TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
PROTEIN VỎ VP19 CỦA VI RÚT WSSV GÂY HỘI
CHỨNG ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (PENAEUS
MONODON)

Nguyễn Quỳnh Anh (1), Nguyễn Đức Hoàng (2), Trần
Linh Thước (1,2)
(1) Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học,Trường
ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc gia Tp.HCM
(2) Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử,Trường
ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc gia Tp.HCM

MỞ ĐẦU

Ngành công nghiệp thủy hải sản nói chung, ngành công
nghiệp nuôi tôm nói riêng phát triển mạnh mẽ trên khắp thế
giới đã mang lại nguồn thu nhập đáng kể cho nhiều quốc
gia trong đó có Việt Nam. Tuy nhiên, sự gia tăng trong hoạt
động nuôi trồng lại dẫn tới sự bùng nổ các bệnh gây ra bởi
vi khuẩn và vi rút. Dù xuất hiện muộn nhưng hội chứng
đốm trắng đã nhanh chóng lan rộng khắp nơi với những
thiệt hại ước tính khoảng 1 tỉ USD mỗi năm trên phạm vi
toàn thế giới. Trước tình hình đó, việc phát hiện bệnh sớm
để có các biện pháp xử lý thích hợp đã trở nên ngày càng
cấp thiết [1].

Các phương pháp được dùng để phát hiện bệnh là mô học,
phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction), phương
pháp lai và phương pháp miễn dịch [1]. Với thế mạnh là có
thể dùng để phát hiện bệnh ngoài phòng thí nghiệm,
phương pháp miễn dịch có thể được các hộ nuôi trồng sử

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

Chủng giống vi sinh vật. Escherichia coli DH5 [F-
endA1 hsdR17 (rk-/mk-) supE44 thi l- recA1 gyrA96 D
lacU169 (f80 lacZ DM15)] được sử dụng để tạo dòng các
plasmid mang đoạn gen VP19; Escherichia coli HB101
[sup E44 hsdS20 (rB-/mB-) recA13 ara14 proA2 lacY1
gaIK2 rpsL20 xyl5 mH1] được dùng làm tế bào chủ để biểu
hiện gen mã hóa protein VP19 bằng vector biểu hiện pEZZ
18 (Genbank M74186) [8]. E. coli được nuôi cấy trong môi
trường Luria-Bertani (LB) [1% tryptone, 0,5% yeast extract
và 1% NaCl] có bổ sung 100g/ml ampicillin (khi cần) để
làm nhân tố chọn lọc.

Nguồn ADN. Mẫu tôm bệnh có nguồn gốc từ Sóc Trăng.
Tách chiết ADN từ mẫu tôm và kiểm bằng PCR nhờ bộ kit
phát hiện vi rút gây bệnh đốm trắng của Phòng thí nghiệm
Công nghệ sinh học phân tử, Trường ĐH Khoa học tự
nhiên, Đại học quốc gia TP. HCM. Mẫu ADN dương tính
được sử dụng làm ADN khuôn để nhân bản và thu nhận
đoạn gen VP19 bằng phản ứng PCR.

Thiết kế plasmid. Với mục đích biểu hiện protein vỏ VP19
của vi rút WSSV dưới dạng protein dung hợp Protein A-
VP19, plasmid pZ-VP19 được thiết kế như sau. Đoạn gen
VP19 được khuếch đại và thu nhận bằng phản ứng PCR sử
dụng ADN bản mẫu được tách chiết từ mẫu tôm bệnh và
cặp mồi VP19-2f, 5’ -ACAGGGATCCAATGGCCACC-
ACG-3 để tạo vị trí cắt BamHI và VP19-2r, 5’ -
TTCTAAGCTTTTACT-GCCTCCTCTTGG-3 để tạo vị trí

bão hòa và điện di phân tích protein trên gel polyacrylamid
với sự hiện diện của Sodium Dodecyl Sulfate[9] cùng với
thang chuẩn protein và mẫu đối chứng là protein thu từ môi
trường nuôi cấy E. coli HB101 chứa plasmid pEZZ 18
không có đoạn chèn để xác định sự hiện diện của protein
dung hợp Protein A-VP19 trong môi trường nuôi cấy.

KẾT QUẢ

Thu nhận gen mã hóa protein vỏ VP19. Khảo sát 30 mẫu
ADN bị nghi nhiễm bệnh WSSV, kết quả cho thấy có 25
mẫu bị nhiễm WSSV khi được kiểm tra bằng PCR với cặp
mồi theo bộ kít của Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học
phân tử, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia
TP. HCM. Khi thực hiện phản ứng PCR dựa vào khuôn
ADN trên với cặp mồi VP19-2f/VP19-2r, kết quả cho thấy
chỉ có những mẫu tôm bị nhiễm WSSV thì mới cho sản
phẩm khuếch đại của gen VP19.

Chọn một mẫu ADN có kết quả dương tính ở trên làm
khuôn để thu nhận đoạn gen VP19 bằng Pfu ADN
polymerase. Sản phẩm PCR có kích thước 387bp (Hình 1,
giếng 1) được cắt bằng BamHI và HindIII. Đoạn ADN này
sau đó được tinh chế qua gel agarose để dùng cho phản ứng
nối nhằm tạo plasmid pZ-VP19.

Tạo dòng gen VP19 vào vector biểu hiện pEZZ 18. Sản
phẩm nối của gen VP19 và plasmid pEZZ 18 được biến nạp
vào E. coli DH5 nhằm nhân bản với số lượng lớn bản sao
đồng thời có thể tuyển chọn sơ bộ thể biến nạp dựa trên

Hình 3. Kết quả biến nạp pZ-VP19 vào E. coli. Hình 4. Kiểm tra plasmid pZ-VP19.

1, pEZZ 18 được cắt bởi HindIII và BamHI
2, Sản phẩm PCR đoạn gen VP19
3, pZ-VP19 đư ợc cắt bởi HindIII và BamHI

Giải trình tự gen mã hóa protein VP19. Đoạn gen VP19
trong plasmid pZ-VP19 được giải trình tự, kiểm tra sự đồng
khuôn với gen mã hoá protein A có sẵn trong plasmid
pEZZ18. Trình tự gen VP19 ở WSSV trên mẫu tôm bệnh
tại Việt Nam do chúng tôi tạo dòng và giải trình tự được
công bố trên ngân hàng gen với mã số AY160771. So sánh
trình tự VP19 này với các trình tự sẵn có trên ngân hàng
gen.(Hình 6) cho thấy trình tự gen VP19 ở WSSV tại Việt
Nam có sự sai khác một axit nucleic tại vị trí 212 so với
trình tự AY220744 và một tại vị trí 218 so với trình tự
AF369029.

Biểu hiện gen mã hóa protein VP19 trong E. coli HB101.
Biến nạp plasmid pZ-VP19 được chiết tách từ E. coli
DH5 vào E. coli HB101. Sự biểu hiện của gen VP19 trong
plasmid này được kiểm soát bởi promoter lacUV5 và
promoter của protein A mà không cần phải cảm ứng.
Protein được biểu hiện (ở dạng protein dung hợp Protein A-
VP19) được tiết ra ngoài môi trường nhờ trình tự tín hiệu
tiết có trên plasmid. Trọng lượng phân tử của protein dung
hợp khoảng 33kDa (trong đó protein A khoảng 14kDa và

trên tôm sú, góp phần trong việc giám sát, phòng ngừa dịch
bệnh do WSSV tại Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Richard Hodgson, Peter Warker (2001) Molecular
diagnostics training workshop for detection of WSSV
(white spot syndrome virus) in Vietnam, University of
Fisheries Nha Trang city Vietnam.
2. Van Hulten M. C., Witteveldt J., Peters S.,
Kloosterboer N., Tarchini R., Fiers M., Sandbrink H., Klein
Lankhorst R. and Vlak J.M. (2001), Virology 286: 7 - 22.
3. Yang F., He J., Lin X., Li Q., Pan D., Zhang X. and
Xu X. (2001), Journal of General Virology 75: 11811 -
11820.
4. Van Hulten M. C., Reijns M., Vermeesch A. M. G.,
Zandbergen F. and Vlak J. M. (2002), Journal of General
Virology 81: 257 - 265.
5. Van Hulten M. C., Westenberg M., Goodall S. D. and
Vlak J. M. (2000), Virology 266: 227 - 236.
6. Van Hulten M. C., Goldbach R. W and Vlak J.M.
(2000), Journal of General Virology 81: 2525 - 2529.
7. Zhang X., Huang C., Xu X. and Hew C. L. (2002),
Journal of General Virology 83: 1069 - 1074.
8. Lowenadler B., Jansson B., Paleus S., Holmgren E.,
Nilsson B., Moks T., Palm G., Josephson S., Philipson L.,
Uhlen M. (1987), Gene 58(1): 87 – 97.
9. Shambrook J. and Russell W. D. (2001) Molecular
cloning: a laboratory manual, Third edition, CSHL press,
Cold Spring Habor, NewYork.

Positive sample was used to prepare the total DNA extract,
which was used as DNA frame for the preparative
amplification of vp19 gene with a primer pair containing
restriction sites of BamHI and HindIII. The gene was
subcloned into pEZZ 18 expression vector 18 at BamHI
and HindIII sites. The cloned vp19 gene was sequenced and
registered in GeneBank as AY160771. On alignment and
comparison with two reported sequences of vp19, the
cloned sequence of vp19 showed a very high homology on
DNA as well as on protein level. The recombinant vector
was transformed and expressed in E. coli HB101 as a
fusion protein of a 14kDa fragment of A protein from
pEZZ 18 and the 19kDa VP19 protein. The expression of
the fused gene was confirmed successfully by SDS-PAGE.

Người thẩm định nội dung khoa học: GS. Lê Đình Lương.