BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP
***
Chương trình Trọng điểm Phát triển và Ứng dụng Công nghệ Sinh học
trong Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đến năm 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

“Phân lập và thiết kế các vector mang gen điều khiển tính chịu
hạn phục vụ công tác tạo giống cây trồng chuyển gen” Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ nhiệm đề tài
(Ký tên) (Ký tên và đóng dấu)
TS. Phạm Xuân Hội

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Nông nghiệp và PTNT
DRE/CRT Yếu tố C lặp lại đáp ứng hạn
DREB Protein liên kết đáp ứng hạn
E.coli Escherichia coli
EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid
ERD Đáp ứng hạ
n sớm
ERF Nhân tố liên kết yếu tố đáp ứng hạn ethylen
EtBr Ethidium bromide
Rnase Ribonuclease
kb Kilo base
LB Luria – Bertani
MCS Vị trí đa điểm cắt
MS Môi trường cơ bản theo Murashinge và Skoog
NAA Naphthaleneacetic acid
NOS Nopaline Synthetase
OD Optical density
PCR Polymerase Chain Reaction
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
TAE Tris-acetate- EDTA
T-ADN ADN chuyển
Ti-plasmid Plasmid gây khối u thực vật
Vir Vùng gây độc có khả năng tạo khối u
v/p vòng/ phút
2,4-D 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các gen tăng cường biểu hiện bởi stress hạn và mã hoá cho chuỗi
polypeptide của các protein có chức năng đã biết

= 0,005 theo chương trình Microsoft Excel 2007 khả năng tạo callus của 32
giống lúa
103
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát khả năng tái sinh của 32 giống lúa trên các môi
trường có bổ sung BAP, kinetin và casein ở các nồng độ khác nhau
104
Bảng 3.6. Kết quả phân tích Anova hai nhân t
ố 3 lần lặp lại với mức ý nghĩa α =
0,005 theo chương trình Microsoft Excel 2007 khả năng tái sinh của 32 giống lúa
104
Bảng 3.7. Trình tự các mồi được sử dụng kiểm tra sự tồn tại của gen trong vi khuẩn
A. Tumefaciens
106
Bảng 3.8. Tóm tắt kết quả biến nạp vector chuyển gen vào vi khuẩn
Agrobacterium
106
Bảng 3.9. Kết quả số callus sống sót trên các môi trường chọn lọc lần I, II và
số callus có chồi tái sinh trên môi tr
ường tái sinh được biến nạp với các vector
chuyển gen khác nhau của giống lúa Chành Trụi.
110
Bảng 3.10. Kết quả phân tích sự tồn tại của gen quan tâm trong các cây lúa
Chành trụi chuyển gen
112
Bảng 3.11. Khả năng giữ nước và phục hồi của các dòng cây chuyển gen/ cây
đối chứng
113
Bảng 3.12. Một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây chuyển gen và cây đối chứng
114
Bảng 3.13. Kết quả số callus sống sót trên các môi trường chọn lọc lần I, II và

Hình 1.2: Mô hình quá trình phiên mã
11
Hình 1.3: Hệ thống điều khiển phiên mã của vùng ADN đặc hiệu và nhân tố
phiên mã điều khiển biểu hiện các gen chức năng tham gia phản ứng chống chịu
với điều kiện bất lợi ở Arabidopsis
12
Hình 1.4: Bản đồ Ti- plasmid dạ
ng octopin
21
Hình 1.5: Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật
22
Hình 2.1: Sơ đồ sinh tổng hợp ADNc (A) và adapter (B) để tạo ra các ADNc có
chiều xác định

38
Hình 3.1: Kết quả điện di ARN trên gel agarose biến tính
52
Hình 3.2: Kết quả sinh tổng hợp sợi 1 và sợi 2 cDNA sử dụng sợi khuôn là mARN
của lúa Mộc tuyền (A) và Ngô tẻ vàng (B)
53
Hình 3.3: Kiểm tra nồng độ cDNA có chiều xác định trên đĩa agarose có bổ sung Etbr
53
Hình 3.4: Điện di kiể
m tra sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu vector kiểm tra đại
diện kích thước thư viện sơ cấp ở lúa
54
Hình 3.5: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu vector kiểm tra đại
điện kích thước thư viện sơ cấp ở ngô
55
Hình 3.6: Kết quả chuẩn hóa thư viện sau khi khuếch đại ở các nồng độ pha loãng

Hình 3.16: Điện di sản phẩm nhân bản gen OsDREB2A
67
Hình 3.17: Ảnh điện di sản phẩm cắt giới hạn và sản phẩm PCR khuẩn lạc mang gen
OsDREB2A
68
Hình 3.18: Trình tự nucleotide và axit amin dự đoán của gen OsDREB2A
69
Hình 3.19: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản gen ZmDREB2A trên gel
agarose 1%
70
Hình 3.20: Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn bằ
ng BamHI trên gel
agarose 1%
74
Hình 3.21: Trình tự nucleotide và axit amin dự đoán của gen ZmDREB2A
72
Hình 3.22: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản gen OsDREB1A
73
Hình 3.23: Kiểm tra plasmid tái tổ hợp
74
Hình 3.24: Trình tự nucleotide và axit amin của gen OsAREB1A
74
Hình 3.25: Điện di kiển tra sản phẩm tách ADN tổng số của lúa Mộc Tuyền và
ngô nếp
75
Hình 3.26: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản promoter từ ADN tổng số
của lúa và ngô trên gel agarose 1%
76
Hình 3.27: Sơ đồ thi
ết kế vector pBIG-Lip9

nhân tố phiên mã
93
Hình 3.40: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen pBCKH-Ubi mang gen điều khiển
chịu hạn
94
Hình 3.41: Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1%
95
Hình 3.42: Một phần kết quả giải trình tự pBCKH-Ubi mang gen mã hóa các nhân
tố phiên mã
96
Hình 3.43: Kết quả điệ
n di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1%
98
Hình 3.44: Một phần kết quả giải trình tự pBIG-Lip9 mang gen mã hóa các nhân
tố phiên mã
99
Hình 3.45: Vector pCB301-35S
100
Hình 3.46: Kết quả kiểm tra các khuẩn lạc Agrobacterium được biến nạp
với các vector
107
Hình 3.47: Hình ảnh minh họa các bước chuyển gen vào giống lúa Chành Trụi
109
Hình 3.48: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của các gen điều
khiển trong các cây lúa Chành trụi chuyển gen.

111
Hình 3.49: Kết quả so sánh hiệu quả của các cách khử trùng hạt khác nhau
117
Hình 3.50: Kết quả so sánh callus trên các môi trường khác nhau.

MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN 4
1.1. TÁC ĐỘNG CỦA HẠN HÁN ĐẾN SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP 4
1.2. CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN CƠ CHẾ CHỐNG CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT 5
1.2.1. Các gen chức năng tham gia đáp ứng điều kiện hạn 7
1.2. 2. Các nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật 11
1.3. THỰC VẬT CHUYỂN GEN VÀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TẠO THỰC VẬT
CHUYỂN GEN 18
1.3.1. Khái niệm cây trồng biến đổi gen 18
1.3.2. Phương pháp tạo cây chuyển gen 19
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG LÚA CHUYỂN GEN CHỊU HẠN TRÊN
THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 23
1.4.1. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn trên thế giới 23
1.4.2. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn ở Việt Nam 31
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 33
2.1. VẬT LIỆU 33
2.1.1. Mẫu thực vật 33
2.1.2. Các chủng nấm, vi khuẩn 34
2.2. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 35
2.2.1. Tách chiết ADN và ARN tổng số 35
2.2.2. Tinh sạch ARN thông tin 36
2.2.3. Sinh tổng hợp cDNA và xây dựng thư viện cDNA Hybrid Zap 2.1 37
2.2.4. Phương pháp đánh giá thư viện cDNA 38
2.2.5. Phương pháp khuếch đại trình tự ADN (phản ứng chuỗi trùng hợp-PCR) 39
2.2.6. Tách dòng gen và tạo vector tái tổ hợp 40
2.2.7. Chuẩn bị tế bào vi khuẩn khả biến 42
2.2.8. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt 42
2.2.9. Tách và tinh sạch plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli 43
2.2.10. Giải trình tự gen tự động 44
2.2.11. Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli 45

3.4.2. Xác định khả năng liên kết đặc hiệu trình tự đích của nhóm nhân tố phiên mã NAC 87
3.5. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ 92
3.5.1. Thiết kế các vector chuyển gen pBCKH điều khiển bởi promoter Ubiquitin 92
3.5.2. Thiết kế hệ thống vector chuyển gen pBIG mang promoter Lip9 97
3.5.3. Thiết kế vector biểu hiện mang gen OsAREB1A 100
3.6. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG HOẠT ĐỘNG CỦA GEN ĐIỀU KHIỂN CHỊU HẠN TRONG
CÂY LÚA CHUYỂN GEN 101
3.6.1. Nghiên cứu khả năng tạo callus và tái sinh cây của tập đoàn các giống lúa Việt Nam 101
3.6.2. Tạo các chủng Agrobacterium tái tổ hợp mang gen mã hóa nhân tố phiên mã 105
3.6.3. Chuyển gen điều mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn vào lúa Chành trụi
và xác định sự có mặt của gen chuyển trong các cây lúa chuyển gen 108
3.6.4. Chuyển gen điều khiển tính chịu hạn vào lúa Pusa Basmati 1 thông qua Agrobaterium 115
3.7. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG HOẠT ĐỘNG CỦA GEN ĐIỀU KHIỂN CHỊU HẠN
OsAREB1A TRONG CÂY ARABIDOPSIS CHUYỂN GEN 122
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn 157

3.7.1. Chuyển gen điều khiển tính chịu hạn OsAREB1A vào Arabidopsis thông qua Agrobaterium
và kiểm tra cây chuyển gen bằng phương pháp RT-PCR 122
3.7.2. Khả năng sinh trưởng của cây chuyển gen và cây đối chứng thông qua từng giai đoạn 124
3.7.3. Phân tích tổng hợp các kết quả thí nghiệm đánh giá mức độ biểu hiện của gen OsAREB1A
trong các cây Arabidopsis chuyển gen 127

Chương 4. TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC 131
4.1. KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC 131

duy trì sự phát triển bền vững trong trong sản suất lương thực của loài người. Tình trạng
môi trường hiện nay ở Việt Nam cho thấy hạn và mặn là hai trong số những nhân tố quan
trọng nhất kìm hãm sự phát triển sản suất nông nghiệp. Lúa là một trong những cây trồng
quan trọng nhất trên thế giới với h
ơn 3 tỷ người tiêu dùng mỗi ngày. Ở Việt Nam, lúa là
cây lương thực quan trọng nhất, đóng góp hơn 60% tổng sản lượng lương thực của cả
nước và được gieo trồng với diện tích 5,7 triệu hecta - lớn nhất trong tất cả các loại cây
trồng. Tuy nhiên, 50% diện tích lúa đang được canh tác trong điều kiện môi trường bấp
bênh, rất dễ bị tác động bởi các yếu tố ngoại cảnh bấ
t lợi như hạn, mặn, lạnh…. Do đó,
việc nghiên cứu đặc tính các gen đáp ứng hạn và mặn cũng như việc đánh giá khả năng
áp dụng của chúng là một yêu cầu hết sức cấp thiết.
Sự gia tăng năng suất lúa có bước nhảy đột phá trong nửa thế kỷ qua, với sản
lượng tăng gấp đôi ở hầu hết các nơi trên thế gi
ới và thậm chí là gấp ba ở một số vùng
nhất định. Tuy nhiên tốc độ tăng năng suất lúa đã có hiện tượng bão hoà trong thập kỷ
qua, chủ yếu do sự thiếu vắng những công nghệ nhân giống mới, sự giảm sút tính đa dạng
di truyền các giống lúa, sự giảm sút năng suất lúa nghiêm trọng do xuất hiện ngày càng
nhiều côn trùng, bệnh dịch và các yếu tố bất lợi môi trường. Nế
u chỉ sử dụng các phương
pháp truyền thống, năng suất lúa gạo của Việt Nam không thể tăng quá 20 - 25% trong
vòng 10 năm tới, điều này không đáp ứng được tốc độ tăng dân số và nhu cầu xuất khẩu
của Việt Nam. Do đó, đã đến lúc chúng ta phải kết hợp phương thức chọn gi
ống truyền
thống với công nghệ sinh học để chọn giống một cách chính xác các giống lúa có các tính
trạng mong muốn như chống sâu bệnh, chịu điều kiện mặn và hạn…. Trong khi các
phương pháp chọn giống truyền thống vẫn là chỗ dựa chủ yếu thì các công cụ chọn giống
cây trồng sử dụng công nghệ sinh học hiện đại sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc hiện
thực hóa mộ
t bước nhảy vọt trong cải tạo giống lúa.

phát hiện và chứng minh vai trò quan trọng của nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã
(Transcription factor) trong việc tăng cường tính chịu hạn ở thực vật. Nhóm gen mã hóa
nhân tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếp vào phản ứng đáp ứng với đi
ều kiện
hạn ở thực vật nhưng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò kích hoạt sự biểu hiện của rất
nhiều gen chức năng khác tham gia vào quá trình đáp ứng hạn, dẫn tới làm tăng cường
khả năng chịu hạn ở thực vật. Phát hiện này đã mở ra một hướng nghiên cứu rất mới cho
lĩnh vực chọn giống chuyển gen ở
thực vật, đó là chỉ cần chuyển 1 hay 1 vài gen mã hóa
nhân tố phiên mã thay vì vài trăm gen chức năng vào cây để tăng cường tính chống chịu
bất lợi môi trường của cây trồng. Chính vì lí do này mà các nghiên cứu phân lập, đặc tính
hoá các gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn đang trở thành định
hướng nghiên cứu đầy tiềm năng trong việc chọn tạo giống chịu hạn.
Xuất phát từ các luận điểm trên đề tài: “
Phân lập và thiết kế các vector mang gen
điều khiển tính chịu hạn phục vụ công tác tạo giống cây trồng chuyển gen” đã được tiến
hành nhằm tạo được các hệ vector mang gen mã hóa nhân tố phiên mã biểu hiện trong
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn 3

điều kiện hạn ở cây một lá mầm phục vụ công tác tạo giống cây trồng chuyển gen, trong đó
có các mục tiêu cụ thể như sau:
- Phân lập các gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn, các
promoter biểu hiện liên tục và trong điều kiện bất lợi môi trường ở cây trồng; thiết kế các
vector chuyển gen mang gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn biểu
hiện dưới sự điều khi
ển của promoter biểu hiện liên tục hoặc trong điều kiện bất lợi môi
trường nhằm tăng cường hiệu quả công tác tạo giống cây trồng chịu hạn theo định hướng

1.1. TÁC ĐỘNG CỦA HẠN HÁN ĐẾN SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP
Hạn hán là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất cây trồng và
làm cho sản lượng Nông nghiệp toàn cầu không ổn định. Hàng năm, các điều kiện bất lợi
của môi trường làm giảm 50% năng suất mùa màng, trong đó tính riêng hạn hán chiếm
tới 15%. Thậm chí ở một số nơi có mực nước ngầm thấp, có năm hạn làm giảm 100%
nă
ng suất mùa màng [31]
Tại Trung Quốc, hạn hán nghiêm trọng thường xuyên xảy ra ở các tỉnh miền
Bắc. Tính trạng hạn hán kéo dài từ cuối tháng 7/ 2009 đã ảnh hưởng nghiêm trọng vùng
trồng ngô lớn nhất Trung Quốc và có nguy cơ thu hẹp 60% diện tích trồng trọt. Đây là
trận hạn hán nghiêm trọng nhất quốc gia này trong vòng 60 năm qua và tác động lên
hầu hết các vùng sản xuất lúa mì trong lãnh thổ Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa. Ngoài
việc phá hủy vụ mùa lúa mì, hạn hán còn gây ra tình trạng thiế
u nước cho ước tính
khoảng 2,31 triệu người và 2,57 triệu gia súc. Trong tám tỉnh chịu tác động, 20% đất
nông nghiệp và 35% tổng diện tích lúa mì đều bị ảnh hưởng. Đến tháng 2 năm 2011,
trận hạn hán ảnh hưởng lên diện tích 7,73 triệu hécta lúa mì vụ đông sắp được thu
hoạch. Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc, thiệt hại vụ thu
hoạch lúa mì của Trung Quốc có khả năng là một yếu tố
đã làm tăng giá lúa mì trên
toàn thế giới vào đầu năm 2011 [105] .
Ấn Độ cũng đang phải đối mặt với đợt hạn hán nghiêm trọng nhất trong vòng 7 năm
qua. Hiện nay đã có hơn 1/3 số quận của Ấn Độ rơi vào tình trạng hạn hán. Thiếu hụt
lượng mưa cần thiết có thể khiến tăng trưởng kinh tế của quốc gia này giảm sút 1% trong
năm nay. Đợt hạn hán tồi t
ệ nhất trong lịch sử gần 20 năm qua tại Thái Lan vào năm 2002
đã đẩy quốc gia xuất khẩu gạo lớn nhất thế giới đối mặt với vụ mùa thất thu. Và theo thông
báo mới nhất của cơ quan ngăn ngừa và giảm thiểu thảm họa Thái Lan, 354 huyện thuộc
47 trên tổng số 77 tỉnh, thành của nước này nằm trong khu vực thảm họa hạn hán[105].
Ở Việt Nam, hạn hán xảy ra ngày càng kéo dài hơ

dài sẽ ảnh hưởng tới năng suất của khoả
ng 26.000 ha lúa đông xuân ở các vùng Trung du,
Đồng bằng Bắc bộ và khoảng 100.000 ha ở Nam bộ. Cũng theo Cục Thuỷ lợi, Bộ Nông
nghiệp và phát triển nông thôn, nắng nóng, khô hạn kéo dài tại các tỉnh Nam Trung Bộ và
Tây Nguyên đã làm hơn một triệu người thiếu nước sinh hoạt. Sơ bộ, tổng thiệt hại do
hạn hán tại 2 khu vực này đã lên tới 1.258 tỷ đồng.
1.2. CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN CƠ CHẾ CHỐNG CHỊU HẠN CỦA TH
ỰC VẬT
Điều kiện bất lợi môi trường gây ra hàng loạt các thay đổi về hình thái, sinh lý,
sinh hoá và phân tử, ảnh hưởng bất lợi cho sinh trưởng và phát triển của thực vật. Trong
các điều kiện bất lợi môi trường, hạn là một trong những yếu tố quan trọng nhất, đặc biệt
trong bối cảnh thay đổi khí hậu toàn cầu. Thực vật phải tạo ra hàng loạt các thay đổi về
mặ
t sinh lý để tồn tại và thích nghi với điều kiện hạn hán như: đóng khí khổng, giảm hô
hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong các mô, chậm quá trình sinh trưởng. Ở mức
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn 6

độ phân tử, điều kiện hạn sẽ làm cho thực vật gia tăng mức độ biểu hiện và tích luỹ của
các gen/ protein chống chịu stress [79, 94].
Ở Arabidopsis, các protein kinase, nhân tố phiên mã (transcription factor),
phosphatase, protease, protein biểu hiện trong giai đoạn muộn của phôi (late
embryogenesis abundant - LEA), protein sinh tổng hợp Abscisic acid (ABA), các protein
sinh tổng hợp đường (proline, mannitol, sorbitol) và hàng loạt các protein chức năng khác
đã được phân lập, nghiên cứu đặc tính và chứng minh tham gia vào quá trình chịu hạn ở
thực vật [66].

Hình 1.1. Sơ đồ minh hoạ cơ chế phân tử quá trình tham gia đáp ứng điều kiện hạn

ngừng việc sử dụng các protein thừa và phân hủy các chuỗi peptit trong các túi chứa, qua
đó giải phóng các axit amin tự do để sử dụng cho việc tổng hợp số l
ượng lớn các protein
mới (bảng 1.1 và 1.2, [37]).
Các gen tham gia quá trình biến đổi tính thấm của tế bào
Thực vật có thể giữ được thế nước (giúp duy trì dòng chảy của nước trong cây)
trong điều kiện khô hạn nhẹ bằng cách biến đổi tính thấm của tế bào, quá trình này bao
gồm việc tận dụng các phân tử đường hay các giải pháp tương thích khác [20]. Cả các
kênh dẫn nước và ion đều có vai trò quan trọng như nhau trong việc điều hòa dòng chả
y
của nước và sự liên hệ giữa các kênh này với điều kiện stress hạn đã được khẳng định qua
việc phân lập, biểu hiện các gen mã hóa cho protein của các kênh này trong việc đáp ứng
sự khô hạn. Phân tử cDNA 7a từ cây đậu Hà Lan (bảng 1.2, [37]) mã hóa một chuỗi
peptit với các điểm đặc trưng của các kênh dẫn ion, trong khi phân tử cDNA RD28 từ cây
A.thaliana (bảng 1.1, [37]) và có thể là cả phân tử aDNA H2-5 từ cây C. plantagineum
đều mã hóa cho protein của các kênh d
ẫn nước [30].
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn 8

Bảng 1.1: Các gen tăng cường biểu hiện bởi stress hạn và mã hoá cho chuỗi polypeptide của
các protein có chức năng đã biết (J.Ingram và D. Bartels)
cDNA Nguồn gốc Protein được mã hóa
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn


Sản phẩm của gen cảm ứng điều kiện hạn được phân lập bằng phương pháp sàng
lọc biệ
t hóa có trình tự tương đồng với các protein shock nhiệt. Các gen mã hóa cho các
protein này có thể là các chaperonin, có liên quan đến việc sửa chữa protein thông qua sự
trợ giúp các phân tử protein khác để phục hồi cấu trúc tự nhiên của protein sau khi bị phá
hủy hay gấp nếp sai trong quá trình bị hạn. Các protein shock nhiệt có khối lượng phân tử
nhỏ (bảng 1.2; [27]) cũng có thể là các chaperonin.

Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn 10

Bảng 1.2. Các gen tăng cường biểu hiện trong điều kiện hạn nhưng chức năng chưa xác
định (J.Ingram và D. Bartels)

Các gen liên quan đến việc loại bỏ độc tố
Các enzyme liên quan đến việc loại bỏ độc tố trung gian trong các quá trình
chuyển hóa hiếu khí như khử hóa glutathione, bẻ gẫy liên kết superoxide tăng cường biểu
hiện trong quá trình đáp ứng lại stress hạn chứng tỏ chúng có vai trò quan trọng trong các
quá trình chống chịu [60]. Việc giảm lượng nước ở lá và đóng khí khổng dẫn đến việc
giảm lượng CO
2
[77]. Sự gia tăng hoạt động hô hấp sáng trong quá trình hạn hán cũng
đồng thời xảy ra do có sự tăng cường các hoạt động oxi hóa glycolate, dẫn đến việc tạo ra
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn 11


Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn 12

DRE/CRT (Dehydration responsive element/C repeat - yếu tố/đoạn C lặp lại đáp ứng
hạn), NAC, MYB với chức năng tương ứng là điểm bám của các nhân tố phiên mã biểu
hiện phụ thuộc và không phụ thuộc vào nồng độ ABA (hình 1.3).

Hình 1.3: Hệ thống điều khiển phiên mã của vùng ADN đặc hiệu và nhân tố phiên mã điều khiển
biểu hiện các gen chức năng tham gia phản ứng chống chịu với điều kiện bất lợi ở Arabidopsis
Các nhân tố phiên mã biểu hiện không phụ thuộc ABA
Nhóm nhân tố NAC
Các nhân tố phiên mã họ NAC chứa một trình tự đồng nhất (được phát hiện lần đầu
tiên ở Arabidopsis) gọi là vùng hoạt động NAC ở đầu N-tận cùng. Đây là một họ gen đặc
trưng của thực vật, có vai trò quan trọng trong việc xác định mô phân sinh đỉnh chồi [81],
biệt hóa các cơ quan rễ, hoa trong sinh trưởng phát triển thực vật [16, 47], phản ứng vớ
i
điều kiện bị tổn thương và tác nhân gây hại tấn công [15, 28], tăng cường tính chịu hạn, mặn
và các điều kiện bất lợi thời tiết [
64]. Có ít nhất khoảng 100 gen thuộc họ NAC trong hệ gen
của Arabidopsis và 75 gen trong hệ gen lúa đã được phân lập nhưng chỉ một số ít gen trong
số này được nghiên cứu chức năng [68]. Phần lớn protein của các gen thuộc họ NAC có
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn 13

chứa một vùng liên kết ADN ở tận cùng đầu N có độ bảo thủ cao, một trình tự tín hiệu định
vị nhân và một vùng tận cùng đầu C biến đổi [46].

nghiên cứu chi tiết chức năng. Biểu hiện gen OsNAC6 trong cây lúa chuyển gen làm cây
sinh trưởng còi cọc, năng suất thấp, tăng cường tính chịu hạn và kháng bệnh bạc lá; trong
khi biểu hiện của các gen OsNAC1, OsNAC2, OsNAC5 trong cây lúa chuyển gen giúp
cây tăng cường tính chịu hạn, mặn mà không làm ảnh hưởng đến sinh tr
ưởng và phát
triển của cây [83]. Gần đây, gen OsNAC10 đã được phân lập và nghiên cứu đặc tính. Cây
Báo cáo kết quả khoa học Đề tài phân lập & thiết kế vector chuyển gen chịu hạn 14

lúa chuyển gen OsNAC10 tăng cường tính chịu hạn, mặn, đồng thời tăng năng suất từ
25% tới 45% trong điều kiện hạn [50].
Nhóm nhân tố DREB2
Hai gen DREB2A và DREB2B chỉ biểu hiện trong điều kiện hạn và hoạt hoá các
gen chức năng tham gia vào tính chịu hạn của thực vật. Tuy nhiên, biểu hiện của các gen
DREB2A và DREB2B không làm tăng tính kháng hạn của các cây Arabidopsis chuyển
gen, điề
u này chứng tỏ nhóm gen này cần quá trình sửa đổi sau phiên mã ví dụ như qua
quá trình phosphoryl hóa để chuyển protein sang dạng hoạt hoá [47]. Gen DREB2A được
thay đổi cấu trúc để loại bỏ 30 axit amin tương ứng với trật tự từ 136 đến 165 để tạo ra
dạng DREB2ACA. Kết quả, sự biểu hiện của gen DREB2ACA giúp cây chuyển gen
Arabidopsis tăng cường đáng kể tính chịu hạn. Các phân tích sử dụng kỹ thuật ADN
microarray và Northern blot
đã chứng minh là gen DREB2ACA điều khiển sự biểu hiện
của rất nhiều gen chức năng tham gia vào tính kháng hạn ở thực vật [63]. Gen
ZmDREB2A cũng đã được phân lập và nghiên cứu đặc tính chi tiết ở ngô. Không giống
như gen DREB2A của Arabidopsis, gen ZmDREB2A tạo ra hai dạng phiên mã và qua
phân tích RT- PCR thì chỉ có dạng phiên mã có hoạt tính sinh ra đáng kể trong điều kiện
hạn. Ngoài ra, thí nghiệm phân tích hoạt hoá phiên mã (transactivation assay) ở tế bào