1
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN THỊ QUỲNH HOA NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT PHENOLIC
TỪ MỘT SỐ THỰC VẬT VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
1 MỤC LỤC
Trang

1.2.2 Ni sng v thu
hỏi 19
1.2.3 Cụng dng ca cõy Cho lỏ
phong 19
1.1.4 Mt s nghiờn cu v thnh phn húa hc v hot tớnh sinh hc ca
chi Engelhardtia
(Juglandaceae).21
Ch-ơng 2 : NHIM V V PHNG PHP NGHIấN
CU23
2.1 Nhiệm vụ của Luận
văn 23
2.2 Ph-ơng pháp nghiên
cứu.24
2.2.1 Các ph-ơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các
hợp
chất
24
2.2.2 Các ph-ơng pháp xác định cấu
trúc 24
Chng 3 : KT QU V THO
LUN 26
3.1 i tng nghiờn
cu 26
3.2 Quy trỡnh chit cỏc phn chit t lỏ cõy Cho lỏ
phong 26
3.3 Phõn tỏch phn chit etyl axetat
(EG3).29
3.4 Phõn tỏch phn chit nc
(EG4) 31
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học

TÀI LIỆU THAM
KHẢO………………………………………………………….47

Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
4 CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

CC (Column Chromatography): Sắc ký cột thường dưới trọng lực dung môi
13
C-NMR (Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
cacbon 13
DEPT (Distortionless Enhancement by Polarition Tranfer): Phổ DEPT
ESI-MS (Electrospray Ionization-Mass Spectrometry): Phổ khối lượng phun bụi
điện tử
FC (Flash Chromatography): Sắc kí cột nhanh
1
H-NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
proton
LC (Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng
Mini-C (Mini-column Chromatography): Sắc kí cột tinh chế
TLC (Thin-Layer Chromatography): Sắc kí lớp mỏng


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
6
MỞ ĐẦU

Các hợp chất phenolic thực vật như các axit phenolic, các flavonoid và các
flavonoid polyme đang ngày càng thu hút được nhiều sự quan tâm do tính chất
chống oxi hóa, tác dụng phòng ngừa ung thư và các bệnh liên quan đến tim mạch
của các hợp chất phenolic. Các nghiên cứu (hóa học, dược lý học, lâm sàng) đã
phần nào lý giải được mối liên quan giữa sức khỏe con người và việc tiêu thụ các
sản phẩm thực phẩm giàu các hoạt chất phenolic thiên nhiên.
Các nghiên cứu theo hướng phát hiện các hợp chất có tác dụng dự phòng ung
thư (cancer chemoprevention) đã thiết lập được một hướng ứng dụng mới của các
hợp chất phenolic. Các hợp chất phân tử nhỏ này thường là các chất chống oxi hóa
và có thể làm giảm sự phát triển của bệnh ung thư bằng cách ngăn chặn sự phát
triển của các tế bào ung thư qua các cơ chế ngăn chặn sự hư hại ADN hoặc ức chế
hoặc đảo ngược quá trình phát triển của các tế bào tiền ác tính đã có sự hư hại
ADN. Một chương trình nghiên cứu các tác nhân dự phòng và chống ung thư từ
nguồn thực vật Việt Nam của chúng tôi đã được xây dựng trên cơ sở lựa chọn các


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
8
Chương 1
TỔNG QUAN

1.1 Các hợp chất phenolic thực vật
1.1.1 Giới thiệu về các hợp chất phenolic thực vật [6]
Các hợp chất phenolic là các hợp chất có một hoặc nhiều vòng thơm với một hoặc
nhiều nhóm hydroxy. Chúng được phân bố rộng rãi trong giới thực vật và là các sản
phẩm trao đổi chất phong phú của thực vật. Hơn 8.000 cấu trúc phenolic đã được
tìm thấy, từ các phân tử đơn giản như các axit phenolic đến các chất polyme như
tannin.
Các hợp chất phenolic thực vật có tác dụng chống lại bức xạ tia cực
tím hoặc ngăn chặn các tác nhân gây bệnh, ký sinh trùng và động vật ăn thịt, cũng

thực vật
C
6
Phenol đơn giản

Benzoquinon

OH

O OC
6
-C
1
Axit benzoic
COOH

Cranberry,
ngũ cốc

C
6
-C
2

Acetophenon

Axit phenylaxetic

O O

Cà rốt, cam,
quýt,cà
chua, rau
bina, đào,
ngũ cốc,
lê, cà tím
Cà rốt, cần
tây, cam
chanh, rau
mùi tây
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
10
Số nguyên
tử Cacbon
Nhóm
Cấu trúc cơ bản
Nguồn gốc
thực vật
C

1
-C
6
Xanthon
O
OXoài, măng
cụt
C
6
-C
2
-C
6
Stilben

Anthraquinon

O
ONho
C
6
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
11

Số nguyên
tử CacbonNhóm

Cấu trúc cơ bản

Nguồn gốc
thực vật
(C
6
-C
1
)
n

Tannin thủy phân
Polyme không đồng nhất được
tạo thành từ các axit phenolic
và đường đơn
Lựu, quả


35
Các flavonoid là các polyphenol có nhiều nhất trong thức ăn của chúng ta. Một
cấu trúc flavonoid cơ bản là nhân flavan, chứa 15 nguyên tử cacbon được sắp xếp
theo ba vòng (C6-C3-C6), được kí hiệu là A, B và C. Các flavonoid được chia thành
sáu phân nhóm: flavon, flavonol, flavanol, falavanon, isoflavon và anthocyanin theo
trạng thái oxy hóa của vòng C trung tâm.
Sự thay đổi cấu trúc của chúng trong mỗi nhóm một phần là do mức độ và mô
hình hydroxyl hóa, methoxyl hóa, prenyl hóa, hoặc glycosyl hóa.
Một số chất flavonoid phổ biến nhất bao gồm quercetin, một flavonol có rất nhiều
trong hành tây, bông cải xanh, táo; catechin, một flavonol được tìm thấy trong trà và
một số loại trái cây; naringenin, một flavonol có trong quả bưởi; các cyaniding
glycoside, anthocyanin có nhiều trong các loại trái cây mọng (nho đen, mâm xôi,
blackberry, …) và daidzein, genistein và glycitein, các isoflavon trong đậu tương.
Các axit phenolic có thể được chia thành hai nhóm: nhóm các dẫn xuất của axit
benzoic chẳng hạn như axit gallic và nhóm các dẫn xuất của axit cinnamic như
axit coumaric, axit caffeic và axit ferulic. Axit caffeic là một axit phenolic phổ biến
nhất, chứa trong nhiều loại trái cây và rau quả, thường được este hóa với axit quinic
trong axit chlorogenic, là một hợp chất phenolic chủ yếu trong cà phê. Một axit
phenolic phổ biến khác là axit ferulic, đó là chất có trong ngũ cốc và được este hóa tạo
thành các hemicelluose có trong thành tế bào.
Các tannin là một nhóm lớn các polyphenol trong khẩu phần ăn của chúng ta
và thường được chia thành hai nhóm: nhóm các tannin thủy phân và nhóm các
tannin ngưng tụ. Các tannin thủy phân là các hợp chất có chứa nhân của glucose
hoặc polyol khác, được este hóa với axit galic tạo thành các gallotannin, hoặc với axit
hexahydroxydiphenic tạo thành các gellagitannin. Sự đa dạng trong cấu trúc của các
hợp chất này là do khả năng hình thành các liên kết oxy. Phản ứng oxy hóa giữa các
phân tử tạo thành nhiều hợp chất oligomeric có khối lượng phân tử khoảng 2.000 đến
5.000 dalton. Các tannin ngưng tụ là các oligome hoặc polymer của flavan-3-ol liên kết
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học


35
Một stilben, resveratrol là một polyphenol đặc biệt, có tiềm năng chống ung thư
và chống lão hóa [30].
Các quercetin (đại diện chính của lớp flavonol, chứa nhiều trong hành tây, táo,
rượu vang đỏ, bông cải xanh, trà) ức chế chất sinh ung thư và có tác dụng chống oxy
hóa của huyết tương trong cơ thể [30].
1.1.4 Phƣơng pháp chiết và phân lập các hợp chất phenolic
1.1.4.1 Phƣơng pháp chiết
Chiết là một trong những bước quan trọng nhất trong tiền xử lý mẫu nghiên cứu,
là các quy trình được sử dụng nhiều nhất do sự dễ sử dụng, hiệu quả và khả năng áp
dụng rộng [8]. Nói chung, hiệu suất chiết phụ thuộc vào dạng dung môi với các độ
phân cực khác nhau, thời gian chiết và nhiệt độ, tỷ lệ mẫu và dung môi cũng như thành
phần hóa học và các đặc tính vật lý của các mẫu. Độ tan của các phenolic được quyết
định bởi bản chất hóa học của mẫu thực vật, cũng như độ phân cực của các dung môi
được sử dụng. Các nguyên liệu thực vật có thể chứa các hợp chất phenolic từ các hợp
chất đơn giản (ví dụ: các axit phenolic, các anthocyanin) đến các chất được polymer
hóa cao (ví dụ: các tannin ở các lượng khác nhau). Hơn thế nữa các hợp chất phenolic
cũng có thể liên kết với các thành phần thực vật khác như cacbohydrat và các protein.
Do đó phụ thuộc vào hệ dung môi được sử dụng trong khi chiết, một hỗn hợp các hợp
chất phenolic tan trong dung môi sẽ được chiết khỏi nguyên liệu thực vật. Hỗn hợp này
có thể chứa các chất phi phenolic như: đường, các tecpen, các chlorophyll, các axit hữu
cơ và các chất béo [11, 25].
1.1.4.1.1 Chiết bằng dung môi
Các phương pháp chiết các hợp chất phenolic đơn giản (axit benzoic, andehit
bezoic, axit cinnamic và catechin) từ các nguyên liệu rắn chủ yếu được ngâm chiết với
các dung môi hữu cơ. Hiệu suất chiết phụ thuộc vào dạng dung môi với các độ phân
cực khác nhau, thời gian chiết và các đặc trưng vật lý của mẫu chiết. Ánh sáng, không
khí và nhiệt độ là các yếu tố thúc đẩy các phản ứng thoái biến.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học

1.1.4.1.2 Chiết pha rắn (SPE) [11, 26]
Chiết pha rắn (SPE) là một kỹ thuật chuẩn bị mẫu trong phân tích ngày càng hữu
ích. Với SPE, những vấn đề liên quan đến chiết hai pha lỏng (LLE), chẳng hạn như sự
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học

35
phân tách không hoàn toàn, độ thu hồi thấp, sử dụng và loại bỏ lượng lớn, dung môi
hữu cơ đắt tiền có thể tránh được, mặc dù chi phí của các thiết bị cần thiết cho SPE cao
hơn so với LLE. Kỹ thuật này thường được sử dụng nhất để chuẩn bị các mẫu lỏng và
các chất phân tích bay hơi hoặc không bay hơi, nhưng cũng có thể được sử dụng
với chất rắn được chiết trước vào các dung môi. Các kỹ thuật SPE đa dạng với nhiều
loại chất hóa học, các chất hấp phụ, và kích thước, do đó cần thiết để lựa chọn sản
phẩm SPE phù hợp cho mỗi ứng dụng và mẫu chiết. Phân tích SPE đã được thử
nghiệm để xác định các hợp chất phenolic trong nho, rượu vang và các đồ uống.
Trường hợp chiết các hợp chất phenolic từ các mẫu dầu ô-liu cũng đã được nghiên cứu
rộng rãi.
1.1.4.1.3 Chiết chất lỏng siêu tới hạn (SFE) [4, 19, 24]
Thông thường, các hợp chất phenolic được chiết từ các mẫu thực vật bằng
phương pháp SPE kết hợp các kỹ thuật khác, chẳng hạn chiết chất lỏng siêu tới hạn
(SFE). SFE là một kỹ thuật mới cho ưu điểm hơn so với phương pháp truyền thống,
như sử dụng nhiệt độ thấp, giảm tiêu thụ năng lượng và cho chất lượng sản phẩm cao
do không dùng dung môi trong pha hòa tan.Tuy nhiên, kỹ thuật này được áp dụng cho
các hợp chất phân cực thấp hoặc trung bình. SFE thường được mô tả để chiết các
polyphenol, các đặc điểm chính của phương pháp này là cần các tỷ lệ phần trăm
cao của các chất biến cải hữu cơ, điều này có nghĩa rằng quá trình này xảy ra trong các
điều kiện dưới tới hạn.
Cacbon đioxit siêu tới hạn (SC-CO
2
) là dung môi được sử dụng rộng rãi nhất cho
SFE do đặc điểm đặc biệt của nó, như điều kiện tới hạn (31,1ºC và 73,8 MPa) và sẵn

quả để phân lập các polyphenol và nhiệt độ cao đã được sử dụng để đẩy nhanh quá
trình chiết.
1.1.4.1.5 Chiết bằng vi sóng (MAE) [5, 27]
Công nghệ vi sóng thường được biết đến với việc sử dụng để xử lý nhiệt. Ví dụ,
nó được sử dụng như một quá trình nhiệt cho các sản phẩm trái cây thương phẩm để
đạt được sự khử trùng nhanh và êm dịu của các sản phẩm này. Đồng thời, vi sóng được
sử dụng để xác định độ ổn định của hàm lượng polyphenol sau xử lý. Công nghệ này
cũng được sử dụng để tăng quá trình làm khô trong rượu vang và các mẫu nho tươi, cải
thiện sự tiền xử lý và là qui trình hữu ích để kiểm tra các hợp chất phenolic.
Gần đây, phương pháp chiết bằng vi sóng (MAE), còn được gọi là quá trình vi
sóng hỗ trợ (MAP), đã được áp dụng trong việc phát triển các phương pháp chiết các
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học

35
hợp chất hữu cơ từ đất, trầm tích, hạt giống, và các mẫu thực phẩm. Các nghiên cứu
này cho thấy chiết hiệu quả hơn khi năng lượng lò vi sóng được sử dụng. Nghiên cứu
của Sutivisedsak và cộng sự, đã chứng minh tiện ích của vi sóng trong xác định hàm
lượng phenolic trong tám loại đậu thông thường, sử dụng phương pháp đo màu Folin-
Ciocalteau.
1.1.4.1.6 Chiết siêu âm (UAE) [8, 18, 32]
Bức xạ siêu âm là một trợ giúp mạnh mẽ các bước khác nhau của quá
trình phân tích. Năng lượng này giúp nhiều trong việc xử lí các mẫu rắn vì nó làm dễ
dàng và tăng tốc độ các quá trình chiết các hợp chất hữu cơ và vô cơ, đồng nhất và
nhiều ứng dụng khác. Ví dụ, các hệ thống chiết siêu âm đã được sử dụng rộng rãi để
chiết xuất capsaicinoid trong ớt nóng.
Chiết bằng siêu âm (UAE) được cho là một trong các kỹ thuật chiết đơn giản bởi
vì nó dễ thực hiện bằng các thiết bị thông thường trong phòng thí nghiệm. Trong
phương pháp này, mẫu được nghiền nát trộn với dung môi thích
hợp và được đặt vào bể siêu âm, nơi mà nhiệt độ và thời gian chiết định.
Các ứng dụng của chiết siêu âm (UAE) trong công nghệ chế biến thực phẩm dễ

điều chỉnh độ pH của mẫu rượu vang loại ancol đến pH 7.0 và rửa giải hỗn hợp các axit
phenolic với nước trong phân đoạn đầu [28]. Theo bước này, cột C18 được rửa axit với
dung dịch HCl 0,01M và các phenol không polyme như các catechin, anthocyanin, và
flavonol được rửa giải với etyl acetat. Cuối cùng, một hỗn hợp aceton, nước và metanol
được sử dụng để rửa giải các phenol dạng polyme.
Các chất hấp phụ khác như Amberlite XAD-2, XAD-7, XAD-16, Oasis HLB [16,
20, 34] cũng đã được sử dụng để tinh chế các hợp chất phenolic trong các phần chiết
thô hay của các mẫu rượu vang. Sự so sánh một vài cột SPE bao gồm Amberlite, C8
silica gel, copolyme HLB, PH, ENV và MCX C18 silica gel để phân lập các hợp chất
phenolic trong rượu vang ở nồng độ thấp cho thấy rằng phương pháp SPE với cột HLB
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học

35
có độ nhạy cao hơn, độ thu hồi và khả năng nạp mẫu cao hơn cột C18 và cột HLB có
thể là một sự thay thế tốt cho cột C18 để phân lập các hợp chất phenolic của rượu vang.
Sắc ký cột cũng đã được sử dụng để phân tách các phần chiết phenolic. Mặc
dù phương pháp này thường tốn nhiều công sức và tiêu thụ dung môi nhưng nó tạo
lượng lớn các phân đoạn tiếp theo cho sự phân lập và xác định các chất tinh khiết. Các
chất hấp phụ cột thường sử dụng là RP-C18, Toyopearl, LH-20 và với mức độ ít hơn
nhựa polyamit [29]. Etanol, metanol, aceton và nước là các dung môi rửa giải thường
được sử dụng. Đặc biệt, sự phân lập các proanthocyanidin (tannin ngưng tụ) thường
xuyên được thực hiện bằng cột sắc ký Sephadex LH-20 [3, 12]. Phần chiết thô được
đưa lên và rửa giải bằng metanol hoặc etanol, chất không tannin sau đó rửa giải với
aceton nước hoặc rượu-nước để nhận được các proanthocyanidin. Sử dụng cột sắc ký
LH-20, methanol thường được dùng hơn etanol để rửa giải các chất không tannin. Hệ
dung môi aceton-nước tốt hơn so với hệ dung môi etanol-nước để rửa giải các
procyanidin từ cột, đặc biệt là các procyanidin dạng polyme. Trong một số trường hợp,
hệ thống HPLC điều chế cũng đã được sử dụng để tinh chế mẫu polyphenol [2, 9].
1.1.4.3 Phân tích và xác định cấu trúc
Các polyphenol cho sự hấp thụ ở vùng UV và UV/VIS. Do đó các phương tiện


Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học

35
GL/LC/điện di với phân tích công cụ
(UV/VIS, FLU, PDA, EAD, điện lượng kế,
ECD, MS, NMR)

Phân tích
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học

35
1.2 Giới thiệu về cây Chẹo lá phong (Engelhardtia spicata Lesh ex. Blume)
1.2.1 Đặc điểm thực vật học [1]
Chẹo lá phong còn có tên là Chẹo bông, tên khoa học là Engelhardtia spicata
Lesch ex. Blume, thuộc họ Hồ đào (Juglandaceae).
Chẹo lá phong là cây gỗ lớn cao 10-20 m; cành non có lông hung. Lá mang 9-17
lá chét dài 11,5-22 cm, rộng 5-6 cm, không cân xứng, mép nguyên, gân phụ 13-15
cặp lồi trên cả hai mặt. Hoa đơn tính cùng gốc; cụm hoa dài 11-15 cm; hoa đực có 6-
13 nhị; hoa cái có 4 lá đài, vòi có 2-4 đầu nhuỵ. Chùm mang quả dài 15-30 cm; quả
bế cao 3mm, dầy lông phún; cánh với 3 thuỳ dài 2,5-4,5 cm.
1.2.2 Nơi sống và thu hái [1]
Chẹo lá phong sống chủ yếu ở phía nam châu Á từ bắc Ấn Độ, đến Inđonexia,
Philipin và Việt Nam. Cây mọc ở rừng thứ sinh và rừng thông ở độ cao 1000-2000 m
khắp nước ta.
1.2.3 Công dụng của cây Chẹo lá phong [1]
Ở nước ta cũng như ở Ấn Độ, người ta dùng vỏ để duốc cá. Ở Ấn Độ, nhựa vỏ
quả cũng được sử dụng trong Y học dân gian.