết là 619
cặp bazơ. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên
gel agarose 1% kết quả được chỉ ra ở hình 2.

Hình 2: Điện di trên gel agaroza 1% kiểm tra sản phẩm
PCR được tiến hành với khuôn là ADN tách chiết từ khối u
của bệnh nhân ung thư gan với cặp mồi HBCP1, HBCM1.
Kênh M: Chỉ thị phân tử (ADN  cắt bằng Hind III và
EcoR I). Kênh 1, 2, 3, 4, 5: Sản phẩm PCR.

Sản phẩm PCR được gắn vào vectơ PCRTM và biến nạp
vào vi khuẩn E. coli chủng DH-5. ADN plasmid được
tách từ các khuẩn lạc riêng rẽ màu trắng bằng phương pháp
miniprep sau đó được tuyển chọn để thu nhận các plasmid
có khả năng mang gen hbc bằng cách điện di trên gel


Biểu hiện gen hbc trong E. coli được thực hiện với vectơ
pMAL-c2. Sản phẩm PCR sau khi khuyếch đại có độ dài
566 cặp bazơ. Sau khi xử lý với EcoR I và Hind III được
gắn vào vectơ pMAL-c2 rồi biến nạp vào E. coli chủng
DH5. Plasmit tái tổ hợp được kiểm tra bằng cắt với EcoR
I và Hind III.
Kết quả kiểm tra được nêu ở hình 6. Sau khi đã kiểm tra
một cách chắc chắn, plasmit tái tổ hợp được biến nạp vào
E. coli chủng BL21 (DE3) và cho biểu hiện để thu nhận
protein tái tổ hợp. Biểu hiện gen hbc tái tổ hợp được cảm
ứng bằng IPTG với nồng độ cuối cùng là 1mM. Protein tái
tổ hợp là loại protein liên kết với protein có ái lực với
maltoza (MBP). Kết quả kiểm tra protein tái tổ hợp bằng
điện di gel polyacrylamit 12,5 % được nêu ở hình 7.

Hình 6: Điện di trên gel agaroza 1% để tuyển chọn vectơ
pMAL-c2 tái tổ hợp mang gen hbc sau khi cắt bằng EcoRI
và Hind III. Kênh M: Chỉ thị phân tử (ADN  cắt bằng
Hind III và EcoR I). Kênh 1, 2, 3, 4, 5: Plasmid tách từ các
clôn khác nhau. Sau khi cắt bằng EcoRI và Hind III, gen
hbc sẽ được tách khỏi vectơ. Hình 7: Điện di trên gel polyacrylamide 12,5% để kiểm tra
protein HBcAg tái tổ hợp. Kênh M: Chỉ thị phân tử (từ cao
xuống thấp: 93, 67, 43, 30, 20,1 và 14,4 kDa). Kênh 1: mẫu
trước cảm ứng. Kênh 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: Mẫu sau cảm ứng
0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 và 4,0 giờ.


2. Horikita M., Itoh S., Yamamoto K., Shibayama T.,
Tsuda F., Okamoto H., 1994.
Differences in the entire nucleotide sequence between
hepatitis B virus genomes from carriers positive for
antibody to hepatitis B e antigen with and without active
disease. J. Med. Virol. 44:96-10.
3. Trịnh Quân Huấn. 2000:
Virus viêm gan B. NXB Y học, 2000.
4. Đinh Duy Kháng, Chu Hoàng Hà, Phạm Thúy Hồng,
Nguyễn Thanh Thủy, Nông Văn Hải, Đái Duy Ban, 1996.
Phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen kháng nguyên
bề mặt của virut viêm gan B từ khối u của bệnh nhân ung
thư gan. Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học, 1996: 20-25.
5. Đinh Duy Kháng, Chu Hoàng Hà, Phạm Thúy Hồng,
Nguyễn Thanh Thủy, Nông Văn Hải, Đái Duy Ban, 1998.
Trình tự gen kháng nguyên bề mặt của virut viêm gan B
phân lập từ khối u của bệnh nhân ung thư gan. EMBL gene
bank số HBV012481.
6. Đinh Duy kháng, Nguyễn Văn Vũ, Đái Thị Hằng Nga,
Nguyễn Thị Nga, Đái Duy Ban, 1999.
Ứng dụng kỹ thuật PCR lồng (Nested PCR) để phát hiện
ADN của virut viêm gan B trong khối U của bệnh nhân ung
thư gan. Báo cáo khoa học Hội nghị CNSH toàn quốc,
1151-1156.
7. Đồng Văn Quyền, Bạch Như Quỳnh, Đái Duy Ban, Đinh
Duy Kháng. 1999.
Nghiên cứu biểu hiện gen kháng nguyên bề mặt của virut
viêm gan B (HBsAg) ở trực khuẩn Escherichia coli. Kỷ yếu
Viện Công nghệ Sinh học. 239-244.
8. Dong Van Q., Bach Nhu Q., Le Thi T., Dinh Duy K.

We colected only the plasmids with larger size for checking
with restriction enzyme EcoR I and Hind III. Result of
digestion with restriction enzyme confirmed that, the hbc
gene was already inserted into pMALC2 vector to be
available for E. coli transformation. Recombinant vectors
were used to transforme E. coli strain BL21 (DE3) for
expression. The expected fusion protein with molecular
mass about 61 kDa would be expressed after 3 hours
induction with 1 mM IPTG. The fusion protein included
maltose binding protein (MBP) with molecular mass 41
kDa and recombonant HBcAg with predicted molecular
mass 20 kDa were checked with polyacrylamide gel
electrophoresis.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Đinh Duy Kháng