Mục lục
Mở đầu
Phần 1 Tổng quan tài liệu
1.1. Đặc điểm của cây đu đủ
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
1.1.2. Giá trị kinh tế
1.1.3. Phân bố
1.1.4. Các bệnh về cây đu đủ
1.2. Đặc điểm virus gây bệnh đốm vòng ở đu đủ (PRSV)
1.2.1. Cấu trúc
1.2.2. Cơ chế lan truyền
1.2.3. Các biện pháp phòng trừ
1.2.4. Gen kháng virus
1.2.5. Những thành tựu trong việc chống lại PRSV ở cây đu đủ
1.2.5.1. Trường đại học Hawaii và đại học Cornell, Mỹ
1.2.5.2. Trường đại học Kasetsart, Thailand và Queensland, Austrailia
1.2.5.3. Trung tâm Công nghệ sinh học, MARDI, Malaysia
1.3. Công nghệ sinh học phân tử và ứng dụng để tạo cây chuyển gen
1.3.1. Một số vector sử dụng trong sinh học phân tử
1.3.1.1 Vector nhân dòng TA-cloning
1.3.1.2 Vector biểu hiện protein pRSET
1.3.1.3 Vector chuyển gen
1.3.2. Một số loại enzim sử dụng trong sinh học phân tử
1.3.2.1 Enzim sao mã ngược (reverse transcriptase)
1.3.2.2 Enzim ligase
1.3.2.3 Enzim DNA polymerase
1.3.2.4 Enzim cắt giới hạn (restriction enzim)
1
1.3.2.5 Enzim Mung-bean nuclease
1.3.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử
1.3.3.1 Kỹ thuật RT-PCR

2500 ha với sản lượng khoảng 100.000 tấn ước tính đạt 200 - 300 tỉ đồng [17].
Nhưng hạn chế lớn nhất đối với sự phát triển cây đu đủ là sự hoành hành của
bệnh đốm vòng do virus đốm vòng (papaya ringspot virus) gây ra. Virus này thuộc
nhóm Potyirus có vật liệu di truyền là sợi ARN đơn. Khi virus này nhiễm vào cây
đu đủ thì làm cho lá cây có những vòng đốm và mất khả năng quang hợp dẫn đến
giảm nghiêm trọng năng suất và chất lượng quả. Bệnh được truyền do các loại rệp
cây nên lan rộng rất nhanh. Đến nay toàn bộ các vùng trồng đu đủ ở nước ta [17]
cũng như Austrailia [16], Thái Lan [14], Đài Loan [18], Malaysia [10]... và đặc biệt
là Hawaii [5] đều đã bị nhiễm bệnh.
Những phương pháp thường sử dụng để ngăn chặn sự lan rộng của PRSV
như chặt bỏ cây bị bệnh, cách ly vùng bị bệnh [7], sử dụng thuốc trừ sâu để diệt rệp
truyền bệnh hay sử dụng chủng PRSV yếu cho nhiễm vào cây chưa bị bệnh để ngăn
sự nhiễm các chủng mạnh hơn theo cơ chế bảo vệ chéo [19,20]. Nhưng những
phương pháp này chỉ làm giảm sự lan truyền mang tính chất phòng trừ chứ không
thể chống lại bệnh này.
Hiện nay nhờ ứng dụng tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền, người ta đã tạo
ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus gây ra bằng cách đưa
gen mã hoá protien vỏ (coat proetin gene) của virus vào genom của thực vật. Thành
công đầu tiên là ở thuốc lá và cà chua kháng lại virus khảm thuốc lá [12]. Sau đó là
sự kháng lại nhiều loại virus khác như cucumber mosaic virus [1], alfalfa mosaic
3
virus [6] và potato leaf roll virus [4]. Gần đây ở Hawaii đã tạo được dòng đu đủ 55-
1 kháng lại PRSV [2,3]. Dòng đu đủ được chuyển gen này đã trở thành giống
thương mại sau khi lai với giống Kapoho [9]. Nhưng tính kháng của cây đu đủ
chuyển gen này chỉ có hiệu quả đối với các chủng virus của Hawai mà không kháng
với các chủng virus từ các vùng khác [15]. Chính vì vậy mà cần phải tách dòng gen
mã hoá protien vỏ (coat protein gene) từ chính các virus gây bệnh của vùng đó thì
mới có khả năng tạo ra cây kháng bệnh.
Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi đã xây dựng đề tài: " Tách dòng và thiết kế
vector chuyển gen của gen mã hoá protein vỏ (coat protein) từ virus gây bệnh đốm

và có thể đạt 100 tấn/ha/năm.
5
Đu đủ là cây đa tính, nhiều loài là khác gốc (cây đực và cái riêng rẽ), nhiều
loài là cùng gốc (cây lỡng tính). Cây khác gốc phải đợc thụ phấn chéo do sự chia rẽ
của nhị và nhuỵ hoa và hầu nh sự phân tán của phấn hoa là nhờ gió. Cây cùng gốc
có hoa lỡng tính nên có hiện tợng tự thụ phấn.
1.1.2. Giá trị dinh dỡng và kinh tế của cây đu đủ
Đu đủ đợc sử dụng chủ yếu là quả chín làm món ăn tráng miệng vì quả có
vị ngon, rất giầu vitamin và muối khoáng(Table 1), một phần quả xanh đợc dùng
làm salad, lá xanh dùng để hầm thịt trong một số món ăn truyền thống. Ngoài ra,
nhựa đu đủ còn đợc sử dụng làm nguyên liệu tách chế phẩm papain (chiếm 1%
chất khô của quả xanh) là enzim thơng mại đợc sử dụng trong công nghiệp thực
phẩm và thuộc da. Thêm nữa, đu đủ còn đợc coi là một loại dợc liệu quí: rễ, hoa, lá
đợc dùng rộng rãi trong đông y nh hoa đu đủ đực đợc dùng để trị ho, hạt dùng làm
thuốc chống giun sán, hạ sốt...(Vũ Công Hậu)
Table 1: Thành phần dinh dỡng của quả đu đủ chín (100g)
Thành phần 100g quả chín
Năng lợng 35.0 - 59 cal
Nớc 88.4 - 90.7 g
Protein 1.0 - 1.5 g
Chất béo 0.1 g
Carbohydrates 7.1 - 13.5 g
Ash 0.1 g
Calcium 11.0 - 31.0 mg
Phospho 7.0 - 17 mg
Iron 0.6 - 0.7 mg
Sodium 2.0 - 3.0 mg
Potassium 39 - 337 mg
Carotene 1.16 - 2.43 mg
Vitamin B1 0.03 - 0.08 mg

Vùng phân bố Diện tích (ha)
Vùng núi và trung du phía bắc
- Sơn La
- Lạng Sơn
500
Đồng bằng sông Hồng
- Hà Nội
- Hng Yên
- Nam Hà
- Ninh Bình
250
Ven biển miền trung
- Nghệ An
100
7
- Thanh hoá
Đồng bằng sông Mekong
- Ninh Thuận
- Nha Trang
- Tây Ninh
- Tiền Giang
500-550
1.1.4. Các bệnh và sâu hại của cây đu đủ
- Bệnh đốm vòng: Hạn chế lớn nhất đối với sự phát triển cây đu đủ là sự
hoành hành của bệnh đốm vòng do virus đốm vòng (papaya ringspot virus) gây ra.
Khi virus này nhiễm vào cây đu đủ thì lá cây có những vòng đốm, các gân lá xoăn
lại và phồng lên làm mất khả năng quang hợp, ở quả có những vòng xanh ô lu. Cây
chậm phát triển dẫn đến giảm nghiêm trọng năng suất và chất lợng quả. Bệnh đợc
truyền do các loại rệp cây nên lan rộng rất nhanh. Hiện nay tất cả các vùng trồng
đu đủ ở nớc ta đều đã bị nhiễm bệnh kể cả khi lấy hạt của những cây đu đủ không

nhỏ là protein vỏ (coat protein). RNA genome của PRSV đợc dịch mã trong tế bào
chủ tạo ra polyprotein. Polyprotein này thuỷ phân tạo ra 12 protein trong đó có
protein vỏ (viral coat protein).
Trong suốt quá trình nhiễm trong tế bào chủ, virus sử dụng nguyên liệu của
tế bào chủ để tạo ra những bản sao genome cũng nh các protein của nó. Sau đó
RNA và những tiểu phần protein vỏ tự lắp ráp với nhau tạo ra những virus hoàn
chỉnh riêng biệt có khả năng nhiễm sang các tế bào khác trong cây hoặc sang các
cây khác nhờ côn trùng.
Genome của virus mã hoá khoảng 12 loại protein. Một vài loại thì chức
năng của nó không hoàn toàn đợc xác định, một vài loại thì có nhiều chức năng
khác nhau. Một số chức năng đã đợc xác định là vỏ protein, nhân, thân hình trụ,
phần bổ trợ liên quan đến sự truyền nhờ côn trùng, helicase và nhiều protease,
replicase, protein liên kết genome, ATPase.
1.2.2. Cơ chế lan truyền của PRSV
PRSV đợc truyền dễ dàng đến tế bào chủ thân thuộc nhờ nhiều loài rệp cây
khác nhau với phơng thức không liên tục. Virus đợc truyền không liên tục nhờ rệp
cây là vì sự tồn tại trong vật truyền trung gian là rất ngắn, ngắn hơn cả thời gian
9
tồn tại của virus trong dịch chiết lá cây. Trong quá trình truyền không liên tục,
virus đợc truyền sang côn trùng sau khi sinh trởng một thời gian ngắn trong cây bị
nhiễm và có thể đợc truyền tới một hoặc vài cây ngay lập tức hay sau nhiều giờ. Có
sự khác nhau trong vật truyền đặc hiệu của từng loại virus riêng biệt trong nhóm
thậm chí giữa các dạng sinh học của cùng một loại virus. Điều này nói lên rằng cơ
chế của sự tơng tác virus - vector vợt ra ngoài tính chất sinh học chung của virus và
vector truyền của nó [ ].
1.2.3. Các biện pháp phòng trừ
- Sử dụng các chất hoá học tiêu diệt rệp truyền bệnh.
- Loại bỏ các cây bị bệnh, tránh trồng gần các cây họ bầu bí là ký chủ của
các côn trùng truyền bệnh.
- Cách ly với các vùng có cây bị bệnh. Các vùng cách ly có thể tạm thời

1.2.5.1. Trờng đại học Hawaii và đại học Cornell, Mỹ
Hai nơi này đã đi tiên phong trong việc chuyển gen CP vào đu đủ để kháng
bệnh đốm vòng và đã mở ra một phơng pháp mới cho việc tạo các giống cây trồng
kháng bệnh virus. Nhóm các nhà khoa học gồm có:
Dr. Dennis Gonsalves, Khoa bệnh học thực vật, đại học Cornell, tham gia
trong việc tách phân lập gen CP từ virus PRSV.
Dr. Jerry Slightom thiết kế cấu trúc gene CP dùng cho chuyển gen
Dr. Maureen Fitch (USDA) chuyển gen CP vào đu đủ.
Dr. Richarh Manshardt, Khoa trồng trọt, đại học Hawaii, tham gia kiểm tra
và khảo nghiệm các dòng cây chuyển gen.
Nhóm nghiên cứu này đã đa Gen CP của dòng virus PRSV HA 5-1 vào
vector pGA482 và chuyển thành công vào giống đu đủ "Sunset" bằng súng bắn
gen. Họ đã tạo ra hai dòng đu đủ mang tên 55-1 và 63-1 có mang gen CP trong
genom và đã kiểm tra bằng lai Southern và ELISA. Kết quả thử nghiệm khả năng
kháng bệnh của thế hệ R1 từ dòng 55-1 cho thấy nó có tính kháng bệnh rất cao
(chỉ có 5% của 128 cây đợc thử nhiễm bệnh) đối với các dòng virus tách từ
Hawaii. Nhng không kháng đợc các dòng tách từ nơi khác (vd: Thailand). Vì thịt
quả của dòng 55-1 có mầu hồng không phù hợp với thị trờng nên dòng 55-1 này đã
đợc lai với giống Kapoho tạo ra dòng "Rainbow" có thịt quả mầu vàng mang đầy
11
đủ các đặc tích của giống gốc. Hiện nay dòng "Rainbow" đã đợc đăng ký bản
quyền và trở thành giống đu đủ chuyển gen thơng mại đầu tiên có khả năng kháng
lại PRSV.
1.2.5.2 Trờng đại học Kasetsart, Thailand và Queensland, Austrailia
Nhóm nghiên cứu gồm có:
Dr. Tom Burn, Dr. Kanokawan Kanokawaree, Dr. Supart Attathom
Đại học Kasetsart, Thailand
Dr. Srimake Chaowphongphang, đại học Queensland, Austrailia.
Để kiểm soát bệnh PRV thì từ năm 1987 Thailand đã tạo ra các giống có
khả năng chịu bệnh cao theo phơng pháp bảo vệ chéo nhng hiệu quả không cao.

galactosidase giúp cho việc chon lọc khuẩn lạc xanh/trắmg. Vector này mang vùng
gen tự sao mã ColE1 origin biểu hiện số lợng cao bản sao trong E.coli và gen chọn
lọc là hai gen kháng kanamycin và Ampicillin. Đặc biệt, có trình tự bắt cặp bổ
sung của hai đoạn mồi M13 forward và M13 reverse nằm ở hai bên của điểm chèn
phục vụ cho việc xác đinh trình tự đoạn DNA đợc chèn vào (hình )
Hình : Bản đồ vector TA-cloning pCR2.1
13
1.3.1.2. Vector biểu hiện protein pRSET
Vector pRSET có nguồn gốc là các vector biểu hiện pUC, đợc thiết kế cho
sự biểu hiện protein và tinh chế protein ở mức độ cao trong E. coli. Sự biểu hiện ở
mức độ cao của các trình tự DNA đợc đa vào vector pRSET đợc tạo ra do sự điều
khiển của T7 promoter. Đoạn DNA đợc đa vào vị trí trong khung dịch mã với trình
tự mã hoá đoạn peptid tín hiệu tận cùng đầu N, một bộ mã khởi đầu dịch mã ATG,
một đoạn trình tự mã hoá 6 a xít amin histidine có chức năng là vùng liên kết với
kim loại trong protein đợc dịch mã. Vùng liên kết kim loại của đoạn peptide tín
hiệu cho phép tinh chế protein tái tổ hợp một cách đơn giản bằng sắc ký ái lực.
Một đoạn trình tự có tính năng làm ổn định cho sự sao mã có nguồn gốc từ gen 10
của phagơ T7. Một đoạn trình tự qui định vị trí cắt của enzim enterokinase trên
chuỗi peptide nằm giữa vùng liên kết với kim loại và protein tái tổ hợp, có tác dụng
loại bỏ đoạn peptide tín hiệu đầu N từ protein tái tổ hợp đã tinh sạch.
Trong pRSET, vị trí MCS (multiple cloning site) có vị trí cắt của 10 enzim
giới hạn: BamH I; Xho I; Bgl II; Pst I; Pvu II; Kpn I; Nco I; EcoR I; BstB I và Hind
III. Theo đó, để tạo ra đúng protein tái tổ hợp chá đoạn pepetide tín hiệu cần phải
chèn đoạn DNA vào một trong những vị trí trong MSC sao cho đúng khung dịch
mã với mã khởi đầu ATG của vector. Vector pRSET có 3 loại pRSET A, B và C
(hình 2) chỉ khác nhau đoạn trình tự giữa vùng mã cho đoạn peptide tín hiệu và
MCS. Để biểu hiện đúng protein đã đợc mã hoá bởi trình tự DNA, yếu tố quyết
định đầu tiên là vị trí cắt giới hạn phải thích hợp cho sự lai ghép đoạn DNA và sau
đó là vector nào sẽ duy trì đợc khung dịch mã của vector và đoạn DNA đợc chèn
vào.

TATA) và kết thúc phiên mã (hộp AATAAA). Gen tồn tại trên T-ADN đợc chia
làm hai hệ chính [11]:
+ Hệ thứ nhất là gen gây ung th onc, gen này mã hoá sinh tổng hợp auxin
và cytokinin, kết quả làm cho các tế bào phân chia liên tục và biến đổi hình dạng
tạo ra các nốt sần trên cây.
16
+ Hệ gen thứ hai mã hoá cho các enzim cần thiết trong quá trình tổng hợp
opine. Vi khuẩn sử dụng opine làm nguồn năng lợng cung cấp cacbon và nitơ.
Dạng opine đợc tổng hợp trong khối u có thể là nopaline, octopine, agropine,
manopine và agrocinopine phụ thuộc vào các chủ Agrobacterium sinh ra khối u
ban đầu [11]. Đây cũng là cơ sở để phân loại các chủng Agrobacterium.
+ Vùng các gen độc tố của Ti-plasmit: Vùng các gen độc tố (vir) phụ trách
quá trình gây cảm ứng tạo đoạn T-ADN và vận chuyển T-ADN tới nhân tế bào vật
chủ. Có tới 24 gen vir nằm trong vùng này của Ti-plasmit dạng octopine. Các gen
này đợc bố trí trong 8 operon ký hiệu virA đến virH, tạo thành cấu trúc regulon [11].
- Sự biểu hiện của các gen vir đợc điều khiển bởi hệ thồng gồm hai thành
phần là protein VirA và protein VirG. Protein VirA là định vị trên màng tế bào, nó
có khả năng tự phosphoryl hoá ở gốc histidine 474 và gốc photphat này đợc
chuyển tới protein VirG. Sau đó protein VirG hoạt hoá sự phiên mã của các gen
vir khác [14].
Tuy nhiên các hoạt động cần thiết cho quá trình tạo T-ADN và hình thành
phức hợp T (T- complex) là do các gen virC, virD và virE điều khiển. Operon của
virD mã hoá sinh tổng hợp 4 protein VirD1, VirD2, VirD3 và VirD4. VirD2 là một
endonuclease có chức năng nhận biết và làm đứt gẫy T-ADN tại vùng đầu biên
cùng với sự có mặt của VirD1. Đoạn ADN "định vị nhân" trong gen virD2 giúp
cho sự định hớng của phức hợp T tới nhân tế bào thực vật. Hai protein VirC1 và
VirC2 đợc mã hoá bởi locus virC, protein VirC1 giữ vai trò thúc đẩy sự tạo thành
T-ADN nhờ sự liên kết với trình tự đoạn gia tốc (overdrive) [26], operon virE mã
hoá sinh tổng hợp protein VirE1 và VirE2. VirE2 liên kết với T-ADN ở một đoạn
không đặc hiệu, có chức năng giữ cho T-ADN không bị đứt gẫy [5]. Hơn thế nữa

1.3.1.3.3 Vector chuyển gen pCAMBIA2300
Vector pCAMBIA2300 đợc Leon Smith thuộc trung tâm CAMBIA thiết kế
năm 1997 để làm vector chuyển gen vào thực vật. Vector có kích thớc 8742bp với
các thành phần theo sơ đồ:
18
1.3.2. Một số loại enzim thông dụng trong sinh học phân tử
1.3.2.1 Enzim phiên mã ngợc (reverse transcriptase)
Cùng với các enzim giới hạn, enzim phiên mã ngợc có vai trò quyết định
trong quá trình hình thành ngành sinh học phân tử, enzim này do các retrovirus
sản sinh nhằm sao chép bộ gen RNA của chúng trong tế bào chủ. Hiện nay trên thị
trờng có hai loại enzim phiên mã ngợc có nguồn gốc từ AMV (Avian
Myeloblastosis Virus) và thông dụng hơn là từ Mo-MLV (Moloney Murine
Leukemia Virus) vì enzim này hoạt động ở 42
0
C nên đã làm giảm sự tạo vòng của
sợi mRNA. Cả hai loại enzim này đều có hoạt tính 5' - 3' DNA polymerase sử
dụng sợi mRNA làm khuôn mẫu với đoạn mồi là đoạn RNA hoặc DNA có đầu 3'-
OH tự do để sao chép ngợc tạo ra sợi cDNA.
1.3.2.2 Enzim DNA ligase
19
Enzim DNA ligase đợc sử dụng để kết nối hai đoạn DNA. Nó xúc tác cho
phản ứng tạo khung liên kết photphodiester bởi gắn đầu 5'-photphat và đầu 3'-OH
của hai đoạn DNA theo sơ đồ:
5'...pApCpG
-OH
pApApTpTpCpGpT...3'
3'...TpGpCpTpTpApAp
HO-
GpCpAp...5'
Mg

litoralis
Thermus
thermophilus
HB8
Pyrococcus
furiosus
Mesophilic
bacterim
bacillus.
Stearothermop
hilus T-3468
Mr 94kDa - 92kDa 92kDa 76kDa
Tốc độ tổng hợp
(nucleotit/s)
75 >80 >25 >60 >120
20
Độ bền với
nhiệt độ
97,5
0
C
95
0
C
92,5
0
C
10'
40'
130'

Hai loại enzim này do vị trí cắt không đặc hiệu nên không đợc sử dụng
trong kỹ thuật gen.
+ enzim giới hạn loại II: loại này chỉ cần Mg2+ cho hoạt tính phân cắt DNA
và vị trí cắt của nó rất đặc hiệu. Điểm cắt ngay tại nơi enzim gắn vào hoặc kề cận.
Phần lớn vị trí nhận biết của enzim này là một trình tự gồm 4 đến 6 bp (đôi khi là 7
đến 8bp). Khi chúng cắt chuỗi DNA kép thì sẽ tạo thành các đoạn cắt giới hạn có
đầu tận cùng bằng hoặc tù với trình tự các nucleotide đặc trng và xác định.
1.3.2.5 Enzim Mung-bean nuclease
21
Mung-bean nuclease đợc tinh chế từ mầm cây đậu xanh (mung bean) có
hoạt tính nuclease. Enzim này chỉ cắt sợi RNA hoặc sợi đơn DNA mà không cắt
DNA sợi đôi thậm chí cũng không cắt ở trong những điểm mở trên sợi DNA. Nó đ-
ợc dùng để loại bỏ đầu dích sau khi sử lý với enzim giới hạn khác, tạo ra các đầu
bằng giúp cho việc gắn nối các đoạn DNA đợc dễ dàng hơn.
5'...pApCpG
-OH
pApApTpTpCpGpT...3'
3'... TpGpCpTpTpApAp
HO-
GpCpAp...5'
Mung Bean nuclease Zn
++

<100mM NaCl
5'...pApCpGp + CpGpT...3'
3'... TpGpCp GpCpAp...5'
1.3.3 Một số kỹ thuật sinh học phân tử
1.3.3.1 Kỹ thuật điện di phân tích ADN
Phân tử RNA và DNA với các đoạn cắt có khối lợng khác nhau đợc tách ra
khi di chuyển trong điện trờng từ cực âm sang cực dơng của máy điện di. với nồng

Phơng pháp này dùng để xác định sự có mặt và trọng lợng phân tử của
protein. Nguyên tắc của kỹ thuật là dựa vào tính chất liên kết giữa acrylamide và
bisacrylamide theo tỉ lệ 29:1 tạo ra dạng chuỗi polyacrylamide có tác dụng nh một
rây phân tử. Các protein sau khi kết hợp với chất tích điện âm SDS sẽ di chuyển
đợc trong điện trờng từ cực âm sang cực dơng. Khi cho protein di chuyển qua bản
gel acylamide trong điện trờng thì theo thời gian các protein có trọng lợng phân tử
khác nhau sẽ phân bố trên các vị trí khác nhau của bản gel. Protein nào có trọng l-
ợng phân tử nhỏ hơn sẽ di chuyển về cực dơng nhanh hơn. Tuỳ vào nồng độ của
acrylamide mà có thể phân tách đợc các protein với giải trọng khác nhau theo
bảng:
Nồng độ gel acrylamide (%) Giải trọng lợng phân tách (kD)
15
10
7,5
5
12 ữ 43
16 ữ 68
36 ữ 94
57 ữ 212
Sau khi dừng điện di, vạch protein trên gel đợc phát hiện bằng nhuộm gel
với chất màu là Coomassie Brillian Blue R250 hoặc muối nitrate Bạc. So sánh vị trí
của các protein này với thang protein chuẩn ta sẽ xác định đợc trọng lợng phân tử
của chúng. Phơng pháp này có thể phát hiện vạch protein với hàm lợng 10ng.
Ngoài ra, phơng pháp còn có thể xác định số chuỗi polypeptit của phân tử
protein bằng cách bổ sung vào đệm mẫu protein -Mecaptoetanol. Chất này sẽ cắt
các cầu liên kết disulfua giữa các chuỗi polypeptit tạo các tiểu phần nhỏ. So sánh
băng điện di khi không có -Mecaptoetanol ta sẽ biết đợc phân tử protein cấu trúc
từ bao nhiêu tiểu phần cùng với kích thớc phân tử của các tiểu phần.
23
1.3.3.3. Kỹ thuật RT-PCR

Oligo(dT)
12-18
primer
3'-OH 5'
AAA(A)
n
đuôi poly(A) đầu 3'
Oligo(dT)
12-18
primer
3'-OH 5'
5' 3'
cDNA : mRNA
- Khuếch đại gen quan tâm bằng PCR: Sau khi sợi cDNA thứ nhất đợc tổng
hợp thì kỹ thuật PCR đợc áp dụng để nhân gen quan tâm với các cặp mồi đặc hiệu
cho gen đó. Trớc tiên sợi cDNA tách khỏi mRNA bởi nhiệt, sau đó đoạn mồi 1 sẽ
kết cặp bổ sung với sợi cDNA thứ nhất để tổng hợp sợi DNA thứ hai. Tiếp theo các
sợi DNA kép này sẽ đợc nhân lên sau mỗi vòng lặp của phản ứng.
1.3.3.4. Kỹ thuật Western blotting
Kỹ thuật western blotting là kỹ thuật lai protein-protein. Protein mẫu sau
khi đợc phân tách bằng điện di gel acrylamide sẽ đợc chuyển sang cố định trên
một chất giá cũng bằng điện di. Chất giá thờng sử dụng là các loại màng khác nhau
nh màng nitrocellulose, diazophenylthio (DPT), diazobenzyloxymethyl (DBM),
nylon...Protein đã cố định trên màng sẽ đợc phát hiện bằng phản ứng miễn dịch
kép gồm hai giai đoạn
+ Protein mẫu cố định trên màng đóng vai trò một kháng nguyên sẽ kết hợp
với protein khác có tính chất là một kháng thể kháng lại protein này (kháng thể thứ
nhất). Kháng thể đợc tạo ra nhờ gây phản ứng miễn dịch khi tiêm protein mẫu vào
thỏ hoặc chuột và sau đó tách lấy kháng thể từ huyết thanh của chúng.
+ Kháng thể thứ nhất lại tiếp tục đợc lai với kháng thể thứ hai (kháng thể