Phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông
máu IX của người ở vi khuẩn E. coli

Nguyễn Văn Phòng

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Người hướng dẫn: PGS.TS. Nông Văn Hải
Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Tách chiết được RNA tổng số từ mô gan sinh thiết của người. Phân lập
được đoạn cDNA mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô người. Thiết kế được vector biểu
hiện mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người. Chuyển và biểu
hiện vector mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn
E. coli.

Keywords: Sinh học phân tử; Gen mã hóa; Di truyền học hóa sinh

Content
MỞ ĐẦU
“Thu hẹp khoảng cách - Kết nối cộng đồng” là thông điệp được đưa ra tại Lễ mít tinh
hưởng ứng ngày Hemophilia thế giới (17/4/) diễn ra tại Hà Nội, với mong muốn cải thiện tình
hình chăm sóc bệnh nhân bị bệnh Hemophilia (hay còn gọi là bệnh máu khó đông) trên phạm
vi toàn cầu, hướng tới mục tiêu tất cả người bệnh máu khó đông đều có cơ hội được điều trị
và chăm sóc tốt. Ở Việt Nam, theo thống kê của Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương
ước tính hiện nay có khoảng 6.000 bệnh nhân bị bệnh Hemophilia, trong đó mới chỉ 20%
bệnh nhân được phát hiện và chăm sóc thường xuyên. Hemophilia là một rối loạn chảy máu di
truyền do bất thường gen gây nên, bệnh nhân bị chảy máu khó cầm ở khắp các bộ phận trên
cơ thể, đặc biệt là cơ và khớp. Bệnh xuất hiện do cơ thể thiếu hụt hoặc không có đủ các yếu tố
làm đông máu, thường gặp là yếu tố VIII (hemophilia A) và IX (hemophilia B).
Trên thế giới, việc nghiên cứu và sử dụng các thuốc giúp làm máu đông nhanh để điều

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về bệnh Hemophilia
1.1.1. Giới thiệu chung về bệnh Hemophilia
Hemophilia là một bệnh rối loạn đông máu di truyền mà trong dân gian thường hay
gọi là “bệnh máu loãng”, “bệnh máu không đông” hoặc “bệnh máu khó cầm”. Bệnh này đặc
trưng bởi sự thiếu hụt hoặc không có một trong các protein cần thiết cho quá trình đông máu.
Một số người mắc bệnh Hemophilia do thiếu hụt yếu tố đông máu VIII, được gọi là
Hemophilia A. Một số khác do thiếu yếu tố đông máu IX, được gọi là Hemophilia B. Ngoài
ra, có tỷ lệ rất hiếm người mắc bệnh Hemophilia C, bệnh do thiếu hụt yếu tố đông máu XI.
1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh Hemophilia
Hemophilia là bệnh rối loạn chảy máu di truyền, được gây ra bởi đột biến trong các
gen mã hóa cho các yếu tố đông máu VIII, IX và XI. Tuy nhiên, có khoảng 30% trường hợp
mắc bệnh Hemophilia được sinh ra từ một gia đình không có tiền sử về bệnh Hemophilia
trước đó.
1.1.3. Phân loại Hemophilia
Bệnh Hemophilia có thể được chia làm 3 loại chính: Hemophilia A, Hemophilia B và
Hemophilia C.
1.1.4. Biểu hiện của bệnh Hemophilia
Biểu hiện của bệnh rất đa dạng: chảy máu bất thường, tự nhiên hoặc sau phẫu thuật, có
thể xảy ra ở bất cứ vị trí nào trên cơ thể tuy nhiên cơ và khớp thường hay bị chảy máu hơn
đến nỗi nhiều người bệnh nhầm tưởng là bệnh của cơ, khớp.
1.1.5. Phƣơng pháp điều trị bệnh Hemophilia

3
Đến nay, bệnh này vẫn chưa thể điều trị tận gốc. Người bệnh phải phụ thuộc vào các
loại thuốc đặc trị và bổ sung suốt đời các yếu tố đông máu lấy từ nguồn máu hiến và họ có thể
chung sống với bệnh.
1.2. Vai trò của yếu tố đông máu IX trong quá trình đông máu
Được tổng hợp chủ yếu ở gan sau đó được tiết vào máu, yếu tố đông máu IX đóng vai
trò rất quan trọng trong việc hoạt hóa yếu tố đông máu X thành dạng hoạt hóa Fxa.


4
Đối với dược phẩm sinh học tái tổ hợp, hệ thống biểu hiện có thể là hệ thống nhân sơ
(prokaryote) hoặc nhân chuẩn (eukaryote).
1.9. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Hướng nghiên cứu biểu hiện gen/protein có giá trị để tiến tới sản xuất sinh phẩm sử
dụng trong y dược là hướng rất quan trọng, cấp thiết mới được tiếp cận nghiên cứu ở nước ta
trong thời gian gần đây.
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
 Mẫu nghiên cứu
Các mẫu gan sinh thiết được lấy từ những người Việt Nam khỏe mạnh do bệnh viện K
cung cấp.
 Chủng vi sinh vật
 Chủng E.coli DH5α của hãng Invitrogen được sử dụng để chọn dòng và nhân dòng
gen.
 Chủng E. coli BL21(DE3) của hãng Bio-Rad được sử dụng để biểu hiện gen mã hóa
yếu tố đông máu IX ở người.
 Các vector
 Vector tách dòng: pJET1.2/blunt (Fermentas).
 Vector biểu hiện: pET32a (Novagen).
 Các cặp mồi
Các cặp mồi dùng để phân lập, chọn dòng và biểu hiện gen được thiết kế dựa trên trình
tự cDNA chuẩn công bố trên Genbank (NM_000133) và đặt tổng hợp hãng IDT (Mỹ) có trình
tự như sau:
Bảng 1. Trình tự các cặp mồi được sử dụng.
STT
Tên mồi
Trình tự nucleotide
1

hãng Promega (Mỹ), Invitrogen (Mỹ).
 Trang thiết bị
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các trang thiết bị của Viện Công
nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu hệ gen.
2.2. Phƣơng pháp
2.2.1. Tách chiết RNA tổng số
Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô gan sinh thiết người bằng Trizol.
2.2.2. Tổng hợp cDNA
cDNA sợi một được tổng hợp từ khuôn RNA tổng số được tiến hành theo hướng dẫn
của Kit tổng hợp cDNA SuperScript
TM
First-Strand Synthesis System for RT-PCR
(Invitrogen).
2.2.3. Nhân đoạn cDNA bằng phản ứng PCR
2.2.4. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose
2.2.5. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế
Sử dụng các enzyme giới hạn cắt phân tử DNA thành hai mảnh dạng đầu bằng hay đầu
dính tại các vị trí xác định nhờ trình tự nhận biết đặc hiệu.
2.2.6. Tinh chế các đoạn DNA trên gel agarose
Các sản phẩm PCR bằng cách điện di chúng trên gel 0,8% agarose, sau đó cắt phần gel
có băng DNA mong muốn và thu lại DNA bằng Kit tinh sạch Wizard
®
SV.
2.2.7. Ghép nối DNA
Dưới sự xúc tác của enzyme T4 DNA ligase, các cầu nối phosphodieste sẽ được hình
thành giữa hai nucleotide sát cạnh nhau trên cùng một mạch (gốc phosphat đầu 5’ của
nucleotide đoạn DNA này với gốc hydroxyl đầu 3’ của nucleotide của đoạn DNA kia), đồng
thời giải phóng một phân tử nước.
2.2.8. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phƣơng pháp sốc nhiệt
Dưới tác dụng của CaCl

cảm ứng. Tế bào được thu bằng cách ly tâm 6.000 vòng/phút trong thời gian 5 phút. Màng
ngoài tế bào được phá bằng siêu âm. Mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp được kiểm tra
bằng điện di SDS-PAGE.
2.2.12. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE
SDS-PAGE được thực hiện theo phương pháp của Laemmli UK, 1970 với các thiết bị
của hãng Bio-Rad. Để phân tách các protein có trọng lượng từ 12 - 68 kDa, chúng ta sử dụng
gel ở nồng độ 12,6% (w/v).
2.3.1. Sơ đồ thí nghiệm
Nội dung nghiên cứu được chia làm hai phần và thực hiện qua các bước sau:
a. Phân lập gen mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô gan sinh thiết ở người.
b. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa FIX
noSP
và biểu hiện trong tế bào vi
khuẩn E. coli BL21(DE3).
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập gen mã hóa yêu tố đông máu IX ở ngƣời
3.1.1. Thu thập mẫu mô gan sinh thiết ngƣời
Do yếu tố đông máu IX người được tổng hợp chủ yếu ở các tế bào mô gan nên chúng
tôi đã chọn mô gan làm nguyên liệu nghiên cứu. Phối hợp với Bệnh viện K, chúng tôi đã chọn
được mẫu mô gan sinh thiết từ 2 trong số 7 người.
3.1.2. Tách chiết RNA tổng số
Sản phẩm RNA tổng số tách chiết từ 2 mẫu mô gan sinh thiết bằng phương pháp trizol
được điện di biến tính trên gel agarose 1% (Hình 1). Kết quả điện di thể hiện rõ các băng 28S,
18S và 5S rRNA, không có hiện tượng bị phân hủy do quá trình tách chiết.

7

Hình 1. Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số trên gel agarose 1%.
1 - 2: Sản phẩm RNA tổng số của 2 mẫu mô gan sinh thiết người.
Như vậy, chúng tôi đã tách chiết được RNA tổng số từ 2 mẫu mô sinh tiết gan ở


Hình 3. Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 0,8%.
1: Đối chứng âm (vector pJET1.2 không mang đoạn đoạn sản phẩm RT-PCR); 2- 12:
Plasmid tái tổ hợp của 3 dòng vi khuẩn mang (giếng số 2, 4 và 9) và không mang sản
phẩm RT-PCR (giếng số 3, 5, 6, 7, 8, 10, 11 và 12).
 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hạn chế

Hình 4. Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang cDNA của gen FIX
bằng enzyme hạn chế XbaI và XhoI.
M: Marker 1kb (Fermentas); 1: Sản phẩm PCR của cDNA mã hóa FIX; 2, 3, 4: Sản phẩm xử
lý pJET1.2/FIX_p18; pJET1.2/FIX_p19, pJET1.2/FIX_p22 bằng XbaI + XhoI; 5: Sản phẩm
xử lý pJET1.2/XbaI + XhoI.
Chúng tôi đã tiến hành xử lý plasmid của các dòng số hai, bốn và chín (ký hiệu: dòng
pJET1.2/FIX_p18, pJET1.2/FIX_p19 và pJET1/FIX_p22) bằng hai enzyme hạn chế XbaI và
XhoI. Kết quả cho thấy, plasmid của 3 dòng này khi được xử lý bằng hai enzyme nói trên đã
cho hai băng: một băng có kích thước khoảng 3,0 kb (tương đương với kích thước của vector
pJET1.2) và một băng có kích thước khoảng 1,4 kb (tương đương kích thước của sản phẩm
PCR) (Hình 4).

9
Như vậy, đoạn cDNA mã hóa cho protein FIX đã được tách dòng thành công trong
vector pJET1.2. Các plasmid tái tổ hợp được tách chiết với lượng lớn và được tinh sạch cho
phản ứng xác định trình tự.
 Trình tự nucleotide của FIX
Để khẳng định chính xác sản phẩm tách dòng là đoạn cDNA của gen FIX, sản phẩm
được tiếp tục xác định trình tự nucleotide. Sau khi phân tích trình tự cả 3 dòng plasmid tái tổ
hợp, đoạn cDNA có chiều dài 1386 bp, khung dịch mã được xác định mã hóa yếu tố đông
máu IX gồm 461 amino acid kể cả mã kết thúc.
Khi so sánh trình tự cDNA đầy đủ của gen FIX được phân lập từ mô gan sinh thiết của
người Việt Nam với trình tự trên ngân hàng GenBank (NM_000133), chúng tôi thấy ở dòng

Vector pET32a và sản phẩm PCR sau khi được xử lý với hai enzyme hạn chế (NcoI và
XhoI) sẽ được tinh sạch và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trước khi thực hiện phản
ứng ghép nối với nhau (Hình 6).

10

Hình 6. Ảnh điện đi đồ sản phẩm PCR và vector pET32a sau khi
tinh sạch trên gel agarose 0,8%.
M: Marker 1 kb (Fermentas); 1: Sản phẩm PCR (FIX
noSP
)/ (NcoI và XhoI); 2: Vector
pET32a/( NcoI và XhoI).
Trên cơ sở kết quả điện di (Hình 6), vector pET32a và cDNA mã hóa FIX
noSP
được
ghép nối với nhau nhờ xúc tác của enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm phản ứng ghép nối gen
được biến nạp vào tế bào E.coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt và chọn lọc trên môi
trường có bổ xung kháng sinh Amp với nồng độ 100 μg/ml. Kết quả, chúng tôi đã nhận được
một số dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp.
3.2.3. Kiểm tra sự có mặt của cDNA mã hóa FIX
noSP
trong vector pET32a
Để xác định các dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp mong muốn, chúng tôi tiến hành
chọn lọc các khuẩn lạc mọc trên môi trường có kháng sinh Amp, nuôi cấy thu sinh khối để
tách DNA plasmid của các khuẩn lạc, cắt kiểm tra các plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hạn
chế (NcoI và XhoI) và giải trình tự gen.
a. Tách chiết DNA plasmid
Chúng tôi tiến hành nhặt 5 khuẩn lạc và sản phẩm tách chiết plasmid được kiểm tra
bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 7). Từ kết quả điện di sản phẩm DNA plasmid,
chúng tôi thấy cả 5 dòng vi khuẩn (2 3, 4 và 5) đều có kích thước lớn hơn kích thước đối

trong
vector tái tổ hợp pET32a/FIX
noSP

Chúng tôi đã lựa chọn một trong số ba dòng plasmid tái tổ hợp đã được cắt kiểm tra
thành công bằng enzyme trước đó để tiến hành giải trình tự nucleotide và so sánh với trình tự
cDNA (GenBank: NM_000133). Sau khi phân tích trình tự dòng plasmid tái tổ hợp này, đoạn
cDNA mã hóa FIX
noSP
có kích thước 1302 bp và khung dịch mã được xác định yếu tố đông
máu IX với chuỗi polypeptide cắt đoạn tín hiệu đầu N tương ứng với 433 amino acid.
Như vậy có thể kết luận, chúng tôi đã thiết kết thành công vector tái tổ hợp
pET32a/FIX
noSP
mang cDNA mã hóa cho FIX
noSP
và cấu trúc này đã được chọn dòng trong vi
khuẩn E. coli DH 5α.
3.3. Biểu hiện cDNA mã hóa FIX
noSP
ở vi khuẩn E. coli BL21(DE3)
Kết thúc thí nghiệm, chúng tôi thu được dịch tế bào có chứa protein tái tổ hợp. Để
kiểm tra kết quả biểu hiện chúng tôi đã tiến hành điện di biến tính protein trên gel
polyacrylamide 12,6% có SDS. Kết quả điện di protein tổng số của các mẫu được trình bày ở
Hình 9.
Kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp cho thấy, protein tổng số của các mẫu tế bào ở
phân đoạn không tan thu tại các thời điểm khác nhau sau khi được cảm ứng bằng IPTG (các
đường chạy từ 4 - 6), có xuất hiện một băng protein mới có khối lượng phân tử khoảng 67
kDa so với mẫu đối chứng sau khi cảm ứng bởi IPTG (các đường chạy từ 1 - 3). Như đã trình
bày ở trên, ở đây sản phẩm protein lai FIX

 Từ mô gan sinh thiết của người Việt Nam khỏe mạnh, chúng tôi đã tách được RNA
tổng số có chất lượng đảm bảo, làm nguyên liệu tổng hợp cDNA mã hóa cho FIX.
 Đã nhân được đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu ở người (FIX). Đoạn cDNA
mã hóa FIX có độ dài tương ứng khoảng 1,4 kb mã hóa 461 amino acid đã được tách
dòng và giải trình tự.
 Đã thiết kế được vector biểu hiện pET32a/FIX
noSP
mang đoạn cDNA mã hóa FIX
noSP

và biểu hiện được gen mã hóa cho yếu tố đông máu IX ở E. coli.
Kiến nghị
 Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện cDNA mã hóa FIX
noSP
trong vector pET32a ở vi khuẩn
E.coli.
 Nghiên cứu phương pháp biến tính, hồi tính cho protein dung hợp FIX
noSP
-Trx thể vùi
để thu được protein FIX
noSP
ở dạng tan. Từ đó, nghiên cứu phương pháp tinh sạch
protein FIX
noSP
để từng bước tiến tới sản xuất chế phẩm.

References
Tài liệu tiếng việt

13

Đình Thi, Nông Văn Hải (2010), “Biểu hiện yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (h-tPA)
người ở tế bào”, Kỷ yếu hội nghị sinh học phân và hóa sinh y học, tr. 185-191.

14
12. Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2005), “Tách dòng gen mã hóa
interleukin-2 của người”, Y học Việt Nam 310(5), tr. 26-30.
13. Nguyễn Thu Thúy, Trần Vân Khánh, Phạm Đăng Khoa, Tạ Thành Văn (2008), “Nghiên
cứu tách dòng gen mã hóa yếu tố đông máu VIII ở người”, Tạp chí nghiên cứu Y học,
tr. 7-12.
14. Nguyễn Thúy Hà, Nguyễn Bích Nhi, Đỗ Khắc Hiếu, Phan Văn Chi (2003), “Khả năng ức
chế các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro của Trichobakin tái tổ hợp”, Y học Việt
Nam, 284, tr. 26-30.
15. Vũ Ngọc Tân, Vũ Minh Đức, Lê Thị Lan Anh, Bùi Khánh Chi, Trương Nam Hải (2009),
“Biểu hiện gen mã hóa interleukin-2 của người trong tế bào Escherichia coli”, Tạp chí
Công nghệ sinh học, 7(1), tr. 35-39.
Tài liệu tiếng anh
16. Amphlett G. W., Kisiel W., Castellino F. J. (1981), "The interaction of Ca
2+
with human
Factor IX", Arch Biochem Biophys, 208(2), pp. 576-585.
17. Anson D. S., Choo K. H., Rees D. J., Giannelli F., Gould K., Huddleston J. A., Brownlee
G. G. (1984), "The gene structure of human anti-haemophilic factor IX", EMBO J,
3(5), pp. 1053-1060.
18. Bajaj S. P., Sabharwal A. K., Gorka J., Birktoft J. J. (1992), "Antibody-probed
conformational transitions in the protease domain of human factor IX upon calcium
binding and zymogen activation: putative high-affinity Ca
2+
-binding site in the
protease domain", Proc Natl Acad Sci U S A, 89(1), pp. 152-156.
19. Bovill E. G., Mann K. G. (1987), "Warfarin and the biochemistry of the vitamin K

505-518.
32. Furie B., Furie B. C. (2005), "Thrombus formation in vivo", J Clin Invest, 115(12), pp.
3355-3362.
33. Galeffi P., Brownlee G. G. (1987), "The propeptide region of clotting factor IX is a signal
for a vitamin K dependent carboxylase: evidence from protein engineering of amino
acid -4", Nucleic Acids Res, 15(22), pp. 9505-9513.
34. Green P. M., Bentley D. R., Mibashan R. S., Nilsson I. M., Giannelli F. (1989),
"Molecular pathology of haemophilia B", EMBO J, 8(4), pp. 1067-1072.
35. Hoag H., Gore J., Barry D., Mueller C. (1999), "Gene therapy expression vectors based on
the clotting Factor IX promoter", Gene Ther, 6(9), pp. 1584-1589.
36. Hoffman M., Monroe D. M., 3rd (2001), "A cell-based model of hemostasis", Thromb
Haemost, 85(6), pp. 958-965.
37. Hoffman M., Monroe D. M., Oliver J. A., Roberts H. R. (1995), "Factors IXa and Xa play
distinct roles in tissue factor-dependent initiation of coagulation", Blood, 86(5), pp.
1794-1801.

16
38. Kaufman R. J. (1998), "Post-translational modifications required for coagulation factor
secretion and function", Thromb Haemost, 79(6), pp. 1068-1079.
39. Kurachi K., Davie E. W. (1982), "Isolation and characterization of a cDNA coding for
human factor IX", Proc Natl Acad Sci U S A, 79(21), pp. 6461-6464.
40. Laemmli U. K. (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4", Nature, 227(5259), pp. 680-685.
41. LaVallie E. R., DiBlasio E. A., Kovacic S., Grant K. L., Schendel P. F., McCoy J. M.
(1993), "A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body
formation in the E. coli cytoplasm", Biotechnology (N Y), 11(2), pp. 187-193.
42. Lawson J. H., Mann K. G. (1991), "Cooperative activation of human factor IX by the
human extrinsic pathway of blood coagulation", J Biol Chem, 266(17), pp. 11317-
11327.
43. Lenting P. J., Christophe O. D., Maat H., Rees D. J., Mertens K. (1996), "Ca

52. Siguret V., Amselem S., Vidaud M., Assouline Z., Kerbiriou-Nabias D., Pietu G.,
Goossens M., Larrieu M. J., Bahnak B., Meyer D., et al. (1988), "Identification of a
CpG mutation in the coagulation factor-IX gene by analysis of amplified DNA
sequences", Br J Haematol, 70(4), pp. 411-416.
53. Singh S. M., Panda A. K. (2005), "Solubilization and refolding of bacterial inclusion body
proteins", J Biosci Bioeng, 99(4), pp. 303-310.
54. Sona P.S, Lingam C. M. (2010). "Hemophilia: An overview", International journal of
pharma ceutical review and rechear, 5, pp. 18-26.
55. Stenina O., Pudota B. N., McNally B. A., Hommema E. L., Berkner K. L. (2001),
"Tethered processivity of the vitamin K-dependent carboxylase: factor IX is efficiently
modified in a mechanism which distinguishes Gla's from Glu's and which accounts for
comprehensive carboxylation in vivo", Biochemistry, 40(34), pp. 10301-10309.
56. Studier F. W., Moffatt B. A. (1986), "Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct
selective high-level expression of cloned genes", J Mol Biol, 189(1), pp. 113-130.
57. Sunnerhagen M. S., Persson E., Dahlqvist I., Drakenberg T., Stenflo J., Mayhew M.,
Robin M., Handford P., Tilley J. W., Campbell I. D., et al. (1993), "The effect of
aspartate hydroxylation on calcium binding to epidermal growth factor-like modules
in coagulation factors IX and X", J Biol Chem, 268(31), pp. 23339-23344.
58. Suttie J. W. (1980), "Mechanism of action of vitamin K: synthesis of gamma-
carboxyglutamic acid", CRC Crit Rev Biochem, 8(2), pp. 191-223.
59. Wang L., Zoppe M., Hackeng T. M., Griffin J. H., Lee K. F., Verma I. M. (1997), "A
factor IX-deficient mouse model for hemophilia B gene therapy", Proc Natl Acad Sci
U S A, 94(21), pp. 11563-11566.
60. Wasley L. C., Rehemtulla A., Bristol J. A., Kaufman R. J. (1993), "PACE/furin can
process the vitamin K-dependent pro-factor IX precursor within the secretory
pathway", J Biol Chem, 268(12), pp. 8458-8465.
61. Wojcik E. G., Van Den Berg M., Poort S. R., Bertina R. M. (1997), "Modification of the
N-terminus of human factor IX by defective propeptide cleavage or acetylation results
in a destabilized calcium-induced conformation: effects on phospholipid binding and
activation by factor XIa", Biochem J, 323 (3), pp. 629-636.