BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
  
NGUYỄN VĂN NGHIỄM
NGHIÊN CỨU ðA DẠNG DI TRUYỀN
CÂY KHOAI MÔN – SỌ BẰNG CHỈ THỊ ADN
LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: C«ng nghÖ sinh häc
Mã số: 60.42.80
Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Giang

HÀ NỘI - 2012
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii
LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự quan tâm,
giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi của Thầy Cô, Gia ñình, bạn bè, ñồng
nghiệp trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo TS Nguyễn
Văn Giang, người ñã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo ñóng góp những ý kiến quý
báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới KS. Tống Văn Hải cùng các thầy,
cô và cán bộ trong bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng – Khoa Công nghệ
sinh học ñã giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất giúp em hoàn thành
ñề tài thực tập tốt nghiệp của mình.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Gia ñình, bạn bè, ñồng
nghiệp ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập, ñóng góp
những ý kiến quý báu cho tôi hoàn thành ñược nghiên cứu này.


2.1.3 Phân bố 4
2.2 ðặc tính thực vật 6
2.3 Một số yêu cầu sinh thái của cây khoai sọ 8
2.4 Giá trị kinh tế và sử dụng 9
2.4 Tình hình sản xuất cây khoai môn - sọ 11
2.4.1 Tình hình sản xuất cây khoai môn- sọ trên thế giới 11
2.4.2 Tình hình sản xuất khoai môn - sọ ở Việt Nam 12
2.5 Tình hình nghiên cứu bảo tồn và khai thác sử dụng nguồn gen
khoai Môn – Sọ (Colocasia esculenta(L.) Schott) 14
2.5.1 Các phương pháp bảo tồn 14
2.5.2 Thu thập và ñánh giá nguồn gen 15
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv
2 ða dạng di truyền 18
2.6.1 ða dạng sinh học ( Biology diversity ) 18
2.6.2 ða dạng di truyền ( Genetic diversity ) 18
2.6.3 Hiện tượng ña hình ( Polymophism ) 18
2.6.4. Ý nghĩa việc nghiên cứu ña dạng di truyền sinh vật 18
2.7 Các phương pháp nghiên cứu ña dạng di truyền 19
2.7.1 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu ña dạng di truyền 19
2.7.2 Khái niệm 19
2.7.3 Phân loại bằng chỉ thị phân tử DN 19
2.7.4 Ưu ñiểm của việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu bộ
gen thực vật 21
2.7.5 Ứng dụng chỉ thị phân tử 22
2.7.6 Phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái( kiểu hình) 23
2.7.7 Phương pháp sử dụng chỉ tiêu hóa sinh 24
2.7.8 Phương pháp nghiên cứu ña dạng di truyền dựa vào chỉ thị

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60
5.1 Kết luận 60
5.2 ðề nghị 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi
DANH MỤC VIẾT TẮT MAS : Marker assisted selection
NSCT : Năng suất cá thể
NST : Nhiễm sắc thể
PCR : Polymerase Chain reaction (phản ứng chuỗi polymeraza)
QTLs : Quantitative trait loci
RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA
RFLP : Restriction Fragment Length polymorphism
SSR : Simple sequency repeat
TGST : Thời gian sinh trưởng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii

DANH MỤC BẢNG


4.1 Màu sắc cuống lá 44
4.2 Một số dạng củ của khoai môn - sọ 47
4.4 ðiện di sản phẩm PCR chỉ thị 51
4.5 ðiện di sản phẩm PCR chỉ thị A 52
4.6 ðiện di sản phẩm PCR chỉ thị N07 52
4.7 ðiện di sản phẩm PCR chỉ thị N14 53
4.8 ðiện di sản phẩm PCR chỉ thị Uq 75-100 54
4.9 ðiện di sản phẩm PCR chỉ thị Uq90-102 55
4.10 Sơ ñồ biểu diễn mối quan hệ di truyền của 60 mẫu giống khoai
môn-sọ 59 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 1

PHẦN I. MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề
Cây khoai môn - sọ (Colocasia esculenta), thuộc họ Ráy (Araceae), có
chất lượng củ ngon, cung cấp nhiều vitamin và dinh dưỡng. Khoai môn - sọ
có ưu ñiểm vừa là cây lương thực, cây thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, làm
thuốc chữa bệnh, vừa có tiềm năng chế biến cao. Việt Nam có nguồn gen cây
họ Ráy rất ña dạng và là quê hương của một số loài cây môn - sọ quan trọng
(TANSAO project report, 2002). Trong thời gian vừa qua chúng tôi ñã thu
thập ñược 60 mẫu giống khoai môn - sọ ở các ñịa phương khác nhau. Tuy
nhiên ở các ñịa phương này, tên gọi của các giống khoai môn - sọ không
thống nhất. Việc phân biệt các giống khoai môn - sọ chủ yếu dựa vào hình

ðánh giá ñược sự ña dạng di truyền giữa các dòng giống khoai môn- sọ
bằng chỉ thị phân tử SSR, RAPD kết hợp phân tích một số ñặc ñiểm nông sinh
học của 60 mẫu giống khoai môm- sọ thu thập
Yêu cầu
- Trồng các mẫu giống khoai môn-sọ, nghiên cứu các ñặc ñiểm nông
sinh học chính.
- Tách ñược DNA các mẫu khoai môn - sọ thu thập.
- Tiến hành phản ứng PCR sử dụng chỉ thị SSR và RAPD.
- Phân tích ña dạng di truyền bằng phần mềm NTSYSpc2.1.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 3

PHẦN II. TỔNG QUAN VỀ VẤN ðỀ NGHIÊN CỨU

2.1. Giới thiệu về cây khoai môn sọ
2.1.1. Nguồn gốc
Cây khoai môn - sọ (Colocasia esculenta) là cây một lá mầm thuộc chi
Colocasia, họ Araceae.

antiquorum. Một số khác lại cho rằng chi Colocasia có một loài ña hình là C.
antiquorum và ở mức ñộ dưới loài là C. antiquarum var. typica, C. antiquorrum
var. antiquorum, C. antiquorum var. esculenta…Tuy nhiên có trường phái lại
cho rằng, chắc chắn có hai loài là C. esculenta và C. antiquorum ñược phân biệt
dựa vào hình thái hoa. Theo quan ñiểm này thì loài Colocasia esculenta có phần
phụ vô tính ở ñỉnh bông mo thò ra khỏi mo hoa, ngắn hơn cụm hoa ñực. Còn loài
Colocasia antiquorum có phần phụ vô tính ở ñỉnh bông mo không thò ra khỏi
mo hoa, dài hơn cụm hoa ñực. Hiện nay có hàng nghìn giống khoai môn sọ
ñang ñược trồng trên toàn thế giới. Các giống ñược phân biệt chủ yếu nhờ vào
các ñặc ñiểm của củ cái, củ con hoặc các ñặc ñiểm của chồi trên cơ sở các ñặc
ñiểm nông học hoặc chất lượng ăn nấu.
2.1.3. Phân bố
Nguồn gen môn sọ phân bố trong ñiều kiện tự nhiên rất ña dạng: ñược tìm
thấy ở ñộ cao từ 1m ñến 1500m so với mực nước biển, có giống sống trong
ñiều kiện bão hoà nước, trong ñiều kiện ẩm hoặc trong ñiều kiện khô hạn
[15]. Có giống sinh trưởng nơi dãi nắng nhưng cũng có giống mọc trong rừng
sâu cớm nắng… Sự tồn tại và phát triển của chúng chủ yếu do nhu cầu tất yếu
của sinh tồn và giá trị kinh tế mà chúng mang lại cho người dân bản ñịa. Việc
trồng và lưu giữ các giống môn sọ ñịa phương ở cấp hộ gia ñình chịu ảnh hưởng
của các nhân tố kinh tế xã hội như: tình trạng kinh tế, tình trạng văn hoá, phong
tục tập quán… Những vùng có sự phân bố lớn của khoai môn sọ là: Cao Bằng,
Lạng Sơn, Sơn La, Lai Châu, Quảng Ninh và Quảng Trị.
Kết quả ñiều tra của Trung tâm Tài nguyên di truyền thực vật, Viện
KHNN Việt Nam cho thấy tuy diện tích trồng môn sọ có xu hướng giảm
trong những năm gần ñây nhưng vẫn còn nhiều giống ñịa phương ñược người
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 5

6

Ngoài ra cây môn sọ còn là loại cây mang ñặc tính văn hoá truyền thống, ñặc
biệt là trong văn hoá ẩm thực truyền thống của người Việt Nam. Nhiều kết
quả nghiên cứu ñã cho thấy, nguồn gen môn sọ ñược bảo tồn khá tốt trong
các vườn gia ñình và một số vùng có truyền thống sản xuất khoai môn sọ như
huyện Yên Thuỷ và ðà Bắc của tỉnh Hoà Bình, huyện Nho Quan tỉnh Ninh
Bình, huyện Thuận Châu tỉnh Sơn La, huyện Tràng ðịnh tỉnh Lạng Sơn và
huyện Thạch An tỉnh Cao Bằng…( Nguỹên Thị ngọc Huệ 2004)
2.2. ðặc tính thực vật
Khoai môn - sọ là cây có khả năng thích nghi cao với ñiều kiện ngoại
cảnh và có khả năng chống chịu ñược với ñiều kiện bất thuận lợi như : khả
năng chịu bóng râm, chịu mặn, ñất có ñộ ẩm cao … vì vậy chúng ñược phân
bố rất rộng rãi.
Cây khoai môn - sọ là cây thân thảo, thường cao từ 0,5m ñến 2,0m.
Cây khoai môn -sọ gồm có 1 củ cái ở giữa thường nằm ở dưới ñất từ ñó phát
triển lên trên, rễ phát triển xuống dưới, trong khi ñó củ con ( cormels ), củ
nách ( daughder corms ) và các thân ngầm ( stolons ) lại phát triển ngang sang
các bên.
a. Rễ
Rễ của loài khoai môn - sọ là rễ chùm mọc từ ñốt mầm xung quanh
thân củ. Rễ ngắn, hướng ăn ngang và mọc thành từng lớp theo hướng ñi lên
thuận với sự phát triển của ñốt, thân củ. Rễ thường có màu trắng và có chứa
anthocianin. Một số kiểu gen có cùng lúc 2 loại rễ: rễ có sắc tố và không có
sắc tố. Rễ phát triển thành nhiều tầng, phụ thuộc vào số lá của cây. Số lượng
rễ có chiều dài rễ phụ thuộc vào từng giống và ñất trồng. Một lớp rễ trung
bình có từ 25 – 30 rễ.
b. Thân củ (củ )

Lá chính là phần duy nhất nhìn thấy trên mặt ñất quyết ñịnh chiều cao
của cây khoai môn - sọ. mỗi lá ñược cấu tạo bởi một cuống lá thẳng và một
phiến lá.
Phiến lá của hầu hết kiểu gen có hình khiên, gốc hình tim, có rốn ở
phần giữa, là ñiểm nối giữa cuống và phiến lá. Phiến lá nhẵn, chiều dài có thể
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 8

biến ñộng từ 20 cm - 70 cm và bề rộng từ 15 cm - 50 cm. kích thước của lá
chịu ảnh hưởng rất lớn của ñiều kiện ngoại cảnh. Lá có thể có màu xanh, xanh
ñốm. Lá khoai cũng có thể biến ñổi khi bị bệnh, ñặc biệt là bị nhiễm vi rút.
Trên phiến lá có 3 phần chính: một gân chạy thẳng từ ñiểm nối dọc lá tới
phiến lá tới ñỉnh phiến lá. Hai vân còn lại chạy ngang về hai ñỉnh của thùy lá.
Cuống lá: thường gọi là dọc lá. Trong nhu mô của dọc lá có nhiều
khoảng trống nên dọc lá thường xốp. Dọc lá mập có bẹ ôm chặt ở phía gốc tạo
nên thân giả. Chiều dài của dọc lá biến ñộng phụ thuộc vào kiểu gen 25 cm -
160 cm. màu của dọc lá biến ñộng từ xanh vàng tới tím ñậm, có khi sọc tím
hay xanh ñậm. Bẹ của dọc thường có dạng ôm có chiều dài khoảng 1/3 chiều
dài của dọc lá. Gần lúc thu hoạch củ, dọc lá càng ngày càng ngắn lại và phiến
lá cũng nhỏ ñi.
d. Hoa, quả, hạt
Hoa thuộc loại ñơn tính ñồng chu, hoa ñực và hoa cái cùng mọc trên
một trục. Cụm hoa có dạng bông mo, mọc từ thân củ, ngắn hơn cuống lá. Mỗi
cây có từ một cụm hoa trở lên.
Quả: mọng có ñường kính khoảng 3 cm – 5 cm và chứa nhiều hạt.
Mỗi hạt ngoài còn có nội nhũ.
2.3. Một số yêu cầu sinh thái của cây khoai sọ
* Nhiệt ñộ

*Chất dinh dưỡng
Cũng như các loại cây trồng lấy củ khác, cây khoai môn- sọ yêu cầu
ñất tốt, ñầy ñủ NPK và các yếu tố vi lượng ñể cho năng suất cao. Những nơi
ñất quá cằn cỗi cần bón nhiều phân hữu cơ.
Cây khoai môn- sọ phát triển tôt nhất trên ñất có ñộ pH khoảng 5,5 -
6,5. Một ñặc tính quý của cây khoai môn - sọ là giống có tính chịu mặn cao.
Chính vì vậy, ở Nhật Bản và Ai Cập cây khoai môn - sọ ñược sử dụng như
cây trồng ñầu tiên ñế khai hoang ñất ngập mặn.
2.4. Giá trị kinh tế và sử dụng
* Thành phần dinh dưỡng
Phần có giá trị kinh tế chính của khoai môn – sọ là củ cái, củ con và
một số giống là dọc lá.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 10
Bảng 2.1 Thành phần các chất trong củ khoai môn – sọ
Thành phần Tỷ lệ
Nước 63 – 85 %
Cacbon hydrat (tinh bột) 13 – 29 %
Protein 1,4 – 3,0 %
Chất béo 0,16 – 0,36 %
Xơ thô 0,60 – 1,18 %
Khoáng 0,60 – 1,3 %
Vitamin C 7 – 9 mg/100g
Thiamin 0,18 mg/100g
Riboflavin 0,04 mg/100g
Niacin 0,9 mg/100g

* Giá trị kinh tế và sử dụng

Châu
Phi
Bắc –
Trung
Mỹ
Nam
Mỹ
Châu
Á
Châu
ðại
Dương

Châu Âu
1998 0,381 1,207 0,0016 0,00076

0,131 0,042
1999 1,421 1,247 0,0018 0,00076

0,130 0,041
2000 1,450 1,276 0,0018 0,00076

0,129 0,042

Diệ
n tích
(triệu ha)
2001 1,463 1,291 0,0018 0,00076

0,127 0,042

Nước có năng suất (
tấn/ha )

Châu lục

Số
nước
trồng
Cao nhất Thấp nhất Cao nhất Thấp nhất
Châu Phi

19
Nigeroa
594.000
Mauritius
16
Egypt
25
Tago
1,2
Bắc +
Trung
Mỹ
6
Dominica
1.150
Antiguaa
and
Barbuda: 8
Mỹ

Papua
Newgiunea
32.000
Wallis and
Futunas
120
Solonon
Island
20,0
American
Sarria
3,3

Nguồn FAO 2001
2.4.2. Tình hình sản xuất khoai môn - sọ ở Việt Nam
Khoai môn – sọ là cây trồng quan trọng trong lịch sử nông nghiệp ở
Châu Á bao gồm cả Việt Nam. Ở nước ta khoai môn – sọ, ñặc biệt là khoai sọ
nước ñược thuần hóa sớm, trước cả cây lúa nước cách ñây khoảng 10.000 –
15000 năm. Nó ñược sử dụng trong các bữa ăn của người dân Việt Nam từ
ngàn ñời nay góp phần quan trọng vào cơ cấu thành phần lương thực của sản
xuất nông nghiệp.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 13
Những vùng có sự phân bố lớn của khoai môn – sọ là: Cao Bằng, Lạng
Sơn, Hòa Bình, Sơn La, Lai Châu, Quảng Ninh và Quảng Trị. Những vùng này
rất ña dạng về hệ sinh thái nông nghiệp và ña dạng về văn hóa dân tộc.
Một số giống khoai môn – sọ như khoai môn – sọ dọc tím có chất
lượng tốt, kích thước vừa phải ñược thị trường ưa chuộng ñang ñược trồng

rất khó tìm thấy chỗ ñứng.
2.5 Tình hình nghiên cứu bảo tồn và khai thác sử dụng nguồn gen khoai
Môn – Sọ (Colocasia esculenta(L.) Schott)
2.5.1 Các phương pháp bảo tồn
Công tác bảo tồn nguồn gen khoai Môn - Sọ trên thế giới có từ lâu
nhưng chỉ ñược quan tâm chú ý nhiều bắt ñầu từ những năm 1990 tới nay.
Bảo quản, lưu giữ chủ yếu là bảo quản Exsitu dưới dạng tập ñoàn nguồn gen
trên ñồng ruộng, trồng trong chậu vại tại các cơ quan nghiên cứu ( Nguyễn
Thị Ngọc Huệ và cs, 2005).
Ngoài phương pháp bảo quản và nhân giống trên ñồng ruộng, các nhà
khoa học còn tiến hành sử dụng phương pháp nuôi cấy mô ñể nhân giống và
bảo quản nguồn gen cây khoai Môn – Sọ. ðây là biện pháp lưu giữ những
nguồn gen miền núi hoặc các dạng hoang dại khó lưu giữ trên ñồng ruộng.
Hiện nay, phương pháp nuôi cấy mô ñược xem như là một công cụ
quan trọng ñể nhân giống sạch bệnh, bảo quản dài hạn nguồn gen và cũng là
phương tiện ñể trao ñổi giống ñối với những cây nhân giống vô tính trong ñó
có cây khoai môn - sọ. ở Solomons, người ta dùng chồi ñỉnh của cây khoai
làm thực liệu nuôi cấy mô ñể nhân giống sạch bệnh và bảo quản dài hạn
(Jackson, 1979).
Hartman (1974) (trích Nguyễn Phùng Hà, 2001) loại trừ bệnh khảm
virus (DMV) bằng nuôi cấy mô phân sinh ở ñỉnh của cây trên môi trường MS
(Murashige và Skoog, 1962) ñược bổ sung KIN (1,0mg/l) và IAA (10mg/l);
Starisky và cs, (1986) ñã sử dụng môi trường MS giảm một nửa nồng ñộ và
ñược bổ sung 1g/lKNO
3
, 10mg/l thiamine, 50mg/l cysteine HCl, 100mg/l
inositol, 100mg/l casein hydrolysate, 30g/l sucrose, 0,5% agar (Oxoid), 5mg/l
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
hàng nghìn giống khoai Môn – Sọ. Hiện tượng tạp bội thể hiện rõ ở các
giống khoai Môn – Sọ ấn ðộ là một ví dụ cho thấy khả năng biến dị kiểu
gen không thể bị bỏ qua.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 16
ðể nhận biết các giống khoai Môn – Sọ người ta có thể dựa vào các
ñặc ñiểm hình thái và thời gian sinh trưởng của giống, màu sắc ruột củ cái,
chỏm củ, dọc lá và phiến lá cũng ñược sử dụng ñể phân biệt các giống khoai
(Plucknett, 1983; Diazuli, 1994).
Davis and Gilmartin (1985) (trích Nguyễn Phùng Hà, 2001) nhấn
mạnh ý nghĩa quan trọng của những mô tả hình thái trong lựa chọn ñặc ñiểm
phân loại giống cây trồng ở mức ñộ dưới loài, ñồng thời cũng là những ñiểm
ñáng chú ý ñối với nhà nghiên cứu nông học và chọn tạo giống. ðối với cây
khoai Môn – Sọ, nhiều nhà nghiên cứu ñã sử dụng những ñặc ñiểm hình thái
ñể xác ñịnh các nhóm giống và ñánh giá sự ña dạng về mặt di truyền.
Ở Hawaii, Tackson và cs (1979) (trích Nguyễn Phùng Hà, 2001) ñã
phân loại 82 giống khoai Môn – Sọ thành các nhóm theo ñặc ñiểm hình thái.
Ví dụ: Nhóm Piko có ñặc ñiểm phiến lá mỏng và vết lõm của thuỳ lá cắt tới
dọc lá. Nhóm Mana bao gồm tất cả các giống có củ cái phân nhóm ở ñỉnh.
Nhóm Manini ñược phân biệt ở màu sắc củ là màu trắng và nhóm Ulaula bởi
màu hồng ở phần gốc của dọc lá…
Ở Nhật Bản, Kumazawa và cs, (1956) ñã thu thập ñược 158 giống
khoai ở Nhật Bản và 42 giống khoai tại ðài Loan và một vài hòn ñảo chính ở
Trung Quốc. Các giống khoai Môn – Sọ ñã ñược phân loại thành 15 nhóm
dựa vào các ñặc ñiểm hình thái. Tuy nhiên, các giống khoai môn do
Kumazawa và cs, (1956) thu thập và nghiên cứu không bảo tồn ñược giống
(Takayanagi và Hirai, 1989) [20]. Vào năm 1989, Takayanagi và cs, ñã thu
thập lại các giống khoai Môn – Sọ ñang ñược trồng tại Nhật Bản và 88 giống