1

A. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Tính cấp thiết của luận án
Ô đầu, Phụ tử là những vị thuốc quý, đã được dùng khá phổ
biến trong Y Dược học cổ truyền. Hiện nay trên thế giới, đang có
những nghiên cứu về chi Aconitum L. nhằm phát triển các sản phẩm
theo hướng hiện đại, nâng cao hiệu quả sử dụng các loài thuộc chi
này trong phòng và điều trị bệnh.
Ở Việt Nam, cây Ô đầu được trồng nhiều ở huyện Quản Bạ, Đồng
Văn, tỉnh Hà Giang và được người dân địa phương sử dụng theo kinh
nghiệm làm thuốc chữa bệnh đau nhức xương khớp hoặc nấu cháo ăn
để tăng cường sức khoẻ. Hàng năm nước ta có nhiều vụ ngộ độc do
sử dụng nhầm lẫn, đầu độc bằng dược liệu, chế phẩm có nguồn gốc
từ cây Ô đầu. Do đó cần có tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu và
phương pháp xác định nhanh nguyên nhân gây ngộ độc cây Ô đầu.
Theo quyết định phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu
đến năm 2020 và định hướng đến năm 2030 của Thủ Tướng Chính
phủ, cây Ô đầu được quy hoạch trồng tại tỉnh Hà Giang. Để phát
triển vùng trồng cây Ô đầu một cách bền vững, cần có nghiên cứu
theo hướng ứng dụng trong Y Dược học hiện đại, góp phần phát triển
sản phẩm từ cây Ô đầu, nhằm tạo đầu ra cho cây Ô đầu Hà Giang.
Để đóng góp về mặt khoa học, thực tiễn và góp phần giải quyết
những vấn đề nêu trên, luận án với tên đề tài “Nghiên cứu thành
phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây Ô đầu
(Aconitum carmichaeli Debx.) trồng ở tỉnh Hà Giang” được thực
hiện.

2

2. Mục tiêu và nội dung chính của luận án

trong Ô đầu, Phụ tử
- Đã chiết xuất phân lập được 5 alcaloid, 4 flavonoid, 2 sitosterol và
5 chất nhóm acid béo, este. Trong đó có 2 chất mới là: 5,7,3
'
-
trimethoxyquercetin 3-O-β-D-fructofuranosid và (Z)-3-
hydroxypentan-2-yl-10-aminooctacos-9-enoat. Các chất lần đầu tiên
phân lập được từ chi Aconitum là: acid 9-chlorooctadecanoic, acid 3-
chloroicosanoic, acid 8-chlorohexadecanoic, 3-hydroxypropane-1,2-
diyl dihenicosanoat, 7,4′-O-dimethylluteolin 5-O-[α-L-
arabinofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid], quercetin 3-O-

-L-
rhamnopyranosid, quercetin 3-O-β-D-galactopyranosid
* Về độc tính cấp và tác dụng sinh học:
- Đã xác định được LD
50
của 2 phân đoạn dịch chiết chứa alcaloid là:
991.36 ± 176.78 (mg/kg) và 27.257 ± 7.071 (mg/kg)
- Đã xác định ở liều tối đa chuột có thể uống 12g phân đoạn dịch
chiết chứa flavonoid/kg và 15 g phân đoạn chứa polysaccharid/kg tể
trọng chuột mà không có chuột nào chết.
- Phân đoạn alcaloid (PĐ E) chiết xuất từ Phụ tử với liều 12.5
mg/kg/ngày, 25 mg/kg/ngày và 50 mg/kg/ngày uống trong 3 ngày
liên tục, thấy có tác dụng giảm đau thông qua kéo dài thời gian phản
ứng với nhiệt độ, làm tăng khoảng cách gây phản xạ đau và làm giảm
số cơn quặn đau ở tất cả các thời điểm nghiên cứu so với lô chứng.
- Phân đoạn polysaccharid (PĐ I) chiết xuất từ Phụ tử với liều 100
mg/kg và 300 mg/kg thể trọng chuột, thấy có tác dụng kích thích
4

cây Ô đầu tại tỉnh Hà Giang, từ đó nâng cao đời sống nhân dân địa
phương.
5. Bố cục luận án
Luận án gồm 4 chương, 40 bảng, 47 hình, 153 tài liệu tham
khảo, 23 phụ lục. Luận án có 124 trang gồm các phần chính: Đặt
vấn đề (2 trang), tổng quan (27 trang), nguyên vật liệu và phương
pháp nghiên cứu (13 trang), kết quả nghiên cứu (57 trang), bàn luận
(23 trang), kết luận và kiến
nghị (2 trang).
B. NỘI DUNG LUẬN ÁN
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
Đã tập hợp và trình bày có hệ thống các kết quả nghiên cứu
từ trước tới nay về thực vật học, thành phần hóa học và tác dụng
sinh học của chi Aconitum trên thế giới và ở Việt Nam.
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Nguyên vật liệu
Thu hái mẫu cây Ô đầu trồng ở huyện Quản Bạ tỉnh Hà
Giang. Lấy củ mẹ, củ con khi cây đã ra quả và lụi. Lấy lá cây khi cây
mới ra quả. Nguyên liệu được sấy khô ở 60
0
C, bảo quản trong túi
polyetylen kín, khô ráo. Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thuần chủng
cả 2 giống khoẻ mạnh, khoảng 06 tuần tuổi, trọng lượng khoảng 20±
2 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, do Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung Ương
cung cấp. 6


nhắt trắng bằng phương pháp Koster, mâm nóng và máy tail-flick.
- Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch của phân đoạn chứa
polysaccharid trên mo hình gây suy giảm miễn dịch cấp bởi
cyclophosphamid
- Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của phân đoạn
chứa flavonoid trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng
CCl
4

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật
- Căn cứ vào kết quả phân tích đặc điểm hình thái, khóa phân loại
thực vật chí Trung Quốc (2001) và giải trình tự gen ADN, so sánh
với ADN của loài thuộc chi Aconitum để xác định tên khoa học cây
Ô đầu ở Hà Giang là: Aconitum carmichaeli Debx.
3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học
3.2.1. Xác định thành phần hóa học
- Định tính các nhóm chất hữu cơ: đã xác định trong cây có các
nhóm chất chính là alcaloid, flavonoid, polysaccharid, ngoài ra còn
có một số nhóm chất khác: acid béo, este, sterol…
- Định lượng các nhóm chất alcaloid, flavonoid, polysaccharid:
+ Áp dụng phương pháp acid-base để xác định hàm lượng alcaloid
toàn phần trong Ô đầu, Phụ tử cùng 2 phân đoạn D, E chiết từ Phụ tử
cho kết quả lần lượt như sau: 0.93 %, 0.70 %, 28.61 %, 26.83 % tính
theo aconitin.
+ Áp dụng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng aconitin
trong Phụ tử, Ô đầu cùng 2 phân đoạn D, E chiết từ Phụ tử cho kết
quả lần lượt như sau: 0.072 %, 0.125 %, 0.066 %, 0.015 %.
8


Căn cứ vào phản ứng hóa học đặc trưng để dự kiến nhóm chất, căn
cứ vào phổ IR, MS,
13
C-NMR,
1
H-NMR, DEPT 135, DEPT 90,
HSQC, HMBC và so sánh với dữ liệu phổ đã công bố của chất tương
ứng để xác định cấu trúc của các chất phân lập được như sau:
Chất OD7:

Hình 3.18. Cấu trúc của chất OD7
OD7 hiện màu với thuốc thử Dragendorff nên dự kiến chất OD7
thuộc nhóm alcaloid. Phổ IR xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại

đặc trưng
cho các nhóm liên kết O-H, C-H, C-N, C-O-C. Phổ khối ESI-MS của
chất cho pic ion phân tử ở m/z 590 [M+H]
+
tương ứng với khối lượng
phân tử M= 589. Phổ
13
C-NMR, DEPT 135, DEPT 90 cho thấy chất
OD7 xuất hiện 31 tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho sự có mặt của
31 nguyên tử carbon trong đó có 1 nhóm methyl, 4 nhóm methoxy, 6
C trong vòng benzen thế, 4 nhóm methylen, 11nhóm methin bão hòa,
2 carbon bậc 4 và 3 carbon C-OH. Phổ
1
N
H
3
CH
2
C
OCH
3
OH
HO
OCH
3
OH
OH
OCH
3
H
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
17
12
13
14
15
16
18
19

N
H
3
CH
2
C
HO
OH
H
H

11

708. Phổ
13
C-NMR và DEPT 90, DEPT 135 cho thấy tín hiệu đặc
trưng của chất có 45 nguyên tử carbon với 2 nhóm CH
3
, 41 nhóm
CH
2
, 2 nhóm C=O. Phổ
1
H-NMR cho thấy sự có mặt của 88 proton
phù hợp với công thức phân tử C
45
H
88
O
5
, đồng thời phổ
1
H-NMR
cho các pic điển hình như: 1.52-1.99 (m, 2H) đặc trưng cho nhóm
CH
2
CO, 3.53 (m, 2H) đặc trưng cho nhóm CH
2
OH, 4.10 (dd, J=4.0
Hz, 7.0 Hz) đặc trưng cho nhóm CHOOC. Các dữ liệu trên, kết hợp
so sánh với dữ liệu phổ đã công bố, khẳng định chất OD4 là: 3-

, 1 nhóm CH và 1
nhóm C=O. Các dữ liệu trên, kết hợp so sánh với dữ liệu phổ đã
công bố, khẳng định chất OD3 là: acid 8-clorohexadecanoic.

Hình 3.24. Cấu trúc OD3: acid 8-clorohexadecanoic
Chất OD1, OD2: khi so sánh phổ IR, NMR của 2 chất này với chất
OD3, với dự liệu phổ đã công bố, khẳng định chất OD2 là acid 3-
cloroicosanoic, chất OD1 là: acid 9-clorooctadecanoic.
Cấu trúc các chất như sau:
12
Hình 3.25. Cấu trúc OD2: acid 3-cloroicosanoic

Hình 3.26. Cấu trúc OD1: acid 9-clorooctadecanoic
Chất OD6: phản ứng với thuốc thử H
2
SO
4
10%/EtOH cho màu hồng
tươi rồi chuyển xanh tím dần chứng tỏ OD6 thuộc nhóm sterol. Phổ
IR xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại đặc trưng cho nhóm O-H, C-H,
>C=C<, C-O-C. Phổ khối ESI-MS của chất cho pic ion phân tử ở
m/z: [M+Na]
+
=599 tương ứng với khối lượng phân tử M=576. Phổ
1
H-NMR có các tín hiệu đặc trưng cho hợp phần β-D-Glucozit như:
gồm 8 tín hiệu đặc trưng cho 8 nguyên tử hidro. Đối với hợp phần β-


của chất F7 với chất OD6 thấy
giống nhau. Như vậy xác định chất F7 phân lập từ lá cũng là
daucosterol.
Chấ t F1: so sánh với phổ IR, NMR của F1 với OD6 thấy có nhiều
điểm tương đồng. Căn cứ điểm khác nhau trên phổ NMR, phổ MS,
kết hợp so sánh dữ liệu phổ đã công bố, khẳng định chất F1 là:
Stigmast-4-ene-3,6-dion.

O
CH
3
CH
3
CH
3
O

CH
3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

3
. Phổ IR xuất hiện đỉnh hấp
thụ cực đại đặc trưng của nhóm -NH
2
, C-H bão hòa, C=O, C-N, C-
O-C. Trên phổ
1
H-NMR của F2 xuất hiện tín hiệu doublet với J = 7.5
Hz tại 5.69 là dạng tín hiệu đặc trưng của liên kết đôi dạng cis. Ngoài
ra, trên phổ
1
H-NMR của F2 xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của
nhóm methyl liên kết với methin với J =7.0 Hz tại 1.09 ppm, hai
nhóm methyl liên kết với methylen với J = 14 Hz, hai tín hiệu của
nhóm methin tại 4.00-4.03 và 3.62 (d, J = 5 Hz) và tín hiệu của 27
nhóm methylen. Trên phổ
13
C-NMR, phổ DEPT 90 và DEPT 135
cho thấy chất F2 xuất hiện tín hiệu của nhóm carbonyl tại 173.1 ppm,
tín hiệu của cacbon bậc 4 olefin liên kết với N tại 162.1 ppm, hai tín
hiệu của nhóm methin liên kết với oxy tại 76.7 ppm và 74.4 ppm, tín
14

hiệu của 3 nhóm methyl và tín hiệu của 27 nhóm methylen. Kết hợp
phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HSQC, HMBC) và so sánh
dữ liệu phổ đã công bố của chất octacosanoic acid và chất pentanol,
khẳng định chất F2 là (Z)-3-hydroxypentan-2-yl-10-am
inooctacos-9-enoat. Cấu trúc như sau:

Hình 3.29. Cấu trúc của chất F2

-trimethoxyquercetin, 7,3
’
,4
’
trimethoxyquercitin, khẳng
định F5 là glucosid của quercetin, có tên là: 5,7,3
'
-
trimethoxyquercetin-3-O-β-D-fructofuranosid. Căn cứ vào điểm đặc
trưng của dữ liệu phổ, so sánh dữ liệu phổ của các chất F3, F4, F5,
F6 với nhau và với các chất có cấu trúc tương ứng, khẳng định chất
F3 là: quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranosid, chấ t F4 là quercetin 3-O-
β-D-galactopyranosid, chất F6 là 7,4’-O-dimethylluteolin 5-O-[α-L-
arabinofuranosyl-(16)-β-D-glucopyranosid]. Cấu trúc các chất:

Hình 3.30. Cấu trúc chất F3
Hình 3.31. Cấu trúc chất F4


uống trong 3 ngày liên tục, có tác dụng kéo dài rõ rệt thời gian phản
ứng với nhiệt độ của chuột so với trước khi uống thuốc (p<0.01) và
so với lô chứng (p<0.05).
- Thời gian phản ứng với nhiệt độ của chuột ở 3 lô uống PĐ E không
có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi so sánh 3 lô với nhau
(p>0.05).
- Thời gian phản ứng với nhiệt độ của chuột ở lô uống codein kéo dài
hơn so với chuột ở 3 lô uống PĐ E có ý nghĩa thống kê (p<0.05).
* Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau của PĐ E bằng máy tail-
flick
17

- Codein phosphat có tác dụng làm tăng rõ rệt khoảng cách gây phản
xạ đau trên máy tail-flick của chuột (p
2-1
<0.001 và p so với trước khi
uống codein phosphat p<0.01).
- PĐ E ở cả 3 liều 12.5 mg/kg/ngày, 25 mg/kg/ngày, 50 mg/kg/ngày,
uống trong 3 ngày liên tục, có tác dụng làm tăng rõ rệt khoảng cách
gây phản xạ đau trên máy tail-flick của chuột so với trước khi uống
thuốc (p<0.01) và so với lô chứng (p<0.05 và p<0.01). Khoảng cách
gây phản xạ đau trên máy tail-flick của chuột ở 3 lô uống PĐ E khác
biệt không có ý nghĩa thống kê khi so sánh 3 lô với nhau (p>0.05).
- Khoảng cách gây phản xạ đau trên máy tail-flick của chuột ở lô
uống codein tăng có ý nghĩa thống kê so với chuột ở 3 lô uống PĐ E
(p<0.05).
* Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau của PĐ E bằng phương
pháp gây đau bởi acid acetic
- Aspirin liều 150 mg/kg có tác dụng làm giảm số cơn quặn đau ở tất
cả các thời điểm nghiên cứu (p<0.01 hoặc p<0.001).

Kết quả khi so sánh giữa các lô chuôt thí nghiệm cho thấy: CY làm
giảm rõ rệt số lượng bạch cầu trong máu ngoại vi của chuột.
Levamisol 100 mg/kg có tác dụng làm tăng bạch cầu máu ngoại vi so
với lô mô hình. PĐ I cả 2 liều không có tác dụng làm tăng bạch cầu
máu ngoại vi so với lô mô hình.
* Kết quả đánh giá miễn dịch dịch thể
19

Kết quả đánh giá ảnh hưởng của thuốc thử lên nồng độ IgG máu
ngoại vi cho thấy: CY làm giảm rõ rệt nồng độ IgG máu ngoại vi
(77.20 ± 1.14 pg/ml) so với lô chứng sinh học (84.98 ± 0.55 pg/ml)
(p < 0.001). Levamisol làm tăng nồng độ IgG máu ngoại vi so với lô
mô hình. PĐ I cả 2 liều 100 và 300 mg/kg thể trọng chuột có tác
dụng làm tăng nồng độ IgG máu ngoại vi (81.92 ± 0.34, 82.44 ±0.49
pg/ml) so với lô mô hình (p < 0.05).
* Kết quả đánh giá miễn dịch qua trung gian tế bào
+ Phản ứng bì với kháng nguyên OA:
Kết quả thử ảnh hưởng của PĐ I đến phản ứng bì với kháng nguyên
OA cho thấy không có sự khác biệt giữa các lô thử so với lô mô hình
và so với lô chứng sinh học.
+ Định lượng các cytokin trong máu ngoại vi:
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc thử đến nồng độ IL-2 cho
thấy: Lô mô hình CY làm giảm rõ rệt nồng độ IL-2 trong máu ngoại
vi (2.97 ± 0.46 pg/ml) so với lô chứng sinh học (7.73 ± 0.23 pg/ml).
Levamisol 100 mg/kg có tác dụng làm tăng nồng độ IL–2 (7.21 ±
1.51

pg/ml) so với lô mô hình. PĐ I liều 100 và 300 mg/kg thể trọng
chuột có tác dụng làm tăng nồng độ IL -2 (5.74 ± 0.97, 7.52 ± 1.24


*Tác dụng chống oxy hoá của phân đoạn C:
Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của PĐ C thông qua khả năng làm
giảm hàm lượng MDA trong dịch đồng thể gan chuột thí nghiệm cho
thấy: PĐ C có tác dụng làm giảm hàm lượng MDA trong quá trình
peroxy hoá do CCl
4
gây ra trên chuột nhắt trắng. Tác dụng giảm hàm
21

lượng MDA phụ thuộc liều lượng. Với liều 10 mg và 20 mg/kg thể
trọng chuột trong 8 ngày không có tác dụng làm giảm sự tăng hàm
lượng MDA (p > 0.05), nhưng với liều 30 mg/kg thể trọng chuột có
tác dụng làm giảm sự tăng hàm lượng MDA trong gan rõ rệt (15.96
% ) so với lô chứng bệnh lý với p < 0.05. Tác dụng của liều 30
mg/kg tương đương với thuốc đối chứng silymarin liều 100 mg/kg
thể trọng (15.96 % so với 17.7 %).

BÀN LUẬN
Trước kia, một số công bố cho thấy các tác giả mới nghiên
cứu về cây Ô đầu ở Sa Pa, tỉnh Lào Cai, cây Ô đầu Hà Giang chưa
thấy có nghiên cứu nào được công bố. Mặt khác, trong các điều kiện
sinh thái khác nhau, một loài thực vật vẫn có sự thay đổi về hàm
lượng, thành phần hóa học, tác dụng sinh học. Đề tài đã xác định tên
khoa học của cây Ô đầu trồng ở Hà Giang bằng phương pháp phân
tích đặc điểm hình thái và giám định ADN giúp xác định rõ nguồn
gốc của cây. Nghiên cứu hóa học đã cung cấp thêm những dữ liệu
hóa học quan trọng (hàm lượng nhóm chất chính, chất mới…) tạo
điều kiện thuận lợi cho công tác kiểm nghiệm dược liệu và các sản
phẩm liên quan đến Ô đầu, Phụ tử. Nghiên cứu độc tính cấp và tác
dụng sinh học gợi mở hướng sử dụng cây Ô đầu trong phòng chữa

đối với thuốc, thực phẩm.
- Đã phân lập được 16 chất gồm: 5 alcaloid, 4 flavonoid, 2 sitosterol
và 5 chất nhóm acid béo, este. Trong đó:
23

+ Từ Phụ tử sống và Ô đầu sống phân lập được 10 chất, gồm 4 chất
lần đầu tiên phân lập từ chi Aconitum là: acid 9-chlorooctadecanoic,
acid 3-chloroicosanoic, acid 8-chlorohexadecanoic, 3-
hydroxypropane-1,2-diyl dihenicosanoat, chất lần đầu phân lập từ
loài A. carmichaeli là: delcosin và 5 chất khác là fuzilin, karacolin,
benzoylmesaconitin, hokbusin A, daucosterol.
+ Từ lá phân lập được 7 chất, gồm 2 chất mới là: 5,7,3
'
-
trimethoxyquercetin 3-O-β-D-fructofuranosid và (Z)-3-
hydroxypentan-2-yl-10-aminooctacos-9-enoat, 3 chất lần đầu tiên
phân lập từ chi Aconitum là 7,4′-O-dimethylluteolin 5-O-[α-L-
arabinofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid], quercetin 3-O-

-L-
rhamnopyranosid, quercetin 3-O-β-D-galactopyranosid và 2 chất
khác là: stigmast-4-ene-3,6-dion, daucosterol.
* Về thử độc tính cấp và tác dụng sinh học:
+ Thử độc tính cấp:
- Đã xác định được LD
50
của 2 PĐ dịch chiết chứa alcaloid E và D
lần lượt là: 991.36 ± 176.78 (mg/kg) và 27.257 ± 7.071 (mg/kg).
Phân đoạn D độc tính cao nên không sử dụng nghiên cứu tiếp và
không ứng dụng trên thực tế được.