Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
-------
LƢU THỊ CƢ
PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN
MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE)
NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng có ai công
bố trong bất kỳ một công trình nào khác.
Tác giả Lưu Thị Cư
Lưu Thị Cư
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
1.1. VAI TRÒ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA ................................ 3
1.1.1. Sơ lƣợc về cây mía ............................................................................................. 3
1.1.2. Tình hình sản xuất mía ở Việt Nam ................................................................ 4
1.2. SINH TỔNG HỢP SUCROSE ........................................................................... 5
1.3. VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO .............................................. 8
1.5. ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP RNAi (RNA
INTERFERENCE) .................................................................................... 10
1.5.1. Nguồn gốc RNAi .............................................................................................. 10
1.5.2. Cơ chế gây bất hoạt gen .................................................................................. 10
1.6. KỸ THUẬT GATEWAY
®
............................................................................... 12
1.7. NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA ........... 14
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 16
2.1. NGUYÊN LIỆU................................................................................................... 16
2.1.1. Nguyên liệu thực vật ........................................................................................ 16
2.1.2. Các chủng plasmid và enzyme ....................................................................... 16
2.1.3. Hóa chất khác .................................................................................................... 16
2.1.3. Các thiết bị máy móc ....................................................................................... 17
2.2. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................................. 17
2.2.1. Thiết kế mồi....................................................................................................... 17
2.2.2. Tách RNA tổng số ............................................................................................ 18
2.2.3. RT-PCR .............................................................................................................. 18
AS Acetosyringone
A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
BAP 6-Benzyl Amino Purine (Benzyladeninpurin)
bp Cặp base
cDNA Complementary DNA = DNA bổ sung đƣợc tổng hợp bằng
khuôn mRNA
cs Cộng sự
DEPC Diethyl pyrocarbonat
DNA Deoxyribonucleic Acid
dNTP deoxynucleosit triphotphat (deoxynucleoside triphosphate)
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
EtBr đEtBrEthiium bromide
E.coli Escherichia coli
gus β-glucuronidase
IBA Indole-3-Butyric Acid
kb kilo base
LB Luria and Bertani
MS Môi trƣờng nuôi cấy theo Murashige và Skoog
NAA Naphthalene Acetic Acid
OD Giá trị mật độ quang (optical density)
PCR Polymerase Chaine Reaction = Phản ứng chuỗi Polymerase
RNA Ribonucleic Acid
RNase Ribonuclease
RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR
SDS Sodium dodecylsulfat
TAE Tris-acetate-EDTA
Taq Thermus aquaticus DNA (polymerase)
2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC BẢNG
với trình tự Invertase trong ngân hàng gen có mã số
AY302083 .................................................................................................. 31
Hình 3.5. Mô hình cấu trúc chuyển gen INV_RNAi ........................................... 32
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid INV_RNAi tổ hợp với
HindIII và XbaI ......................................................................................... 34
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR plasmid INV-RNAi trong
A.tumefaciens với cặp mồi đặc hiệu 5’INV và 3’INV ....................... 35
Hình 3.8. Quy trình tái sinh mía ROC10 in vitro từ mô sẹo ................................ 37
Hình 3.9. Biến nạp gen gus-intron vào cây mía ROC10 in vitro thông
qua trung gian A.tumefaciens ................................................................. 39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
MỞ ĐẦU
Đƣờng là một nhu cầu cần thiết trong đời sống con ngƣời. Theo thống
kê, nhu cầu tiêu thụ đƣờng trên thế giới trung bình tính theo đầu ngƣời là 35
kg/1 ngƣời/1 năm. Tại Việt Nam, năm 1994 là 8 kg/1 ngƣời/1 năm, hiện nay
là 15 kg/1 ngƣời/1 năm và dự kiến nhu cầu về đƣờng còn tiếp tục tăng nữa.
Tại các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới nhƣ Việt Nam, 75% sản lƣợng
đƣờng đƣợc sản xuất từ cây mía. Mía là một trong số ít loài thực vật tích trữ
chủ yếu đƣờng sucrose (α-D-glucopyranosyl-1, 2-D-fructofuranose), nguồn
nguyên liệu ban đầu để sản xuất đƣờng. Do đó, ở Việt Nam mía trở thành
một cây công nghiệp trọng yếu và là cây xóa đói giảm nghèo của chính phủ.
Tuy nhiên, các giống mía của Việt Nam có năng suất đƣờng chỉ đạt mức
trung bình của thế giới. Việc nhập các giống mía cao sản của thế giới kết
hợp với phƣơng pháp lai tạo truyền thống chƣa thực sự có hiệu quả trong
việc tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao lại phù hợp với điều kiện thổ
gen tiếp theo.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VAI TRÕ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA
1.1.1. Sơ lƣợc về cây mía
Mía (Saccharum L.) thuộc chi mía (Saccharum), họ hòa thảo
(Poaceae), bộ lúa (Poales), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae). Chúng là
những cây có thân to, mập, chia đốt cao từ 2 - 6 m. Các loại thực vật trong chi
này đa số là các loại cỏ sống lâu năm bao gồm khoảng 6 - 37 loài tùy theo hệ
thống phân loại, sống chủ yếu ở khu vực nhiệt đới và ôn đới trên thế giới [2].
Cây mía chứa hàm lƣợng đƣờng rất cao chiếm khoảng 46% khối lƣợng khô,
trong đó sucrose chiếm tới 80%. Chính vì thế, mía trở thành một trong những
cây công nghiệp quan trọng của ngành công nghiệp sản xuất đƣờng. Ngoài ra,
cây mía còn chứa các chất đạm (protein), chất bột (carbohydrate), chất béo
(lipid), các chất khoáng và các vitamin… vì thế mía còn có tác dụng thanh
nhiệt, giải khát, trợ giúp tiêu hóa, cung cấp năng lƣợng và các chất dinh
dƣỡng cần thiết cho cơ thể. Theo Đông y, mía là "vị thuốc" dùng để chữa một
số bệnh nhƣ ho khan, đại tiện táo, tiểu tiện bất lợi, đau dạ dày, an thai…
Mía còn là loại cây có tác dụng bảo vệ đất rất tốt, đặc biệt là chống xói
mòn đất cho các vùng đồi trung du. Hơn nữa, mía là cây rễ chùm và phát triển
mạnh trong tầng đất từ 0 - 60 cm (1 ha mía tốt có thể cho 13 - 15 tấn rễ sau
thu hoạch), đây là nguồn chất hữu cơ quý làm tăng độ phì của đất. Phần bã
mía chứa nhiều cellulose có thể dùng làm nguyên liệu đốt lò, hoặc làm bột
giấy, bìa các tông, ép thành ván dùng trong kiến trúc... Sản phẩm cặn bã còn
lại sau khi chế biến đƣờng (bùn lọc) có thể sử dụng để sản xuất nhựa, xêrin,
hậu Việt Nam nên năng suất thấp. Chính vì thế, Quyết định số 26/2007/QĐ-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5
TTg của Phó thủ tƣớng Nguyễn Sinh Hùng “Quy hoạch phát triển mía đƣờng
đến năm 2010 và định hƣớng đến năm 2020” đƣợc phê duyệt đã đƣa quan
điểm rõ ràng là: đồng thời với việc nhập khẩu giống mía có năng suất, trữ
đƣờng cao đƣợc đánh giá tốt phù hợp với Việt Nam thì phải xây dựng hệ
thống viện nghiên cứu và các trung tâm giống mía đủ điều kiện trang thiết bị
và năng lực cán bộ để chủ động sản xuất giống tốt, có năng suất, trữ lƣợng
đƣờng cao của Việt Nam, đáp ứng yêu cầu sản xuất [1].
1.2. SINH TỔNG HỢP SUCROSE
Trong lục lạp của mía có enzyme photphoenolpyruvat
-
cacboxilase hoạt
động rất mạnh. Sản phẩm đầu tiên của quang hợp ở mía là các axit
oxaloaxetic, malic, aspartic đều gồm có bốn nguyên tử cacbon trong phân tử,
do đó mía đƣợc gọi là thực vật C
4
[5]. Chu trình C
4
(hay cơ chế Hatch-Slack)
là cơ chế có sự chuyên hoá trong việc thực hiện chức năng quang hợp của
cây C
4
: một loại lục lạp chuyên trách cố định CO
2
, còn một loại lục lạp
chuyên khử CO
2
sucrose đƣợc tổng hợp. Các enzyme này xúc tác cho các dạng phản ứng:
(1) Tổng hợp sucrose nhƣ sucrose 6-phosphatephosphatase (SPS) hoặc
sucrosesynthase (SS)
(2) Thủy phân sucrose nhƣ β-fructofuranosidase (Invertase)
(3) Vận chuyển các hexose tới tế bào chất và chuyển hóa lại thành sucrose
nhƣ pyrophosphate fructose 6-phosphat 1 phosphostransferase (PFP) [6].
Hình 1.1: Chu trình sinh tổng hợp sucrose với sự tham gia của các
enzyme chính
SUCROSE 6’-P
FRUCTOSE
GLUCOSE 6-P
ATP
FRUCTOSE 1.6-P2
GLUCOSE 1-P
UDP-GLUCOSE
UTP
SUCROSE
FRUCTOSE 6-P
GLUCOSE
ADP
UDP
UDP
ADP
ATP PPi
Pi
Pi
Invertase
SPS
SS
cho phản ứng tổng hợp sucrose sẽ tăng, dẫn tới lƣợng sucrose cũng tăng
tƣơng ứng. Ảnh hƣởng này đã đƣợc chứng minh trên các dòng mía có mang
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8
cấu trúc antisense làm bất hoạt PFP. Lƣợng sucrose trên các cây mía chuyển
gen còn non tăng khoảng 50%. Tuy nhiên, khi phân tích trên các cây trƣởng
thành, tổng lƣợng sucrose tăng, nhƣng chƣa đáng kể so với đối chứng [11].
Những nghiên cứu trên đã chứng tỏ đƣợc vai trò quan trọng của các enzyme
SPS, PFP, Invetase trong việc tổng hợp và tích lũy sucrose ở thực vật.
1.3. VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO
Theo thuyết vận chuyển đƣờng (hay thuyết Turgeon), đƣờng sucrose
đƣợc tổng hợp ở tế bào chất của các tế bào thịt lá trong quang hợp sẽ đƣợc
vận chuyển ra không bào, sau đó nhờ hệ thống cấu trúc liên kết giữa các tế
bào (sợi liên bào và cầu sinh chất hay plasmodesmata) nó sẽ đƣợc chuyển từ
tế bào này sang tế bào khác và nhờ ống dẫn phloem mà sucrose đi tới khắp
các cơ quan của thực vật bằng con đƣờng khuyếch tán. Các phân tử nhỏ
sucrose trong ống dẫn phloem sẽ đƣợc polyme hóa thành những phân tử
đƣờng lớn và phức tạp hơn, lúc này các phân tử đƣờng đƣợc đẩy ra xa khỏi lá
đến những phần khác của cây, nơi mà nó đƣợc sử dụng hay tích trữ lại, và do
kích thƣớc của nó quá lớn nên nó không thể chuyển ngƣợc trở về lá. Chính cơ
chế khuếch tán này đã tạo nên sự vận chuyển liên tục sucrose từ các cơ quan
quang hợp (source tissue) tới các cơ quan dự trữ (sink tissue). Bên cạnh đó,
sucrose còn đƣợc vận chuyển và tích trữ tại không bào làm nguyên liệu cho
chu trình sinh tổng hợp tinh bột. Ngoài lƣợng sucrose đƣợc vận chuyển liên
tục, một phần sucrose sẽ đƣợc phân hủy nhằm cung cấp năng lƣợng cho quá
trình sinh trƣởng và phát triển, đồng thời tái tạo các cơ chất khác.
1.4. ENZYME INVERTASE (β-FRUCTOFURANOSIDASE)
Invertase (β-fructofuranosidase) đƣợc mã hóa bởi 5 - 10 đồng phân tùy
thuộc từng loài thực vật khác nhau. Cây mô hình Arabidopsis thaliana có 5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
10
Nhƣ vậy, Invertase đƣợc xem nhƣ là một chiếc chìa khoá điều chỉnh sự
tích lũy sucrose dự trữ trong thực vật. Do đó, ức chế biểu hiện của Invertase
có thể tăng tích lũy sucrose trong cây mía.
1.5. ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP RNAi (RNA
INTERFERENCE)
1.5.1. Nguồn gốc RNAi
RNAi là một cơ chế căn bản để kiểm soát chuỗi thông tin di truyền hay
cách vô hiệu hoá hoạt động của các gen xác định do hai nhà khoa học Andrew
Z. Fire và Craig C. Mello khám phá ra và công bố trên tạp chí Nature vào
ngày 19/12/1998 [4]. Andrew Fire và Craig Mello đã nghiên cứu cơ chế điều
khiển biểu hiện gen ở giun tròn (Caenorhabditis elegans) và cho rằng khi
mRNA “chiều dịch mã” và “chiều đối mã” gặp nhau thì chúng sẽ kết hợp lại
thành những mRNA sợi kép. Hai ông đã kiểm chứng lại giả thuyết của mình
bằng cách tiêm các phân tử mRNA sợi kép chứa các mật mã di truyền quy
định nhiều protein khác của giun tròn. Kết quả đều thu đƣợc protein đƣợc mã
hóa bởi các gen đó không đƣợc tổng hợp. Qua đó Fire và Mello đã rút ra đƣợc
kết luận rằng có thể RNA dạng chuỗi kép đã làm các gen bị bất hoạt. Công
trình đƣợc công bố và đƣợc trao giải Nobel Y học năm 2006.
1.5.2. Cơ chế gây bất hoạt gen
RNAi (RNA interference) đƣợc coi nhƣ một phƣơng thức miễn dịch tự
nhiên giúp sinh vật chống lại sự xâm nhập của virus RNA bằng cách phân
huỷ các trình tự nucleotide tƣơng đồng của chúng [8]. Nó làm trung gian
kháng lại cả acid nucleic ngoại bào và nội bào, cũng nhƣ điều khiển sự biểu
hiện gen mã hóa protein. Nó đƣợc thực hiện khi có sự xuất hiện của phân tử
RNA mạch kép trong cơ thể sinh vật gây nên ức chế sự biểu hiện gen của một
loại trình tự đặc hiệu.
có hiệu quả trong việc chuyển gen phòng chống bệnh do virus, vi khuẩn, hay
làm tăng cƣờng, ức chế một tính trạng mong muốn nào đó ở sinh vật.
Phƣơng pháp này đã đƣợc ứng dụng thành công để thay đổi thành phần chất
béo trong dầu, loại caffein trong cà phê, tăng hàm lƣợng lysine trong ngô
hoặc loại các chất gây dị ứng ở táo và cà chua [19, 20, 25]. RNAi là một
hƣớng mới cho phép các nhà khoa học nghiên cứu những ứng dụng trong
các liệu pháp trị bệnh cho con ngƣời trong tƣơng lai cũng nhƣ phân tích
chức năng hệ gen cây trồng v.v...
1.6. KỸ THUẬT GATEWAY
Kỹ thuật Gateway (Invitrogen) là một kỹ thuật dòng hóa phổ biến, nó
mang lại hiệu quả cao và nhanh chóng khi phân tích chức năng, biểu hiện
protein và dòng hóa đoạn DNA. Kỹ thuật này cho phép chuyển đoạn DNA
giữa các vector tách dòng khác nhau mà vẫn duy trì định hƣớng chính và cấu
trúc đọc, thay thế việc sử dụng các enzyme giới hạn và các enzyme nối hiệu
quả trong thời gian ngắn. Kỹ thuật này có hiệu quả cao (90%) đối với việc
tách dòng có định hƣớng của các sản phẩm PCR. Hơn nữa các phản ứng đơn
giản, dễ thực hiện, nhanh, mạnh và tự động. Đây là kỹ thuật hữu ích cho
những đặc tính tái tổ hợp đặc hiệu vị trí của vi khuẩn lambda, giúp cho phản
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
ứng tái tổ hợp lambda (Lambda reconstruction: LR) xảy ra một cách hiệu quả
và gắn các đoạn trình tự DNA vào nhiều hệ thống vector. Hình 1.3. Sơ đồ mô tả kỹ thuật Gateway
- Kỹ thuật Gateway đƣợc thực hiện bởi hai bƣớc chính:
+ Tạo dòng tiếp nhận “entry clone” bằng cách chèn gen biểu hiện
(expression gene) vào vector tiếp nhận (pENTR/D).
+ Tạo dòng biểu hiện (expression clone) bằng cách tái tổ hợp giữa
Manickavasagam và cs (2004) tái sinh và chuyển gen thành công ở mía
thông qua A.tumefaciens từ các mô phân sinh của chồi bằng con đƣờng tạo đa
chồi với hiệu quả thu đƣợc là 49,6% cây chuyển gen [22]. Lây nhiễm
A.tumefaciens vào các mô non đã bị làm thƣơng của mía trong 10 phút. Sau
đó thấm khô trên giấy thấm và đặt lên môi trƣờng MS trong 3 ngày. Các mô
đƣợc diệt khuẩn bằng nƣớc cất khử trùng có bổ sung 500 mg/l cefotaxime.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
Ông tạo đƣợc các cây chuyển gen trên các môi trƣờng chọn lọc tái sinh có bổ
sung 5 mg/l ppt.
Santosa và cs (2004) chuyển gen thành công vào mô sẹo của mía thông
qua A.tumefaciens GV2260. Kết quả kiểm tra các cây sau chọn lọc thấy rằng
có khoảng 85 - 100% cây sống sót có mang gen chuyển [34]. Mô sẹo đƣợc tạo
từ đoạn thân non trên môi trƣờng [4,3 g/l MS + 30 g/l sucrose + 0,5 g/l NZ-
amine + 0,3 ml vitamin (0,1 g / 75 ml hydrochloride thiamine; 0,05 g / 75 ml
biotin; 1 g / 75 ml pyrodoxine hydrochlorid; 0,25 g / 75 ml myo-inositol) + 3
mg/l 2,4D + 100 ml nƣớc dừa + 8 g/l agar, pH = 5,8] trong điều kiện tối, 1
tháng. Trƣớc 7 giờ biến nạp với A.tumefaciens bổ sung thêm 75 μl chất chống
ôxyhóa vào dịch khuẩn. A.tumefaciens đƣợc hòa tan với môi trƣờng cảm ứng
tạo chồi có bổ sung 5 ml chất chống ôxyhóa với OD
578
= 0,2 và đƣợc lây
nhiễm với các mảnh mô sẹo nhỏ (2 - 3 mm) trong 5 - 10 phút. Diệt khuẩn và
chuyển mô sẹo lên môi trƣờng có bổ sung 500 mg/l cefotaxime ở 28
o
C, lắc
60 vòng/2 ngày. Cây chuyển gen đƣợc tạo thành với các môi trƣờng chọn lọc
có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 100 mg/l kanamycin.
Zhangsun và cs (2007) tái sinh và chuyển gen ở mía từ mô sẹo thông qua
TM
/D-
TOPO
2580 Kanamycin Invitrogen (Mỹ)
pK7GWIWG2(II)
12904
Spectinomycine,
streptomycine
Trƣờng Đại học
Ghent (Bỉ)
- Các chủng vi khuẩn: E.coli One Shot TOP 10 và A.tumefaciens chủng
CV58C1 mang plasmid pGV2260
- Các enzyme giới hạn: HindIII , XbaI của hãng New England Biolabs
- Các enzyme T
4
ligase, T
4
kinase do hãng Fermentas cung cấp
2.1.3. Hóa chất khác
- Cặp mồi 3
’
INV/5
’
INV nhân đoạn gen mã hóa enzyme Invertase và
cặp mồi M13for/rev kiểm tra sự có mặt của gen Invertase trong vector tách
Copyright: Tài liệu đại học ©