1
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THỰC VẬT
GV: Ths. PHẠM NGỌC MINH QUỲNH
BÀI GIẢNG
VẤN ĐỀ 1
VAI TRÒ VÀ Ứng DỤNG CỦA CÔNG
NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT
2
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THỰC VẬT
SINH
SINH
LÝ
LÝ
H
H
Ó
Ó
A
A
CÔNG NGHỆ SINH HỌC ?
HS
HS
HL
HL
LS
LS
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Định nghĩa
Công nghệ sinh học là các quá
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THỰC VẬT
1. CNSH thực vật và việc tạo giống cây
trồng
- Tạo giống và nhân giống cây trồng theo
phương pháp cổ truyền: tạo giống
ngẫu nhiên, nhân giống chậm, tự cung
cấp giống, giống địa phương, chất
lượng cao.
- Cuộc cách mạng xanh – Giống do các
đơn vị chuyên môn cung cấp – Giống
lai – Ưu thế lai – Sự phụ thuộc vào
công ty giống.
CÔNG NGH
Ệ
SINH H
Ọ
C
THỰC VẬT
2. Công nghệ gen
Công nghệ gen là lĩnh vực nghiên cứu nhằm
tạo ra các cấu trúc DNA thích hợp chứa gen
tương ứng với một hoặc nhiều tính trạng
mong muốn và hệ thống để chuyển nạp gen
đó vào cây trồng, vật nuôi hay vi sinh vật với
mục đích làm chúng kết hợp và thể hiện bền
vững trong bộ máy di truyền cây chủ.
5
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT Ở
ViỆT NAM
• CNSH nhân nhanh giống cây rừng có
giá trị cao
• CN gen tạo các giống kháng sâu bệnh.
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC
VẬT Ở ViỆT NAM
7
VẤN ĐỀ 2
KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ,
TẾ BÀO THỰC VẬT
SƠ LƯỢC LỊCH SỬ NUÔI CẤY
MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT.
1. Thời kì 1838 đến cuối thế kỉ 19:
Schwanm và Schleiden đưa ra thuyết gọi là “tính
toàn thế” của tế bào thực vật.
2. Thời kì 1902 đến 1939:
Haberlandt (1902): người đầu tiên nuôi cấy tế bào
đơn trên môi trường nhân tạo. Ông sử dụng
môi trường Knop có bổ sung asparagin,
peptone và đường. Các tế bào này sống vài
tháng nhưng không có khả năng phân chia.
White (1934); Gautheret (1939); Nobecourt (1939):
thành công với thí nghiệm tạo sự phân chia tế
bào thực vật khi nuôi cấy liên tục trên môi
trường có bổ sung auxin.
8
SƠ LƯỢC LỊCH SỬ NUÔI CẤY MÔ, TẾ BÀO
THỰC VẬT.
(tt)
3. Thời kì 1940 – 1978: thời kì nghiên cứu về
môi trường nuôi cấy và sự phát sinh hình
Chồi nách trên
trục của lá
Thân Lá
10
Môi trường
• Khi cắt mẫu nuôi cấy
ra khỏi cây mẹ, lấy đi
nguồn dinh dưỡng
cần phải cung cấp
các chất này cho mẫu
nuôi cấy.
Ngọn - Auxin
và Gibberellin
Rễ - Nước, vitamins
Chất khoáng và cytokinin
Lá -
Đường, GA
II. CÁC ĐiỀU KiỆN NUÔI CẤY
2.1. Điều kiện vô trùng
2.1.1. Vô trùng khu vực thao tác cấy:
• Phòng cấy phải được quét dọn sạch sẽ.
• Khử trùng bằng foocmon trong 24 h, sau đó
trung hòa lại bằng dung dịch amoniac.
• Tiệt trùng bằng đèn UV
• Tủ cấy phải được lau bằng cồn và bật đèn UV
trước khi thao tác.
11
Phòng nuôi cấy mô, tế bào thực
vật
2.1. Điều kiện vô trùng (tt)
Khử trùng ướt cần lưu ý:
• Không khử trùng môi trường nuôi cấy với thời gian quá
dài, một số thành phần của môi trường sẽ bị phân huỷ.
• Sau khi khử trùng phải giảm áp suất từ từ, giảm nhanh
sẽ làm cho chất lỏng trong bình trào lên miệng bình.
Nồi hấp khử trùng
13
2.1. Điều kiện vô trùng (tt)
2.1.1.3. Màng lọc
• Dùng để loại bỏ tác nhân gây nhiễm có kích thước
0,025-10 μm khỏi môi trường nuôi cấy (môi trường
lỏng), nước cất… Có hai loại màng phổ biến:
• Màng lọc bằng thép không gỉ: Màng Swinney.
• Màng lọc bằng polypropylen: Màng Swinnex, đây là
loại màng chỉ dùng một lần rồi bỏ.
• Với các dung môi kỵ nước như dung dịch có chứa
dimetyl sulfoxit, thì phải dùng màng lọc bằng
xellulozơ axetat (có kích thước 0,1-0,2μm). Kích
thước lỗ của màng lọc ≤0,22μm, có thể loại bỏ hoàn
toàn các sinh vật gây nhiễm: vi khuẩn, nấm men,
nấm mốc…(Torres, 1989).
2.1. Điều kiện vô trùng (tt)
2.1.3. VÔ TRÙNG MẪU CẤY
• Lựa chọn mẫu cấy:
Loại mẫu cấy: chồi ngọn, chồi bên, phiến lá, cuống lá,
lá mầm, trụ lá mầm, củ, căn hành…
Vị trí lấy mẫu: mẫu ở trên cao ít bị nhiễm vi sinh vật
hơn mẫu ở gần mặt đất, các cấu trúc được bao kín
thường không có hoặc có rất ít vi sinh vật.
Thời điểm lấy mẫu: mùa xuân hay đầu mùa hè là thời
với mẫu cấy.
15
2.1.3. VÔ TRÙNG MẪU CẤY
(tt)
Khá tốt30 - 6050 – 100mg/lChất kháng sinh
Trung bình5 - 101% (W/w)Nitrat bạc
Trung bình2 -100,1 – 1% (W/w)Clorua thủy ngân
Tốt5 – 1510 – 12%(V/v)Oxy già
Rất tốt5 – 3010 – 20%(V/v)Hypoclorit natri
Rất tốt5 - 305 – 15% (W/w)Hypoclorit canxi
Hiệu quảThời gian xử lý (phút)Nồng độ sử dụngHoá chất
Bảng 2.1. Bảng tổng hợp sử dụng một số lọai
hoá chất vô trùng
(Theo street, 1974; Narayanaswamy, 1994; Dodds J.H and Robert L.W, 1999;
Smilt R.H, 2000)
2.1.3. VÔ TRÙNG MẪU CẤY
(tt)
• Những vấn đề cần lưu ý khi vô trùng mẫu cấy:
+ Có thể sử dụng kháng sinh phối hợp với hóa chất
diệt khuẩn ( gentamixin, ampixilin).
+ Một số trường hợp khó vô trùng mẫu (vi sinh vật
ngay trong mô hoặc vi sinh vật trên bề mặt mẫu có
mức độ mẫn cản với các hoá chất vô trùng gần như
mẫu thực vật. Trong trường hợp này, nhiều nhà
nghiên cứu đã thêm các chất diệt vi khuẩn và nấm
vào trong môi trường nuôi cấy (Thursten và cộng
sự, 1979).
+ Trong thời gian xử lí, mẫu phải ngập hoàn toàn
trong hóa chất diệt khuẩn.
16
• Thành phần vô cơ bao gồm các muối khoáng
(cả đa lượng và vi lượng) được đưa vào môi
trường nuôi cấy.
• Nhu cầu về muối khoáng của tế bào và mô thực
vật tách rời là không khác nhiều so với yêu cầu
của cây trong điều kiện tự nhiên.
• Trong thành phần muối khoáng đa lượng , các
nguyên tố cần phải cung cấp là nitơ, phospho,
kali và sắt.
3.1.1. Thành phần vô cơ
(tt)
• Nitơ vô cơ được đưa vào môi trường ở hai
dạng: nitrat (NO3‾ ) và amon (NH4+).
• Đa số các môi trường có chứa dạng nitrat nhiều
hơn dạng amon. Các gốc nitrat được đưa vào
môi trường dưới dạng muối nitrat canxi, nitrat
kali, nitrat natri hoặc nitrat amon.
• Khi môi trường chỉ chứa nitơ ở dạng nitrat dễ
gây ra kiềm hoá môi trường, vì thế cần phải đưa
vào môi trường một lượng nhỏ amon. Ngược
lại, trong môi trường có thể chỉ dùng nitơ dạng
amon.
18
3.1.1. Thành phần vô cơ
(tt)
• Phospho thường được đưa vào môi trường ở dạng muối
phosphat và hai loại hợp chất hay được dùng nhất là
NaH2PO4 và KH2PO4. Hàm lượng phospho trong môi
trường nuôi cấy dao động từ 0,15 đến 0,40mM.
• Kali được cung cấp cho môi trường nuôi cấy dưới dạng
• * Axit ascobic (vitamin C): 1,0 – 100 mg/l
• * Axit Pantothenic (vitamin B5):0,5 – 2,5 mg/l
• * Tocopherol (vitamin E): 1,0 – 50,0 mg/l
• Myo-inositol: là một loại đường-rượu liên quan đến quá trình tổng
hợp phospholipit, pectin của thành tế bào và các hệ thống màng
trong tế bào, tham gia vào dinh dưỡng khoáng, vận chuyển đường
và trao đổi hydratcacbon. Ngoài ra, myo-inositol còn tham gia vào
tích trữ, vận chuyển và giải phóng auxin (Bonduski, 1984).
• Hàm lượng sử dụng của myo-inositol là ≈100mg/l môi trường. Myo-
inositol có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng và phát triển giống như
các vitamin và trong nhiều trường hợp có vai trò như nguồn cacbon
của môi trường nuôi cấy.
3.1.2.1. Vitamin, aminoaxit,
amit, myo-inositol.
• - Các aminoaxit và amit:
• + Đối với nhiều loại mẫu nuôi cấy, môi trường phải được
bổ sung các aminoaxit, amit…vì chúng có thể giữ vai trò
quan trọng trong phát sinh hình thái.
• + Tất cả các dạng tự nhiên của aminoaxit (dạng L) dễ
dàng được mô nuôi cấy hấp thụ (Skoog and Milles,
1957).
• * L-arginin dùng cho nuôi cấy rễ.
• * L-tyrolin dùng cho nuôi cấy chồi.
• * L-serin dùng cho nuôi cấy hạt phấn.
• Nồng độ sử dụng của mỗi loại: 10 – 100mg/l
(Narayanaswamy, 1994).
20
3.1.2.2. Các thành phần hữu cơ
phức hợp
Mục đích: cung cấp thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin
trưởng, mẫu nuôi cấy.
Kiểm soát quá trình phân hóa
Cytokinin
Auxin
Đĩa lá
Chồi bất định
Rễ
Mô sẹo
22
3.1.3. Các chất điều hòa sinh
trưởng
3.1.3.1. Nhóm auxin: được đưa vào môi trường nuôi cấy
nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào,
tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất,
kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát
sinh phôi vô tính…(Epstein và cộng sự, 1989). Các loại
auxin thường sử dụng cho nuôi cấy:
• - IAA (Indole acetic acid).
• - IBA (Indole butyric acid).
• - NOA (Naphthoxy acetic acid).
• - α-NAA (α- Naphthalên acetic acid).
• - Picloram (4-amino-3,5,6 trichloropicolinic acid).
• - 2,4-D (2,4-dichorophenoxy acetic acid).
• - PCPA (P-chlorophenoxy acetic acid).
• - Dicamba (3,6-Dichloro acetic acid).
3.1.3. Các chất điều hòa sinh
trưởng
3.1.3.2. Nhóm cytokinin:
• Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh
trưởng của chồi in vitro (Miller, 1961). Các cytokinin có
đường saccarozơ với hàm lượng từ 2-6%
(W/w). Những loại đường khác như: fructozơ,
glucozơ, maltozơ, lactozơ, rafinozơ, sorbitol…
chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt.
24
3.1.5. Các thành phần khác
Tác nhân tạo gel (Gelling agent):
Quyết định trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy. Các
môi trường đặc có chứa đủ hàm lượng chất tạo gel làm
cho chúng đông lại ở nhiệt độ bình thường (25-30
0
C).
Chất tạo gel được sử dụng phổ biến là agar (thạch) gồm
một số polisaccarit có khối lượng phân tử cao, được lấy
từ rong biển. Các polisaccarit kết hợp với các phân tử
H
2
O tạo thành polime và đông lại thành gel ở nhiệt độ ≈
45
0
C.
Ngoài ra có thể sử dụng gelrite hoặc phytagel làm giá thể.
+ Trong thành phần của agar có chứa một số thành phần
vô cơ: Cu, Fe, Mg, Mn, Cl, Zn… và một số thành phần
hữu cơ: axit hữu cơ, axit béo chuỗi dài…
+ Hàm lượng sử dụng của agar 0,5-10 % (W/w) tuỳ theo
chất lượng của chúng và loại môi trường được sử dụng.
3.1.5. Các thành phần khác
Than hoạt tính (Activated charcoal, AC)
- Được dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp
3
sẽ mất hoạt
tính (Van Braft and Pierk, 1971).
Copyright: Tài liệu đại học ©