THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN YẾU TỐ TĂNG
TRƯỞNG NGUYÊN BÀO SỢI 10 CỦA NGƯỜI
(HFGF-10 -HUMAN FIBROBLAST ROWTH
FACTOR -10) Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT BẬC CAO

Nguyễn Bích Nhi
Viện Công nghệ Sinh học
Masashi Suzuki
National Istitute of Bioscience and Human Technology,
Tsukuba, Japan

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGFs (Fibroblast
Growth Factor) là những polypeptide thuộc nhóm cytokine,
được tiết ra ở các tế bào động vật, có hoạt tính gây phân
bào mạnh. Các thành viên của nhóm FGF đóng vai trò quan
trọng trong nhiều quá trình sinh lí như quá trình sinh
trưởng, biệt hóa tế bào, hình thành các mô, thành mạch
máu, sửa chữa và làm lành vết thương (Mc Keehan và
cs., 1998).

Nhiều thành viên của nhóm FGF có chứa đoạn tín hiệu
peptide mã hóa cho các protein tiết. FGF-10 là thành viên
thứ 10, dược phát hiện ra bởi Yamasaki và cs., 1996. cDNA
của hFGF-10 mã hóa cho một protein gồm 208 acid amin,
trong đó 40 acid amin đầu (đầu N) có tính kị nước cao, là
đoạn có vai trò như một tính hiệu peptide (Yamasaki và cs.,
1996, Emoto và cs., 1997. Do đó FGF-10 có thể có khả
năng tiết. Nhiều thành viên của nhóm FGF như FGF-5
(Bates và cs., 1991; Ozawa và cs., 1998, Clements và cs.,

vật có vú:

Dựa vào trình tự của toàn bộ đoạn gen hFGF-10 (số đăng kí
trong Gen Bank là AB 002097 DDBJ), cặp mồi để nhân
hFGF-10 đã được thiết kế sử dụng vector pcDNA3.1(-)
Myc-His để biểu hiện ở tế bào động vật có vú với đầu 5'
gắn thêm vị trí cắt của enzyme giới hạn XhoI và đầu 3' gắn
vị trí cắt của enzym HindIII. Trình tự cặp mồi như sau:
2. Phản ứng RT-PCR (Reverse transcriptase - PCR) :

Để thu nhận cDNA (complementary DNA - ADN bổ trợ)
từ ARN tổng số được tách ra từ não người và cung cấp bởi
hãng Toyobo, phản ứng phiên mã ngược RT (Reverse
transcriptase) đã được tiến hành trong tổng thể tích 50 l
với các thành phần phản ứng bao gồm 10l đệm 5 X RT,
2l mồi ngẫu nhiên -hexamer (60 ng/l), 5l DTT - dithio
threitol (0.1 M), 8l hỗn hợp dNTPs (2.5 mM), 0.5l
RNasin (40 U/l), 2l enzyme phiên mã ngược -MMLV
Reverse transcriptase (200 U/l), 18.5l nước cất vô trùng
và 4l ARN tổng số (250 ng/l). Phản ứng được tiến hành
ở 37
o
C trong 75 phút. Sau đó hỗn hợp phản ứng (cDNA đã
được tổng hợp) được pha loãng 10 lần bằng nước cất và
bảo quản ở -20
o
C.

được tinh chế bằng Qia Quick Kit đã được cắt bằng enzyme
NsiI và ScaI. Phản ứng cắt kiểm tra được tiến hành trong
tổng thể tích là 10l với các thành phần như sau: 1l đệm
10X NsiI (hoặc đệm NE-II đối với ScaI), 2l sản phẩm
PCR, 0.8l NsiI enzyme. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37

C
trong 1 giờ. Sản phẩm thủy phân được điện di để kiểm tra
trên gel agarose 1% để kiểm tra (hình 2).

Hình1: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%. Đường
chạy số 1: Thang ADN chuẩn bậc thang 123bp, đường chạy
số 2: sản phẩm PCR; đường chạy số 3: thang ADN chuẩn
/HindIII. Hình 2. Kiểm tra cắt sản phẩm PCR bằng enzyme ScaI .
Đường chạy số 1: Thang ADN chuẩn bậc thang 123 bp;
đường chạy số 2: sản phẩm PCR sau khi bị cắt bởi ScaI. Kết quả nhận được ở hình 3 cho thấy sản phẩm PCR sau
khi bị thủy phân bởi enzyme ScaI có 1 điểm cắt trong trình
tự của hFGF-10 tại vị trí 273 sản phẩm PCR sau khi xử lí
ScaI được chia thành 2 băng nhỏ hơn có kích thước khoảng
273 và 357 bp (hình 3, giếng 2). Như vậy sơ bộ có thể cho
rằng sản phẩm PCR nhận được có nhiều khả năng là hFGF-
10.

2. Tách dòng hFGF-10:

lạc. Lấy một ít khuẩn lạc bằng đầu côn cho vào ống
eppendorf vô trùng có chứa 50l đệm TE (10mM Tris,
1mM EDTA pH8) có bổ sung 0.1% Tween 20. Trộn đều và
ủ ở 95

C trong 10 phút. Li tâm nhanh. Lấy 2l dịch nổi làm
mẫu để chạy PCR với thành phần như sau: 2l 10 X đệm
PCR, 2ldNTPs (200 mol), 2l mỗi loại Lgh và Rgh mồi
được cung cấp bởi Kit, 0.2l Taq DNA polymerase.
Chương trình PCR như sau: 30 chu trình của 94

C trong 30
giây, 52

C trong 40 giây , 72

C trong 1 phút; tiếp theo 72

C
trong 5 phút và kết thúc ở 4

C. Sau khi chạy PCR, phân
tích sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 1.5% (hình 3).

Hình 3. Điện di phân tích khuẩn lạc bằng phương pháp
PCR . Đường chạy số 1: Thang ADN chuẩn /HindIII;
đường chạy số 2,3: sản phẩm PCR của khuẩn lạc 1 và 2;
đường chạy số 4:thang ADN chuẩn bậc thang 123 bp.
hiệu quả protein tái tổ hợp. Promotor của vector -human
cylomegalovirus (CMV) cho phép biểu hiện cao ở nhiều
loại tế bào động vật có vú. Vector biểu hiện pcDNA3.1(-)
Myc-His và vector tách dòng có chứa đoạn gen hFGF-10
cùng được xử lí bằng XhoI và HindIII, sau đó sản phẩm
vector và gen đã xử lí enzyme được kiểm tra trên gel
agarose 1% và tinh chế bằng phương pháp thôi gel, sử dụng
Qia Quick Kit. Sau khi tinh sạch và xác định hàm lượng,
gen được gắn vào vector nhờ phản ứng gắn sử dụng
enzyme T4-ligase với thành phần như sau: 0.75l đệm gắn
T4, 3l vector đã xử lí (250ng/l), 3.5l gen hFGF-10
(insert) đã xử lí (60ng/l) và 0.25l T4-ligase. Phản ứng
được thực hiện ở 16C qua đêm. và cấy trải trênaTiếp đó
hỗn hợp phản ứng được biến nạp vào tế bào khả biến DH5
đĩa LB có bổ sung ampicilline (50g/ml) và nuôi trong tủ
ấm 37C qua đêm. Các khuẩn lạc được nuôi nhân trong
môi trường LB lỏng có bổ sung ampicilline và tách ADN
plasmid. Kiểm tra sự gắn của gen vào vector biểu hiện
pcDNA3.1(-)Myc-His bằng cách xử lí ADN plasmid tách
được bằng 2 enzyme XhoI và HindIII. Kết quả được thể
hiện trên hình 4.

Hình 4. Các ADN plasmid được xử lí bằng enzyme XhoI và
HindIII. Đường chạy số 1-5: ADN các plasmid từ 1-5 được
xử lí bằng XhoI và HindIII; đường chạy số 6: Thang ADN
chuẩn bậc thang 123bp. Kết quả trên hình 4 cho thấy chỉ trừ các plasmid số 4
(đường chạy 4) là không chứa đoạn insert, các plasmid còn

S., Morris C.F., Kenney W.C. and Lu H.S. (1998) Protein
Expr.Purf. 12, 189-200.
6. MacArthur C.A., Lawshe A., Shankar D.B.,
Heikinheimo M., Shackleford G.M. (1995) Cell Growth
Differ. 6,817-825.
7. McKeehan W.L., Wang F. and Kan M. (1998)
Prog.Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 59. 135-176.
8. Revest J.M., DeMoerlooze L. and Dickson C. (2000)
J.Biol.Chem. 275, 8083-8090.
9. Santos-Ocampo S., Colvin J.S., Chellaiah A. and Ornitz
D.M. (1996) J.Biol.Chem. 19, 1726-1731.
10. Yamasaki M., Miake A., Tagashira S. and Itoh N.
(1996) J.Biol.Chem. 271,15918-15921.
11. Yoneda A., Asada M., Suzuki M. and Imamura T.
(1999)Biotechniques 27, 576-590.

SUMMARY

Construction of mammalian expression vector For
human fibroblast growth factor-10 (hfgf-10)

Nguyen Bich Nhi
Institute of Biotechnology (IBT), NCST
Masashi Suzuki
National Institute of Bioscience and Human Technology
(NIBH), Tsukuba, Japan Full length human Fibroblast Growth Factor (hFGF-10)
cDNA (650 bp) was amplified from human brain total

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Nguyễn Thị Ngọc
Dao.