I HC QUC GIA HÀ NI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Lại Phƣơng Liên
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7
CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN

LUC

Hà Ni   2013
I HC QUC GIA HÀ NI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
u kic hc tp và nghiên cu trong mng hc
tp
khoa hc, giúp cho tôi có nhng kin thc b ích trong suc.
Cui li bi n bè,nhng
 và tu ki tôi hoàn thành lut nghip.
Tôi xin chân thành c
Hà Ni, ngày 10 tháng 12 
Hc viên thc hin
L
ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BVTV Bo v thc vt
bp Base pair (C)
cDNA complementary (DNA b sung)
ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate
DNA Axit deoxy ribonucleic
dNTP Deoxynucleotidetriphosphates
dsRNA Double stranded RNA (ARN s)
FDV Fiji disease virus (Virus bnh Fiji)
EDTA Axit Ethylenediaminetetra acetic
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (xét nghim hp th min dch liên kt
vi enzyme)
EtBr Ethidium Bromide
IRRI International Rice Research Institute (Vin nghiên cu lúa quc t)
Kb Kilobase
LB ng Luria Bertani


iv

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bng 1 Các cp oligo nucleotide s dng trong nghiên cu.
22
Bng 2 Các biu hin ca bnh lùn s
35
Bng 3 Kt qu sàng lc mu bnh b-ELISA và
RT-PCR mc
40
Bng 4 Trình t các mc hic thit k phc v cho phn ng
RT-PCR
42
Bng 5 So sánh mng nht trình t n S7 phân lp ca các
mu Vit Nam và Trung Quc
54
v

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1 Cây lúa b nhim bnh lùn s
8

Hình 2 Rng Sogatella furcifera truyn virus SRBSDV
9

Hình 3 Cu trúc phân t các Fijivirus
11

Hình 4 T chc b gen ca các Fijivirus
11


12

Hình 6 n RNA sa virus SRBSDV
trên gel polyacrylamide 12,5%.
14


Hình 15 Kt qu n di sn phm PCR vi cp mc hiu ca phân
n S7
43

Hình 16 Kt qu n di sn phm DNA tinh sch bng b kit
GenJET
TM
Gel Extraction trên gel agarose 1%
45

Hình 17  minh ha quá trình dòng hóa S7 vào vector pGEM-T
46

Hình 18 Kt qu bin np sn phm phn ng gn vào E.coli chng
46

vi

DH5
Hình 19 Kt qu n di kim tra sn phm plasmid tinh sch trên gel
agarose 1%
47

Hình 20 Kt qu n di sn phm PCR t plasmid tinh sch S dng
cp mi S7-Fw/S7-Rv
48

Hình 21 Kt qu n di sn phm PCR t plasmid tinh sch s dng
cp mi T7-Fw/SP6-Rv

vii

MỤC LỤC
M U 1
- TNG QUAN TÀI LIU 3
1.1. GII THIU CHUNG V CÁC VIRUS HI LÚA  VIT NAM 3
1.1.1. Các virus gây bnh trên lúa 3
1.1.2. Tình hình nghiên cu virus hi lúa  Vit Nam 3
1.2. BNH LÙN S 5
1.2.1. Gii thiu chung v bnh lùn s 5
1.2.1.1. Ngun gc phát sinh bnh lùn s 5
1.2.1.2. Din bin bnh lúa lùn si Vit Nam 6
m bnh hc ca bnh lùn s 7
1.2.2.1.Du hiu nhn bit 7
1.2.2.2. Vector truyn bnh 8
m sinh hc ca virus SRBSDV 10
1.2.3.1. Phân loi 10
m hình thái ca SRBSDV 12
m di truyn ca virus SRBSDV 12
1.2.3.4. n S7 và kh n hóa ca SRBSDV 14
1.2.3.5. Chu 16
1.2.4. Tình hình nghiên cu bnh lùn s Vit
Nam 17
1.2.4.1. Các nghiên cnh virus SRBSDV 17
1.2.4.2. Các nghiên cu v quy trình ch 19
- VT LIU 21
2.1. VT LIU 21

3.2.2. Sàng lc mu bnh b-c 39
3.3. Phân lp h gen ca các mu SRBSDV 39
3.4. Phân ln S7 ca SRBSDV thu thp t mu lúa bnh 41
3.5. Nhân bn S7 b-PCR 43
3.5.1. Thit k n mc hiu cho phn ng RT-PCR phc v nhân bn S7 43
3.5.2. Nhân bn S7 b-PCR 43
ix

3.6. Tinh sch sn phn S7 ca virus SRBSDV 44
n S7 vào vector PGEM-T 45
3.7.1. To plasmid tái t hp PGEM-T/S7 bin np vào t bào E.coli ch 45
3.7.2. Kim tra s có mn S7 





 47
3.7.2.1. Kim tra s có mn S7 





ng phn ng PCR. 47
3.7.2.2. Kim tra s có mn S7 





dn mt cân bng sinh thái. u kin thích hp, các tác nhân gây bnh trên
lúa có th phát trin rt mnh, làm git ti trên 85%, thm chí mt trng.
t trong nhng nguyên nhân chính làm git, dn sng
nông nghip không nh và gây tình trng mt an ninh c.
Trong s các tác nhân gây bnh trên lúa, virus là mm bnh nguy him nht do
kh t rng thi rt khó kim soát.  Vit Nam, virus gây ra mt
s bnh rt nguy him, ng nghiêm trng ti snh vàng lùn,
bnh lùn xon lá, bnh lùn s n 2010, dch bnh lúa
lùn s lu tiên bùng phát và gây hi ti 28 tnh min Bc và Trung vi tng
din tích nhim bnh lên ti c   ha, gây thit hi ln cho sn sut Nông
nghip. Mc dù, nguyên nhân gây bu nh là virus gây bnh
lúa lùn sch bm thi lng xun
bin gây bnh vn tn ti trong sn suc bit, virus SRBSDV là chng vius
mi xut hin nên tt c các nghiên c
sinh hc, (3) dch t bnh và (4) phòng chng bnh cn phc nghiên cu. Thc t
các nghiên cu hin ti vp trung vào vic hoàn thin quy trình ch, sau
ng các bi b cây bnh, dit trung gian truyn bnh,
trng ging lúa kháng ru chuyên sâu v bn cht
h gene, m ng di truyn, m t bing mi. Vì
phát dch tr li ca loi virus này vn tim n.
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

2

H gen ca SRBSDV có chiu dài 29.124 bp, gn RNA s
c t t tên theo th t t n S10 da vào
kích n RNA s. n S7 có chiu dài 2176 bp, cha hai ORF
có chiu dài 1073 và 930 nucleotide. Trong , ORF 7-1 cha gen 7-nh protein
P7-  c hiu vi vector trung gian truyn bnh là ry
ng (Sogatella furciferatrng trong nghiên c

chính làm sng nông nghip không nh, gây ra tình trng m
thc bit trong bi ci khí hu toàn cu, cân bng sinh thái b phá v do
vic canh tác quá ph thuc vào thuc hóa hn bin phát sinh dch và
m gây hi ca các bnh virus càng tr nên nguy him và phc t
ht. Trong sn xut nông nghip tng cng có 16 loi virus gây hi cho lúa (ph lc 1)
và khoi cho thc vt và các loi cây nông nghi
     các virus hi lúa ngoài Rice hoja blanca virus (mt
Ternuivirus, phân b ti Nam M), Rice giallume virus (mt Luteovirus, phân b ti
châu Âu), Rice stripe necrosis virus (mt Furovirus, phân b ti châu Phi) thì 13 virus
còn lu phát hin thy ti các c trng lúa châu Á. Tuy nhiên có 5 bnh virus gây
hi nghim trng và ph bin nht là: bnh vàng lùn (bnh lúa c), bnh lúa lùn xon
lá, bnh Tungro, bnh lúa sn lùn, bnh vàng lá tm thi.[17,24,26,23,34]
1.1.2. Tình hình nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam
Vit Nam hin có 12/16 loi vius gây hi trên lúa, các bnh do vius gây ra thành
ct dng ni tip nhau  các vùng trng lúa khác nhau trên c c. Tuy
n nay mi ghi nhn 5 loi bnh virus gây thành dch, bao gm bnh vàng lá di
ng, bnh tungro, bnh lúa c, bnh lúa lùn xon, bnh lùn s [15]. Hin
nay, virus gây bnh vàng li lúa (Rice yellow stunt virus  i ti Bc giang
ch [14].
Các nghiên cu v virus  Vit Nam hin mi tp trung  khâu phát hi
áp dng các bi b cây bnh, dit môi gii truyn bnh, trng
ging kháng rt s n Bo v Thc vt và
i hc Nông nghip Hà Ni n quy trình cha trên kháng
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

4

huyt thanh, RT-n xuc kháng huyt thanh cho virus vàng lùn và lùn
t k các cp mc hiu cho phn ng PCR phát hin RGSV, RRSV,
RBSDV, RSV, RTSV, SRBSDV [8, 13]. Các nghiên cu v quan h gia virus vàng

1.2.1.1. Nguồn gốc phát sinh bệnh lùn sọc đen phương Nam.
T t bnh lúa lùn mt hin trên lúa (Oryza sativa) ti
mt s vùng thuc tnh Qu   i Nam, phía Nam Trung Quc. Cây lúa
nhim bnh thm,  mt thân xut hin các nt sn
nhu, virus gây bnh ch t bin chng ca virus lùn s
Mãi ti ga vào các kt qu nghiên cu v môi gii truyn bnh, cu trúc và
bn cht h gen virus, các nhà khoa hc Trung Qut lun nguyên nhân gây bnh
là do 1 chng virus mi vi tên gi virus lúa lùn s Nhóm virus
mi có môi gii truyn bnh riêng bit là rng  mm quan trng và
Fijivirus. Hình dc và cu
a các tiu th i kính hin t có nhm rt
 trình t gen ca 2 bin chng (Quc
nh. Các tính ch mc phân t cho thy trình t gen 
axit amin ca 2 bin ch n so vi s sai khác gia
các bin chng ca các thành viên khác trong nhóm Fijivirus và nm trong khong sai
khác khi so sánh gia các chng vi nhau. Mt khác, nhng khác bit này li g
i Rice black streaked dwarf virus (RBSDV), Maize rough dwarf virus (MRDV)
và Mal de Rio Cuarto virus (MRCV)  các thành viên trong phân nhóm Fijivirus-2 ca
nhóm Fijivirus, so vi các thành viên thu nói
   ng SRBSDV là 1 thành viên mi thuc nhân nhóm 2  cùng vi
RBSDV, MRCV, MRDV, trong nhóm Fijivius, h Reoviridae. Vit tên là lùn sc
 ng v triu chng bnh trên cây
nhim, song virus lùn sp trung ch yu  phía Bc Bán cu trong khi virus
SRBSDV mi ch ghi nhn  các tnh phía Nam Trung Quc [25,24,18]. Ngoài lúa và




























 5.506 ha, trong 


gn 3.510 ha b mt trng. 






 . 







 (TH3-3, Nh 
B 7, Khang dân 18  )  [9]. 




9, 







 , 




 [2].
Báo cáo ti cuc h


















































 , 




 
















 tâm BVTV
, 

NN &PTNT  










2 virus vàng lùn và lùn xon lá và [4].
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

7



9, 10 2009,  




 

 (IRRI). Kt qu nghiên c




 i lúa ti Ngh An và các tnh phía bc trong v mùa
2009 là do SRBSDV [9]. Ngay sau khi tác nhân gây b   nh, B
p ban ch o phòng chng dch lùn s ng Bùi
Bá Bng ban ch o.
Trong v a Cc BVTV, n tháng 10,
bnh lùn sn phát sinh gây hi ti 28 tnh/thành tng din tích b nhim
tính t u v là n tích phi nh ta là 9.000 ha và phi tiêu hy
là 1.700 ha. Các tnh có xut hin bnh lùn sm:
+ Bc B (19 tnh): Bc Kn, Lào Cai, Yên Bái, Lai Châu, L
Bc Giang, Hn Biên, Thái Bình, Ninh Bình, Bc Ninh; Hi Phòng, Hòa
nh, Qung và Hà Nam.
+ Bc Trung B (6 tnh): Ngh An, Tha Thiên Hu, Qung Bình, Qung Tr,

+ Duyên Hi Nam Trung B (3 tnh): Qung Nam, Qung.
nh lùn sm thi lng xung, ch còn ri rác  mt
vài tnh thành. Tuy nhiên, bnh vc phòng tr hoàn toàn, có nhiu kh 
tái bùng phát thành dch.
1.2.2. Đặc điểm bệnh học của bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam
1.2.2.1.Dấu hiệu nhận biết
Biu hin bnh ca cây lúa nhim virus SRBSDV rt ging vi biu hin ca


























 (100 % câ






Hình 2: Rầy lƣng trắng Sogatella furcifera truyền virus SRBSDV[11]
Rng gây hi cùng vi ry nâu nht la thì ry
ng phát sinh r sng có m cao, gây hi nng
y nâu, rng trng thích hp vu kin
khí hu m nóng,  ng xen k.  ng bng sông Hng, mt
-7 la ry, quan trng nht là la ry vào tháng 4 (v xuân) và cui tháng 8
u tháng 9 (v mùa). V ng gây hi n mùa. Rng hi
nng trên các ging lúa nhim ry, lúa lai; nu thâm canh cao, bón nhim, rung
lúa cy dày, rm ru kin cho rng phát sinh, phát trin. R
trng phân b rng rãi trên khp các vùng trng lúa ca Vit Nam và trên th gii, có
kh p và di chuyn rt cao [7].
Mt nghiên cu v c tính lây truyn SRBSDV ca rng Sogatella
furcifera c các nhà khoa hc Trung Quc thc hin nhn
phát trin ca bm soát bnh hiu qu nht. Bng
  -PCR, các nhà khoa h    c s có mt ca virus
SRBSDV trong tt c n phát trin khác nhau ca S. furcifera, bao gm c
 n u trùng, ry cánh dài và ry cánh ngn S. furcifera   m virus
SRBSDV s có kh n virus cho cây lúa trong sui còn li. Tuy
nhiên, virus SRBSDV không truyn trng. Mi cá th ry S. furcifera
mang virus SRBSDV trung bình có th lây nhim cho 48-50 cây lúa, t-90
cây lúa. Thi gian ti thiu và t rng truyn virus cho cây lúa non
Rầy cánh dài
Rầy cánh ngắn
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

10

ng là 5-7 phút và 10-12 phút, tùy theo tn phát trin ca ry. Kt
qu nghiên c  ng t       n d b nhim virus





 Fijivirus 



  n gm 10 phân t RNA si
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

11

kép, mch thng. Các phân t 



1,4 4,5 










 1  10 


icosahedra T=13 cu to t 60 mt tam giác, mi mt tam giác là 13 phân t protein,
to thành 12 pentamevi 120 capsomer lc giác (Hình 5) [15].

Hình 5:Cấu trúc hình đa diện kiểu icosahedral T=13 [41]
1.2.3.3. Đặc điểm di truyền của virus SRBSDV
Theo mt nghiên cu v SRBSDV gây bnh  tnh Quc, virus
SRBSDV là mt thành viên mi ca phân nhóm Fijivirus-2, thu

 Reoviridae. H
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

13

gen có chiu dài 29124 bp, gn RNA sc t n
t tên theo th t t n S10 dn RNA
sHình 6n S1 có chiu dài 4500 bp, mã hóa mt polypeptide (cha
các vùng cha enzym RNA polymerase) có trng phân t 169 kDa.
Phân don S2 có chiu dài 3815 bp, cha mt ORF mã hóa mt protein v virus có
trng phân t nh rõ chn S3 có chiu dài
3618 bp, cha mt ORF mã hóa mt protein có trng phân t 
nh rõ chn S4 có chiu dài 3618
bp, cha mt ORF mã hóa mt protein có vùng trình t t acid amin 608  
ng 22  25% vi các thành viên khác cn S5 có chiu dài 3167
bp, cha mt ORF chính và mt ORF mã hóa mt p   nh rõ chc
ng phân t 24 kDa chn S6 có chiu dài
2651 bp, mã hóa mt protein có tr ng phân t    n
n có s khác bit ln nht v trình t nucleotide so vi các thành
viên trong phân nhóm Fijivirus-ng so v
ng so vn S7 có chiu dài 2176 bp, cha hai ORF có chiu dài
1073 và 930 nucleotide mã hóa hai protein có trng phân t ng là 40,5

t tên theo th t t n S10 dn
RNA s [17n S7 có chiu dài 2176 bp, cha hai ORF không chng gi
lên nhau: ORF 7-1 có chiu dài 1073 và ORF 7-2 có chiu dài 930 nucleotide lt
mã hóa hai protein có trng phân t ng là 40,5 kDa và 36,4 kDa [33].
n S7 có phn không dch mã  n không dch mã 
   81bp và vùng intron dài 51bp, trình t bo th      -
AAGTTTTT và CAGCTGATGTC-, SRBSDV tn t

Trích đoạn Tổng hợp cDNA sợi đôi bằng kĩ thuật PCR Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep Giải trình tự nucleotide đoạn gen đã nhân dòng Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7

---