Website: Email : Tel (: 0918.775.368
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS.
Nông Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công
nghệ gen, Trưởng phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học-
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong
quá trình hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Quyền Đình Thi, Chủ nhiệm đề tài
“Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ các
vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi”, thuộc
Chương trình trọng điểm cấp Nhà nước: “Phát triển và ứng dụng Công nghệ sinh
học trong lĩnh vực Nông nghiệp và phát triển nông thôn đến 2020”do Bộ Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn chủ trì, đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia
nghiên cứu, hoàn thành luận văn theo hướng nghiên cứu của đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Sinh – Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Công nghệ ADN Ứng
dụng - Viện Công nghệ sinh học đặc biệt là TS. Lê Thị Thu Hiền và KS. Vũ Hải
Chi đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi rất tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp lòng biết ơn sâu
sắc vì sự quan tâm, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn
thành luận văn.
Học viên

Nguyễn Thị Mai Hương
NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
AS Acetosyringone
ATP Adenosine triphosphate
bp Base pair
DNA Deoxyribonucleic acid

1.2.3. Chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens.......................................17
1.2.3.1. Kỹ thuật chuyển gen vào nấm mốc A. niger.................................................17
Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................24
2.1. Nguyên liệu..........................................................................................................24
2.1.1. Nguyên liệu.......................................................................................................24
2.1.2. Hóa chất ............................................................................................................24
** Các nguyên tố vi lượng: 100 mg ZnSO4. 7H2O; 100 mg H3BO3; 100 mg MnSO4.
H2O; 100 mg CuSO4. 5H2O; 100 mg Na2MoO4. 2H2O; bổ sung H2O đến 100 ml,
khử trùng.....................................................................................................................26
2.1.3. Thiết bị .............................................................................................................26
2.2. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................26
2.2.1. Các phương pháp sử dụng để nối ghép gen......................................................26
2.2.2. Biến nạp vào tế bào E. coli và A. tumefaciens..................................................30
2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose......................................................32
2.2.4. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR............................................................................33
2.2.5. Phương pháp tách chiết DNA plasmid lượng nhỏ.............................................34
2.2.6. Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn ...............................36
2.2.7. Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng.........37
3
2.2.8. Phương pháp nuôi nhiễm A. tumefaciens và A. niger ......................................38
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...................................................................40
3.1.1. Lắp ghép xylB vào vector trung gian ...............................................................43
3.1.2. Lắp ghép cấu trúc GluA promoter + hph gene + TrypC terminator vào vector
trung gian ....................................................................................................................49
3.1.3. Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian
(pKS_xylB_hph).........................................................................................................55
3.2. Thiết kế Ti plasmid mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph.............................56
3.2.1. Lắp ghép đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung
gian vào Ti plasmid.....................................................................................................56
3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong vector tái tổ hợp Ti plasmid...........57

chuyển gen đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu [22, 31]. Chuyển gen
vào nấm dựa trên nền tảng của công nghệ DNA tái tổ hợp, để cải biến hệ gen của
nấm mốc nhằm đáp ứng nhu cầu của con người về các sản phẩm protein cũng như
enzyme để sản xuất trên qui mô công nghiệp. Hơn nữa, kỹ thuật chuyển gen cho phép
chọn lựa promoter đặc hiệu cũng như các chủng vi sinh vật chuyển gen mong muốn,
nhờ vậy đặc tính của enzyme tái tổ hợp đã được cải thiện [22].
Hiện nay, kỹ thuật chuyển gen thông vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được
sử dụng phổ biến trên thế giới để chuyển gen vào thực vật. Bởi đây là một hệ thống
5
chuyển gen có hiệu suất cao, ổn định và đơn giản. Agrobacterium đã và đang được
nghiên cứu, áp dụng để chuyển gen vào nấm mốc [3, 9].
Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thiết kế vector
biểu hiện gen mã hóa xylanase trong nấm mốc”
Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và
Phòng Công nghệ DNA ứng dụng – Viện Công nghệ sinh học.
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài
Mục tiêu
Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ chuyển gen để thiết kế
Ti–plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B. Trên
cở sở đó tạo các chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp phục vụ công
tác chuyển gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B vào A. niger.
Nội dung nghiên cứu
- Thiết kế vector tách dòng trung gian pKS_xylB_hph dựa trên vector
pBluescript II KS (-) mang hai cấu trúc biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng
hygromycin B:(GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) và (GluA
promoter + hph gene + TrypC terminator).
- Thiết kế Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph dựa trên vector pCAMBIA1300
mang hai cấu trúc biểu hiện biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng
hygromycin B: (GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) và (GluA
promoter + hph gene + TrypC terminator.

– methyl – d – glucuronosyl và arabinofuranosyl tạo thành cấu trúc polymer không
đồng nhất. Tác động của xylan về mặt cấu trúc vẫn còn chưa rõ ràng bởi những khó
khăn trong việc tách chiết xylan từ nguyên liệu trong tự nhiên mà không bị biến đổi
hay mất đi một số cấu trúc ban đầu của xylan cũng như sự liên kết của nó với các
thành phần khác [18, 23, 29].
Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc phân hủy xylan, đặc biệt là vi sinh vật tiết
ra enzyme xylanase. Ứng dụng của xylanase đã được Hoppe - Seyler báo cáo từ hơn
một trăm năm qua [18]. Sự phân hủy sinh học bộ khung cấu tạo nên xylan phụ thuộc
chủ yếu vào hai lớp enzyme: endo – 1,4 – ß - xylanase (1,4 – ß – D –
xylanohydrolase; EC 3.2.1.8), lớp enzyme này thủy phân liên kết 1,4 – ß - Glucosid
nối với xylose và ß – xylosidases (1,4 – ß – D – xylan xylanohydrolase; EC 3.2.1.37),
lớp enzyme này thủy phân xylobiose và xylooligosaccharid ngắn nhờ hoạt động của
enzyme endo – xylanase. Các enzyme loại mạch nhánh (debranching enzyme) chẳng
hạn như α – glucuronidase và α – L – arabinifuranosidase và esterase chẳng hạn như
acetylxylan esterases và ferulyl và p – coumaroyl esterase sẽ loại bỏ mạch nhánh
acetyl và mạch nhánh phenol [29]. Ở cây gỗ rắn, xylan có công thức O – acetyl – 4 –
O – methylglucuron – oxylan. Arabino – 4 – O – methylglucuroxylan tìm thấy trong
cây gỗ mềm và arabinoxylan rất điển hình trong cây cỏ và thực vật bình thường khác
[13].
Sự đa dạng của xylan dẫn đến sự đa dạng của enzyme xylanase [13]. Xylanase
tiết ra từ vi sinh vật được chia làm hai họ enzyme thủy phân chính: họ 10 và họ 11
dựa trên trình tự tương đồng của amino acid [28]. Xylanase thuộc họ 10 nhìn chung
có khối lượng phân tử lớn (>30 kDa), đa dạng và phức tạp hơn (có thể thủy phân
8
cellulose và xylan), trong khi xylanase thuộc họ 11 có khối lượng phân tử nhỏ hơn
(khoảng 20 kDa) và đặc hiệu hơn đối với xylan [13, 29].
Xylanase có trong nhiều loài sinh vật trong tự nhiên, ở sinh vật nhân sơ và sinh
vật nhân chuẩn và đã được tìm thấy cả trong vi khuẩn ở nước, nấm, tảo biển, côn
trùng. Cho đến nay, hầu hết xylanase được chiết xuất từ vi khuẩn và nấm [13, 29].
Trong đó, nấm sợi là nguồn vi sinh vật tiềm năng nhất để chiết xuất xylanase với hàm

dòng và biểu hiện thành công. Đặc tính của enzyme này cũng đã được phân tích [13].
Những thành tựu trên là cơ sở để nghiên cứu tạo sinh vật chuyển gen mã hóa
xylanase vào vật chủ mong muốn với mục đích thu lượng lớn enzyme phục vụ cho
các ngành sản xuất công nghiệp.
1.2. Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen vào nấm mốc thông qua
A. tumefaciens
1.2.1. Giới thiệu về nấm mốc
Nấm mốc hay còn gọi là nấm sợi là vi sinh vật đa dạng nhất trong tự nhiên. Ước
tính có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó chiếm số lượng lớn là các loài thuộc chi
Aspergillus. Chúng là các vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp, sinh bào tử và sống hoại
sinh nhờ khả năng sinh enzyme để phân hủy các hợp chất hữu cơ [8, 22]. Aspergillus
là một chi thuộc ngành Eumycota và gồm rất nhiều loài phổ biến, ví dụ: A. niger, A.
oryzae... Giống như các loài khác trong chi Aspergillus, A. niger sinh bảo tử có màu
đen, vì thế chúng còn được gọi là mốc đen [33]. A. niger gây ảnh hưởng đến các sản
phẩm nông sản sau khi thu hoạch nhưng chúng ít gây bệnh cho con người so với một
số loài thuộc chi Aspergillus chẳng hạn như A. flavus, A. fumigatus. A. niger cũng đã
được sử dụng từ rất lâu trong sản xuất thực phẩm, sản xuất citric acid, gluconic acid
gluconic [33].
Nhờ khả năng tiết enzyme với hàm lượng cao, A. niger được sử dụng phổ biến
trong sản xuất thực phẩm và được coi là loài một vi sinh vật quan trọng trong sản
10
xuất công nghiệp [10, 13]. Ngoài ra, chúng còn được sử dụng trong sản xuất bánh,
rượu, bia. Dựa trên lịch sử ứng dụng lâu đời trong sản xuất thực phẩm lên men, A.
niger đã được coi là vi sinh vật an toàn và thân thiện với con người, mặc dù một số
chủng (chiếm khoảng 3 – 10%) có thể sản xuất ra một số chất chuyển hóa thứ cấp
gây độc trong điều kiện lên men như mycotoxin nhưng với hàm lượng rất thấp.
Kỹ thuật chuyển gen đã được áp dụng để chuyển các gen mong muốn vào thực
vật, nấm (nấm men) nhằm nâng cao năng suất, kháng sâu bệnh và nâng cao chất
lượng sản phẩm [22]. Chuyển gen vào A. niger đã được khai phá từ những năm cuối
thập kỉ 80 và đầu thập kỉ 90, trong gen mã hóa enzyme là một trong những mục tiêu

Agrobacterium là chi vi khuẩn Gram âm (–), bao gồm các loài gây bệnh kí
sinh và vi sinh vật sống trong đất. A. tumefaciens là loài vi khuẩn đất có khả năng
chèn gen của mình vào tế bào vật chủ và sau đó sử dụng bộ máy của sinh vật chủ để
biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng. A. tumefaciens sẽ
tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra những nốt sần ở
cây (bệnh mụn cây–crown gall disease) [12, 18].
Cơ chế hình thành loại khối u cảm ứng này được nghiên cứu từ nhiều năm nay
và mang lại nhiều thành tựu quan trọng trong chuyển gen thực vật [18]. A.
tumefaciens được sử dụng như một hệ thống trung gian hữu hiệu để chuyển gen vào
nhiều loài nấm, chẳng hạn như A. awamori, A. fumigatus, Penecillium digitatums [18,
19]. Không chỉ vậy, chuyển gen thông qua A. tumefaciens cũng đã được áp dụng để
chuyển gen vào tế bào người [26].
12
Đến nay người ta đã khám phá được bản chất phân tử của quá trình cảm ứng
phát sinh khối u do vi khuẩn A. tumefaciens gây ra ở thực vật. Trước hết là quá trình
nhiễm khuẩn ở vùng tế bào của cây bị thương. Các tế bào bị thương tiết ra những hợp
chất polyphenol thu hút các tế bào vi khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên, vi khuẩn
không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển gen vào chúng một đoạn DNA
nhỏ (T – DNA: tranferred DNA) nằm trên một loại plasmid đặc biệt và gây nên trình
trạng phát sinh khối u. Plasmid đặc biệt là Ti plasmid (tumor inducing) [12, 26]. T –
DNA sẽ tạo ra khối u thực vật và sự phát triển của khối u sau đó sẽ không phụ thuộc
vào sự có mặt của vi khuẩn Agrobacterium [19, 29].
1.2.2.1. Ti plasmid
Ti plasmid là một phân tử DNA vòng tương đối lớn, kích thước khoảng 150 kb
– 200 kb. Tuy nhiên chỉ một đoạn 2 kb – 3 kb có khả năng thâm nhập vào genome
của tế bào chủ. Đó là đoạn T – DNA [19, 26]. T – DNA được xác định bởi trình tự ở
hai đầu khoảng 25 bp gọi là vùng biên (T – DNA borders), phần còn lại ngoài vùng
biên sẽ không có chức năng gì trong quá trình chuyển gen [12, 26].
Trên T – DNA có các gen tạo khối u. Gen tạo khối u sau khi gắn vào hệ gen của
tế bào chủ sẽ tham gia quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin. Đây là các hợp

mức độ biểu hiện của gen vir trong môi trường có hợp chất monosaccharide. AS kích
thích virA, một thụ thể liên kết màng, và virA kích thích virG. VirG bị kích thích sẽ
tương tác với các yếu tố kích thích trên đoạn khởi đầu (promoter) điều khiển khung
đọc (operon) của virA, virB, virC, virD, virE và virG và kết quả là làm tăng mức độ
biểu hiện [12, 26].
.
14
Hình 1. 3: Mô hình xâm nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật [19]
VirC và virD đều bị endonuclease phân cắt, hai gen này liên kết với biên phải
của T – DNA và cắt T – DNA sợi đơn ra khỏi Ti plasmid. Ngay lập tức trình tự này
liên kết với virE2 để tránh tác dụng của endonuclease và hiện tượng tự bắt cặp lại.
VirB2 – B11 hình thành T – pilus và kích thích virE2 đã được bao bọc bởi T – DNA
dạng sợi đơn chuyển sang tế bào đích [12, 26]. Trong tế bào chủ, T – DNA sẽ hoạt
động cùng gen nhân và mã hóa ra hormon và opine. Hormon kích thích sự phát triển
của tế bào chủ, opine là nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên,
cho đến nay người ta vẫn chưa biết được đầy đủ cơ chế chính xác của quá trình này
[26]. Trong tế bào vật chủ, đầu cùng C của virE2 hướng tới DNA trong nhân và sẽ
hòa nhập vào hệ gen của tế bào chủ. Nếu không có trình tự tương đồng giữa trình tự
gen của tế bào chủ và T – DNA được chuyển, T – DNA sẽ hòa nhập một cách ngẫu
nhiên vào hệ gen của tế bào chủ. Tuy nhiên, nếu những đoạn gen mà có độ tương cao
với hệ gen của tế bào chủ, chúng sẽ tái tổ hợp tương đồng. Tần suất tái tổ hợp tương
15
Tế bào chủ
Nhân
Vết thương
thành tế bào
thực vât
Vết thương
thành tế bào
thực vât

kháng sinh để chọn lọc hoạt động được trong E. coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn
lọc hoạt động được ở tế bào thực vật; iv) Đoạn khởi đầu của E. coli, không hoạt động
ở A. tumefaciens. Như vậy, vector liên hợp thực chất là vector lai có chỗ cho GOI đi
nhờ như một hành khách vào trong tế bào thực vật [1].
* Vector nhị thể (binary vector)
Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng
biệt: Ti plasmid và vector T – DNA
Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A. tumefaciens, loại vector nhị thể
được thiết kế bao gồm các phần như sau: i) Vị trí ghép nối đa điểm; ii) Đoạn khởi
16
đầu tái bản hoạt động cả ở E. coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động
được ở cả vi khuẩn và thực vật.; iv) gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT,
trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A. tumefaciens, không cần khi chuyển gen
trực tiếp; v) Đoạn T – DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải bắt
buộc phải có. Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận
chuyển T – DNA [1, 19].
Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản. Loại vector vận
tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên của T – DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir
đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmid hỗ trợ được cải biến
từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát
triển thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật [1].
Với các kiểu plasmid như trình bày trên có thể tiến hành chuyển gen gián tiếp
thông Agrobacterium vào nhiều loài nấm mốc khác nhau [1, 9, 11].
1.2.3. Chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens
1.2.3.1. Kỹ thuật chuyển gen vào nấm mốc A. niger
Nhờ khả năng chuyển DNA sang tế bào vật chủ và phổ vật chủ rộng mà chuyển
gen nhờ A. tumefaciens trở thành kỹ thuật thông dụng để chuyển gen vào nhiều đối
tượng khác nhau, ví dụ: thực vật, vi sinh vật [22, 26]. Nhiều loài thực vật chuyển gen
nhờ Agrobacterium, trong đó chiếm số lượng lớn là các cây nông nghiệp, chẳng hạn
như khoai tây, cà chua, đậu tương, cây bông và cây lúa đã mang lại năng suất và chất

của vector tách dòng để lợi dụng cơ chế chuyển gen của loài vi khuẩn này; iii) vector
tái tổ hợp mang gen mong muốn phải được biến nạp vào tế bào A. tumefaciens có
mang các vùng gen độc trong DNA của chúng, các gen độc sẽ cảm ứng vi khuẩn
chuyển gen quan tâm sang tế bào chủ khi có mặt các chất cảm ứng; iv) chủng vi
khuẩn chuyển gen sẽ được tiến hành nuôi nhiễm với bào tử nấm A. niger trong môi
trường có bổ sung chất cảm ứng AS; v) nấm chuyển gen được chọn lọc và phân biệt
với nấm không được chuyển gen dựa trên đặc tính của đoạn DNA được chuyển vào
nấm hoặc dựa trên sự biểu hiện của gen được chuyển. Nấm chuyển gen tiếp tục được
nuôi cấy trên môi trường chọn lọc để làm ổn định nguồn gen [11, 22].
18
Như vậy, phương pháp chuyển gen vào nấm mốc thông qua Agrobacterium
không khác nhiều so với phương pháp chuyển gen vào thực vật. Đó là chúng đều cần
một sinh vật chuyển gen gián tiếp, một Ti plasmid tái tổ hợp đã ghép nối đoạn gen
mong muốn, và đều phải có mặt chất cảm ứng… Tuy nhiên, với nấm mốc, quá trình
chuyển T- DNA nhờ Agrobacterium được thực hiện thông qua quá trình nuôi chung
(nuôi nhiễm) trên một giá thể đặc biệt là các màng lọc để thuận lợi cho việc chuyển
màng sang môi trường chọn lọc thể chuyển gen [9].
1.2.3.2. Thuận lợi và khó khăn
* Thuận lợi
Chuyển gen vào nấm mốc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens có nhiều ưu điểm
và thuận lợi so với các các phương pháp truyền thống ví dụ: xung điện, PEG, bởi các
lý do sau:
• Nguyên liệu từ nấm để nuôi nhiễm cùng với A. tumefaciens vô cùng đa
dạng. Chúng có thể là bào tử, là thể nguyên sinh, hạt cầu, thể sợi nấm hay bào tử nảy
mầm và thậm chí cả cặn tế bào [9, 11, 16]. Nhờ ưu điểm này đã loại bỏ được những
trở ngại khi tái sinh thể nguyên sinh khi sử dụng kỹ thuật PEG. Phương pháp chuyển
gen truyền thống vào Mucor dựa trên phương pháp PEG đòi hỏi phải có thể nguyên
sinh hình thành từ khuẩn ty. Mặc dù hiệu suất chuyển gen cao, nhưng trên thực tế,
phương pháp này đòi hỏi một lượng lớn enzyme để chuẩn bị thể nguyên sinh [18].
Hơn nữa, hiệu suất tái sinh thể nguyên sinh thường gặp nhiều khó khăn và ảnh hưởng

thu lượng lớn sản phẩm protien do chỉ hòa nhập một sao duy nhất T – DNA trong khi
cần nhiều bản sao để biểu hiện ra sản phẩm của gen. Tuy nhiên, nhược điểm này có
thể khắc phục dễ dàng nhờ chuyển lượng lớn phân tử T – DNA có mang gen mong
muốn hoặc thay đổi điều kiện khi nuôi nhiễm hoặc thay đổi gen chọn lọc [11]. Như
vậy, rõ ràng hệ thống chuyển gen nhờ Agrobacterium là một hệ thống chuyển gen
hiệu quả, đơn giản và là một công cụ hữu ích để chuyển gen vào nấm mốc [9, 11, 12,
16].
20
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào nấm mốc thông qua
Agrobacterium
Chuyển gen vào nấm thông qua A. tumefaciens là phương pháp được áp dụng
phổ biến bởi tính ổn định, đơn giản và hiệu suất cao [13, 16]. Tuy nhiên, hiệu suất
chuyển gen vào nấm thông qua Agrobacterium cũng khác nhau khi sử dụng các loài
nấm khác nhau. Do đó, để hiệu suất chuyển gen đạt được cao nhất, các yếu tố ảnh
hưởng đến quá trình chuyển gen cần được tối ưu hóa [18].
• Nguyên liệu nấm
Một trong những thuận lợi của phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium là
nguyên liệu ban đầu dùng cho chuyển gen gen rất đa dạng. Nguyên liệu để nuôi
chung với A. tumefaciens có thể là bào tử, thể nguyên sinh, thể sợi nấm… đều có thể
chuyển gen thành công và hiệu suất chuyển gen ở các trường hợp này là ngang nhau.
Trong khi một số loài nấm lại yêu cầu các nguyên liệu rất cụ thể. Một số loài thuộc
zygomycetes chẳng hạn như Rhizopus oryzae, Mucor circinelloides, chỉ xuất hiện thể
chuyển gen nếu nguyên liệu ban đầu là thể nguyên sinh; với loài Coccidioides
immitis chuyển gen chỉ có thể sử dụng bào tử mầm; hiệu suất chuyển gen ở Agaricus
bisporus khi dùng bào tử mầm làm nguyên liệu ban đầu sẽ cao hơn so với dùng thể
sợi nấm [12].
Một nhân tố khác ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen vào nấm là thời gian bảo
quản bào tử nấm. Nguyên liệu được bảo quản trong thời gian dài sẽ giảm hiệu quả
chuyển gen trong quá trình nuôi nhiễm hoặc giảm tỷ lệ nảy mầm của bào tử so với
nguyên liệu mới [12].

tối ưu cho quá trình nuôi nhiễm từ 22° – 25°C, trong thời gian từ 2 – 3 ngày. Ngoài
ra, nhiều loại màng lọc khác nhau như cellulose, nitrocellulose, Hybond N+ cũng sẽ
cho hiệu suất chuyển gen khác nhau [11, 12].
Ngoài các yếu tố trên, còn một số các yếu khác cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu
suất chuyển gen chẳng hạn như nồng độ chất kháng sinh, hoặc cũng có thể do Quy
22
trình chuyển gen không phù hợp với tế bào chủ. Do vậy, để đạt hiệu suất chuyển gen
cao nhất, điều kiện chuyển gen cần phải được tối ưu [12].
23
Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Nguyên liệu
• Vector và chủng giống
 Vector tách dòng pJET1.2/Blunt của hãng Fermentas; Vector pBluescript II
KS (–) của hãng Stratagene; Vector biểu hiện Vector pCAMBIA1300. Các
vector này được lưu giữ tại Phòng công nghệ ADN ứng dụng – Viện Công
nghệ sinh học. Vector biểu hiện pAN7.1 – GluA do Phòng Công nghệ sinh
học enzyme – Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
 Các chủng vi sinh vật: Agrobacterium tumefaciens CV58C1 – pGV2260 của
hãng Clontech (Mỹ); E. coli DH5α và E. coli DH10b của hãng Gibco BRL
Life Technology (Mỹ). Các chủng giống này được lưu giữ tại Phòng Công
nghệ ADN ứng dụng – Viện Công nghệ sinh học.
 A. niger VTCC – F – 017; gen mã hóa xylanase phân lập từ A. niger do Phòng
công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
• Các cặp mồi dùng trong PCR:
 Cặp mồi đặc hiệu cho hph:
hph1: 5’ – TTC GAT GTA GGA GGG CGT GGA T – 3’
hph2: 5’ – CGC GTC TGC TGC TCC ATA CAA G – 3’
 Mồi đặc hiệu cho xylB:
XylBF: 5’ – GAA GGA TCC GAA TAT GCT CAC CAA G – 3’

Agar 15 g 15 g - 15 g 15 g
Hóa chất
khác
-
Saccharose: 5 g
MgSO
4
.7H
2
O:
2 mM
KCl: 2,5 mM
MgSO
4
:10 mM
MgCl
2
: 10 mM
Glucose: 20 mM
- 0, 8 ml K
2
HPO
4
1,25 M,
pH: 4,8
20 ml MN* buffer (30
gMgSO
4
. 7H
2