B GIÁO DCăVẨăẨOăTO
TRNGăI HC M TP. H CHÍ MINH

KHÓA LUN TT NGHIP
Tên đ tài:

TIăUăHOÁăMỌIăTRNG NUÔI CY
CHNG Lactobacillus plantarum NT1.5
BNGăPHNGăPHÁPă
QUY HOCH THC NGHIM

KHOA CÔNG NGH SINH HC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH ậ SINH HC PHÂN T GVHD: ThS. DNGăNHT LINH
SVTH : TRN TH KIU
MSSV : 1053012348
KHOÁ: 2010 ậ 2014

Tp.H Chí Minh, tháng 05 nm 2014
SVTH: TRN TH KIU i

LI CMăN
Em xin chân thành gi li cm n đn:
Cô DngăNht Linh và thy NguynăVnăMinh ậ ging viên khoa Công ngh
Sinh hc Trng i Hc M Tp H chí Minh, cô thy lƠ ngi đư tn tình hng dn,
to điu kin, truyn đt kin thc đ em có th hoàn thành tt đ tài.
Chân thành cm n các thy, cô khoa Công ngh Sinh hc trng i Hc M
Tp H Chí Minh đư tn tình ging dy, truyn đt cho em nhng kin thc c bn làm
nn tng đ em có th hoƠn thƠnh đ tài.

1.4. PHN MM QUY HOCH THC NGHIM MINITAB 16.2.0 20
CHNGă2:ăVT LIUăVẨăPHNGăPHÁPăNGHIểNăCU 23
2.1. THIăGIANăVẨăAăIM NGIÊN CU 24
2.2. VT LIU NGHIÊN CU 24
2.2.1. iătng nghiên cu 24
2.2.2. Môiătrng ậ hóa cht 24
2.2.3. Dng c 24
2.2.4. Trang thit b 24
2.3. PHNGăPHÁPăNGHIểNăCU 25
2.3.1. Hot hóa chng 25
2.3.3. Xây dngăđngăcongătngătrng ca L. plantarum NT 1.5 26
TNG QUAN TÀI LIU

SVTH: TRN TH KIU ii

2.3.4. Kho sát nhităđ, pH thích hp cho s tngătrng ca L. plantarum
NT1.5 27
2.3.5. Sàng lc các yu t dinhădng 28
2.3.6. Thit k thí nghim tìm yu t nhăhngăđnăquáătrìnhălênămenătngă
sinh khi theo thit k Plackett- Burman 30
2.3.7. Thí nghim khiăđu 32
2.3.8. Tìm khong tiăuăca các yu t nhăhng chính bngăphngă
pháp leo dc 32
2.3.9. Thí nghim b mt ch tiêuăxácăđnh giá tr tiăuăca các yu t nh
hng chính. 33
2.3.10. Xácăđnh thiăgianătngătrng ca chng L. plantarum NT1.5 trên
môiătrng tiău 33
CHNGă3:ăKT QU NGHIÊN CU VÀ THO LUN 34
3.1 KT QU XÂY DNGăNGăTNGăQUANăGIA MTă T
BÀO VI KHUN VÀ GIÁ TR OD


DANH MC CH VIT TT
ANOVA One-way analysis of variance
CFU Colony forming unit
Cs. Cng s
L. plantarum Lactobacillus plantarum
MRS Deman, Rogosa and Sharpe
Nm nanomet
OD Optical Density
P-B Plackett-Burman
WHO World Health Organization
BSH Bile salt hydrolase
TNG QUAN TÀI LIU

SVTH: TRN TH KIU v

DANH MC HÌNH NH
Hình 1.1 Streptococcus 6
Hình 1.2 Lactobacillus 6
Hình 1.3 Lactobacillus plantarum di kính hinăviăđin t (Reichelt J., 2013)
9
Hình 1.6 Hpăđenătrongăh thngăđiu khin mt quá trình. 13
Hình 1.8 Ma trn b trí thí nghim theo thit k Box ậ Behnken (Box và
Behnken, 1960) 20
Hình 1.9 Giao din phn mm Minitab 16.2.0 22
TNG QUAN TÀI LIU

SVTH: TRN TH KIU i

DANH MC BNG


DANH MCă TH
 th 3.4. Kt qu kho sát ngunănit 40
 th 3.5. Kt qu kho sát ngun Cacbon 42
 th 3.6. Kt qu kho sát ngun mui khoáng 43
 th 3.7.ă th các nhăhng chính (Main Effects Plot) 47
 th 3.1ă th đng mc biu din mi quan h gia mtăđ t bào vi
các cp bin khác nhau 55
 th 3.2ă th b mt biu din mi quan h gia mtăđ t bào vi các
cp bin khác nhau 56
 th 3.9ăngăcongătngătrng ca L. plantarum NT 1.5 theo thi gian
trênămôiătrng tiău 58

TNG QUAN TÀI LIU

SVTH: TRN TH KIU 1
Ngày nay vic sn xut thc phm chc nng cha vi khun probiotic nh
Lactobacilli có tm quan trng ngƠy cƠng tng. Nhng vi khun này có tác dng
kháng khun, lƠm tng giá tr cm quan, dinh dng và mang li li ích sc khe cho
ngi tiêu dùng (Shahravy, 2012).
Vi khun Lactobacillus plantarum NT1.5 đư đc chng minh có kh nng làm
gim cholesterol thông qua vic hp th cholesterol qua màng t bào và kh nng sinh
enzym BSH đng thi có hot tính probiotic nh: kh nng chu pH d dày, kháng
mui mt, kháng khun,ầ (Dng Nht Linh, 2013). Vì vy Lactobacillus plantarum
NT1.5 có th đc ng dng đ sn xut các ch phm probiotic có hot tính làm gim
cholesterol.
Ngày nay, nhu cu s dng thc phm lên men kt hp vi ch phm sinh hc
ngày càng tng.  đáp ng nhu cu này, vic sn xut lng ln sinh khi vi sinh vt
đang đc quan tâm. Do đó, nghiên cu phát trin môi trng nuôi cy mi đ tng
TNG QUAN TÀI LIU

SVTH: TRN TH KIU 3

cng sn xut sinh khi có th dn đn vic sn xut probiotic có hiu qu kinh t hn
(Shahravy, 2012).
Vì vy chúng tôi thc hin đ tài ắTiă uă hóaă môiă trng nuôi cy chng
Lactobacillus plantarum NT1.5 bngăphngăphápăquyăhoch thc nghim”.
Ni dung thc hin:
 Xây dng đc biu đ th hin mi tng quan gia giá tr OD và nng đ t
bƠo tng ng vi tng giá tr OD.
 Xây dng đng cong tng trng ca chng L. plantarum NT1.5, xác đnh thi
gian tng trng ti u ca vi khun.
 Kho sát nhit đ, pH ti u cho s phát trin ca chng L. plantarum NT1.5
 Chn la ngun cacbon, nit vƠ các ngun khoáng.
 Xác đnh các yu t nh hng chính đn quá trình tng sinh khi ca
Lactobacillus plantarum NT1.5 bng thit k Plackett ậ Burman (P - B).

Lp: Bacilli
B: Lactobacillales
H I: Lactobacillaceae
Ging I: Lactobacillus
Ging II: Pediococcus
H II: Enterococceae
Ging: Enterococcus
H III: Leuconoscaceae
Ging: Leuconostoc
H IV: Streptococcaceae
Ging I: Streptococcus
Ging II: Lactococcus
Vi khun lactic là nhng vi khun Gram dng, thng không di đng, không
sinh bào t, các phn ng catalase âm, oxydase âm, nitratreductase âm. Nhng vi
khun này có kh nng sinh tng hp nhiu hp cht cn cho s sng rt yu, cho nên
chúng là nhng vi sinh vt khuyt dng đi vi nhiu loi acid amin, base nucleotic,
nhiu loi vitaminầ, bình thng chúng không có cytochrome. Vì vy, chúng đc
xp vào nhóm vi khun k khí tùy nghi, hoc gi là vi hiu khí, có kh nng lên men
trong điu kin vi hiu khí cng nh k khí.
TNG QUAN TÀI LIU

SVTH: TRN TH KIU 6

LAB có liên kt cht ch vi vi khun có li trên niêm mc rut ca ngi và
đng vt. LAB bao gm khong 20 chi trong đó chi Lactobacillus, Leuconostoc,
Pedicoccus và Streptococcus là nhng chi đin hình (Marcel, 2005).
Trong đó t bào ca chúng có dng hình cu nh Streptococcus, Lactococcus,
Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, hoc hình que nh Lactobacillus.
hay còn gi là quá trình lên
men d hình.
Da vào kh nng lên men đng ngi ta chia LAB thƠnh LAB đng hình và
LAB d hình.
1.1.2.1 Lên men đng hình
Vi khun lactic lên men đng hình gn nh chuyn hóa hoàn toàn đng chúng
s dng thƠnh acid lactic. Trong điu kin tha glucose và oxy hn ch lên men đng
hình 1 mol glucose theo con đng chuyn hóa EMB (Embden ậ Meyerhoff ậ Parnas)
to 2 mol pyruvate. S cân bng oxi hóa kh trong t bƠo đc duy trì thông qua các
quá trình oxi hóa ca NADH, song song đó lƠ s kh pyruvat thành acid lactic. Các
phn ng din ra trong phn nn t bào cht. Các enzym đc trng trong quá trình nƠy
là aldolase và triozophosphateisomerase. Glucose không phi lƠ đng duy nht có th
đc s dng. Vi h thng enzym thích hp, các loi đng khác có th đc chuyn
đi thành glucose hoc mt trong nhng cht trung gian trong quá trình nh glucose-
6-phosphate (hoc trong trng hp đng pentose, ribulose-5-phosphate). Kh nng
s dng các loi đng khác nhau  vi khun lactic thay đi theo loƠi. i din cho
TNG QUAN TÀI LIU

SVTH: TRN TH KIU 8

kiu lên men này là các ging Lactococcus, Streptococcus,Petiococcus và
Lactobacillus nhóm I. (Desantis và cs., 1989)
1.1.2.2 Lên men d hình
Lên men d hình s dng con đng pentose phosphate, cách gi khác là con
đng phosphoketolase pentose. Mt phân t glucose-6-phosphate ban đu b kh
hydro thành 6- phosphogloconate vƠ sau đó kh nhóm carboxyl hình thành mt phân t
CO
2
. Kt qu là pentose -5- phosphate b chia ra thành mt glyceraldehyde phosphate
(GAP) và mt phân t acetyl phosphate. GAP sau đó đc chuyn hóa thành lactate

nghi. Trong chi Lactobacillus, L. Plantarum đc xp vào nhóm vi khun lên men d
hình, có th sng trong nhiu môi trng nh tht, cá, sa, các quá trình lên men thc
vt, thc vt và trong nhiu loi pho mát. (Kohajdová, 2012).
L. plantarum có nhiu đim khác bit so vi các loài lactobacillus khác  nhng
đim sau:
- Có b gen tng đi ln nên có th thích ng vi nhiu điu kin khác nhau
(Kleerebezem và cs., 2003)
- Có th lên men nhiu loi đng.
-Thích nghi cao vi điu kin acid, chu pH thp (Daeschel và Nes 1995).
- Có th chuyn hóa acid phenolic (Barthelmebs và cs., 2000; Barthelmebs và cs.,
2001), phân gii mui tanat nh hot đng ca enzyme tannase (Vaquero và cs., 2004). Hình 1.3 Lactobacillus plantarum di kính hinăviăđin t (Reichelt J., 2013)
1.1.3.3. Li ích ca vi khun L. plantarum
Lactobacillus plantarum có nhiu trong nc bt vƠ đng tiêu hóa ca con
ngi. Nó thng đc s dng trong các quá trình lên men thc phm và làm
probiotic. Các ch phm sinh hc s dng L. plantarum ngƠy cƠng đc công nhn trên
th trng.
TNG QUAN TÀI LIU

SVTH: TRN TH KIU 10

L. plantarum có th nâng cao tính toàn vn rut, hot đng trao đi cht ca các
t bƠo đng rut, kích thích phn ng min dch (Nissen và cs., 2009).
Gim thiu mt s triu chng ri lon tiêu hóa khi điu tr bng kháng sinh
(Lonnermark và cs., 2009).
Theo nghiên cu ca nhóm Karlsson và cng s (2009) đc tin hành  Thy
in cho thy ung trc tip L. plantarum có th tng tính đa dng ca h vi sinh vt 
rut kt.

lactic/ g tinh bt đc s dng).
Farooq và cng s (2012) đư s dng mt r đng (ph phm ca quá trình sn
xut đng mía) làm ngun cacbon trong môi trng ti u thu sinh khi ca vi khun
Lactobacillus delbrueckii.
Nm 1995, Oh và cng s đư công b nghiên cu v các giá tr ti u ca trypton,
cao nm men, glucose, nhit đ nuôi cy cho s tng trng ca Lactobacillus casei
YIT 9018. Kt qu giá tr ti u ca các yu t nh hng đn s phát trin ca L.casei
YIT 9018 nh sau: trypton, 3,04%; cao nm men, 0,892%; glucose, 1,58%; nhit đ
nuôi cy là 35
o
C.
Nm 2006, Zhong đư công b nghiên cu v ti u hóa môi trng nuôi cy
Lactobacillus casei LC2W bng phng pháp b mt đáp ng đ tng cng sn xut
exopolysaccharid. Kt qu ti u các điu kin nuôi cy đ sn xut exopolysaccharid:
nhit đ nuôi cy là 32,5°C và thi gian nuôi là 26 gi.
1.2.2. Các nghiên cuătrongănc
Nm 1996, Nguyn ng Dip và cng s đư công b nghiên cu v môi trng
nuôi vi khun lactic tt nht. Môi trng đó lƠ sa gy hoàn nguyên vi thi gian lên
men tt nht là 18-20 gi, b sung ging 2-3%.
Trong công b nghiên cu ca Nguyn Th Hng Hà và cng s nm 2003 đư s
dng hai chng Bifidobacteria bifidum và Lactobacillus acidophilus đ sn xut ch
phm probiotic. Tìm ra đc ba môi trng thích hp nuôi cy vi khun Bifidobacteria
bifidum lƠ môi trng thyoglycolat, môi trng nc chit gan, môi trng nc chit
tht bò  điu kin nuôi cy k khí. Môi trng thích hp cho L. acidophilus là môi
TNG QUAN TÀI LIU

SVTH: TRN TH KIU 12

trng MRS, môi trng nc chit cƠ chua, môi trng nc chit giá, môi trng
nc thi ca Công ty sa Vinamilk.

Hình 1.6 Hpăđenătrongăh thngăđiu khin mt quá trình.
Các tín hiu đu vƠo đc chia thành ba nhóm: (Giang Th Kim Liên, 2009)
1) Các bin kim tra đc vƠ điu khin đc, mƠ ngi nghiên cu có th
điu chnh theo d đnh, biu din bng vect:
Z = [Z1, Z2, , Zk]
2) Các bin kim tra đc nhng không điu khin đc, biu din bng
vect:
T = [T1, T2, , Th]
3) Các bin không kim tra đc vƠ không điu khin đc, biu din bng
vect:
E = [E1, E2, , Ef]
Các tín hiu đu ra dùng đ đánh giá đi tng là vect Y = (y1, y2, , yq).
Chúng thng đc gi là các hàm mc tiêu. Biu din hình hc ca hàm mc tiêu
đc gi là mt đáp ng (b mt biu din). Phng pháp toán hc trong x lý s liu
t k hoch thc nghim lƠ phng pháp thng kê. Vì vy các mô hình biu din hàm
mc tiêu chính là các mô hình thng kê thc nghim. Các mô hình này nhn đc khi
có công tính nhiu ngu nhiên.
1.3.1.3. u đim v quy hoch thc nghim
Quy hoch thc nghim đóng vai trò quan trng trong khoa hc k thut. Các mô
hình lý thuyt, gii thut, quá trình mi luôn đc kim nghim thc trc khi đem ra
TNG QUAN TÀI LIU

SVTH: TRN TH KIU 14

ng dng. Hn na, quy hoch thc nghim còn có Ủ ngha b sung, hoàn chnh các
kt qu nghiên cu sáng to lý thuyt đư đc phát trin (Giang Th Kim Liên, 2009).
Có th nói, lý thuyt quy hoch thc nghim t khi ra đi đư thu hút s quan tâm
và nhn đc nhiu đóng góp hoƠn thin ca các nhà khoa hc. Nhng u đim rõ rt
ca phng pháp này so vi các thc nghim c đin là: (Giang Th Kim Liên, 2009)
− Gim đáng k s lng thí nghim cn thit.

tác ca mt ma trn đy đ. Tuy nhiên, điu nƠy không có ngha lƠ thông tin v s
tng tác không th đc xác đnh t thit k Plackett-Burman (Plackett và Burman,
1946).
Vi mt thit k Plackett - Burman gm n thí nghim (vi n là bi s ca 4, n ≤
100, ngoi tr n = 92 lƠ cha th xác đnh) vi s yu t k ≤ (n - 1).
Nh vy thit k Plackett ậ Burman là thit k tit kim thi gian và s thí
nghim nht vi s yu t cn kho sát là cao nht. Thit k Plackett ậ Burman là mt
thit k không th thiu khi đi tng đang nghiên cu cha có nhiu thông tin v các
yu t có kh nng nh hng chính đư đc kho sát (Plackett và Burman, 1946).
Vic chn các ma trn mà s ph thuc vào s yu t thí nghim trên cng vi
các phng pháp la chn đ xác đnh sai s thí nghim.
Có nhiu cách đ xác đnh sai s thí nghim nh (Plackett vƠ Burman, 1946):
- Chn đim trung tâm và cho mt s thí nghim ti đim đó.
- Lp li toàn b ma trn thí nghim.
- Thc hin nhiu phép đo đc lp trong t hp.
 Phân tích kt qu thí nghim
Sau khi th nghim đc tin hành, d liu t thí nghim đc s dng đ tính
toán các hiu ng vƠ đ xác đnh Ủ ngha thng kê ca nhng hiu ng (Plackett và
Burman, 1946).
 tính toán các hiu ng, nhp các giá tr trung bình vào ma trn. Sau đó, so
sánh s khác bit gia các đáp ng trung bình  mc cao vƠ đáp ng trung bình  mc
thp. Các nh hng ca yu t luôn luôn thay đi trong các phn ng khi đi t cp đ
thp đn cp đ cao. (Plackett và Burman, 1946)
TNG QUAN TÀI LIU

SVTH: TRN TH KIU 16

Xác đnh đc mc đ đ thit lp các yu t ph thuc vào mc tiêu th nghim
(Plackett và Burman, 1946):
Nu mc đích lƠ đ ti đa hóa mt phn ng, tt c các yu t có tác đng tích