iBỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN
BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU SỰ KHÁC BIỆT DI TRUYỀN CỦA CÁC NHÓM
BÒ VÀNG ĐỊA PHƯƠNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Chăn Nuôi
Chủ nhiệm đề tài : TS. Phạm Doãn Lân
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 27
2.2.2. Thời gian nghiên cứu 27
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu 27
2.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
2.3.1. Đặc điểm chung của bò Vàng Việt Nam 28
2.3.2 Khối lượng và kích thước của bò Vàng Việt Nam 29
2.3.3. Một số nhóm bò vàng Việt Nam khác 37
2.3.3. Giống bò Brahman đỏ 48
CHƯƠNG 3: NGHIÊN CỨU SAI KHÁC DI TRUYỀN VÀ MỐI QUAN HỆ DI
TRUYỀN GIỮA CÁC NHÓM BÒ BẰNG CHỈ THỊ MICROSATELLITE 52
3.1. GIỚI THIỆU CHUNG 52
3.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 53
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu: 53
3.2.2. Phương pháp nghiên cứu 54
3.2.3 Phân tích thống kê 57
3.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60
3.3.1. Kết quả phân tích kích thước alen của các locút microsatellites 60
3.3.2. Số lượng và tần số alen của các locút microsatellite 64
3.3.3. Đa dạng di truyền và cân bằng Hardy-Weinberg 71
3.3.4. Khoảng cách di truyền giữa các nhóm bò 75
iii
3.3.5. Kết quả xác định khả năng phân thành các nhóm di truyền (giống) khác biệt 79
3.4. KẾT LUẬN 82
CHƯƠNG 4: NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG ADN TY THỂ VÀ MỐI QUAN HỆ
NGUỒN GỐC Ở CÁC NHÓM BÒ VÀNG 83
4.1. GIỚI THIỆU CHUNG 83
4.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 84
4.2.1. Đối tượng nghiên cứu 84
4.2.2. Nhân ADN đặc hiệu (PCR) 84
CHƯƠNG 6: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 140
6.2. KẾT QUẢ DẠNG II, III 141
6.3. KẾT QUẢ DẠNG 4 142
CHƯƠNG 7: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 144
7.1. KẾT LUẬN 144
7.2. ĐỀ XUẤT 145
TÀI LIỆU THAM KHẢO 147
iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ADN: Deoxyribonucleic acid (một dạng vật chất di truyền)
AFLPs: Amplified Fragment Length Polymorphisms (đa hình độ dài các đoạn
nhân chọn lọc)
BN: Bò ngoại (Brahman)
Bp: Base pair (cặp bazơ)
BR: Bà rịa Vũng Tàu
D-loop: Displacement loop (vùng điều khiển trên phân tử ADN ty thể)
EDTA: Ethylen-Diamin-Tetra-Acetic acid
FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức nông lương thế giới)
HG: Hà Giang
ISAG: International Society of Animal Genetis (Hội di truyền động vật quốc tế)
KL: Khối lượng
KT: Kích thước
LS: Lạng Sơn
LSM: Trung bình bình phương nhỏ nhất
MPX: Multiplex PCR (phản ứng PCR đa mồi)
NA: Nghệ An
NJ: Neighbor – Joining Method (phương pháp liên kết nhóm liền kề)
PCR: Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)
PY: Phú Yên
loài bò rừng cổ (Bos primigenius primigenius) tuy nhiên chúng được thuần hóa từ
những địa điểm khác nhau sau đó di cư cùng con người và được chọn lọc theo
nhiều hướng, cho đến nay tạo ra nhiều giống khác nhau phân bố ở khắp thế giới
(Lotus và cộng sự, 1994, MacHugh và cộng sự, 1997 ). Mối quan hệ di truyền
của 10 nhóm giống bò chính của Châu âu, Tây á và Bắc phi dựa trên sự đa hình
protein được Manwell và các cộng sự công bố đầu tiên năm 1980, các tác giả đã chỉ
ra rằng kết quả hoàn toàn phù hợp giữa đặc điểm kiểu hình với sự phân bố địa lý
của từng nhóm giống.
Trong những năm gần đây, Công nghệ gen phát triển mạnh đã cung cấp nhiều
chỉ thị (marker) và kỹ thuật di truyền phân tử như: microsatellile, PCR-RFLP, phân
tích trình tự ADN ty thể (mtADN). Các chỉ thị và kỹ thuật này đã và đang được sử
dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu nhằm hỗ trợ chọn tạo giống vật nuôi có năng
suất cao (marker assisted seletion), các nghiên cứu về đa dạng di truyền, các dự án
bảo tồn và sử dụng nguồn gen ở nhiều các đối tượng khác nhau.
3
Ở Việt Nam hiện có khoảng 7 nhóm bò vàng địa phương, mỗi nhóm chúng
mang những nét đặc trưng được chọn lọc theo sở thích của người dân và đáp ứng
với điều kiện khí hậu ở từng vùng. Các nhóm bò này thường có kích thước nhỏ
năng suất thịt, sữa thấp nhưng chúng lại có khả năng chịu được điều kiện khó khăn,
khả năng kháng bệnh và sinh sản tốt. Mặc dù đã có nhiều chương trình nhằm cải
tạo giống bò thịt được thực hiện ở nước ta trong nhiều năm qua như nhập các giống
bò thịt ngoại nhưng những nhóm bò địa phương vẫn chiếm đến 74% trong tổng số
đàn bò thịt của nước ta hiện nay do chúng đáp ứng tốt hơn với điều kiện khí hậu,
dinh dưỡng và phương thức chăn nuôi nông hộ nhỏ lẻ so với các giống bò nhập
ngoại. Đã có những quan điểm khác nhau về nguồn gốc và phân loại của những
nhóm bò này, một số cho rằng những nhóm bò này đều thuộc một giống bò vàng
Việt Nam trong khi đó một số khác lại cho rằng chúng là những giống địa phương
khác nhau và được đặt theo tên giống theo từng địa danh như: giống bò Mèo
(Hmông), Lạng Sơn, Thanh Hóa, Urìu Nghệ An, Phú yên, Bà Rịa. Tuy nhiên chưa
Bò nuôi là thành viên của tông trâu bò hoang (Bovini) thuộc họ trâu bò
(Bovidae). Các thành viên khác của tông Bovini bao gồm bò rừng Bison - Mỹ
(Bison bison), bò rừng Châu Âu, bò rừng Banteng (Bos banteng), bò tót (Bos
gaurus) bò Tây Tạng-Yak (Poephagus mutus) và bò xám (Bos sauveli). Có hai loại
hình thái bò nuôi đã được xác định đó là bò Bos taurus (không có u) của Châu Âu,
Tây Phi, Bắc Á và bò Bos indicus hay còn gọi là bò zebu (bò có u) của Nam Châu
Á, Châu Phi. Hệ thống phân loại của các thành viên khác nhau thuộc tông Bovini
dựa trên cơ sở hình thái học cổ điển và các nghiên cứu phân tử gần đây được trình
bày ở hình 1.1.
Hình 1.1: Hệ thống phân loại của bò nuôi, bò hoang dã và một số loài liên quan
trong tông Bovini (nguồn: MacHugh 1996)
6
Sự khác nhau về hình thái và sinh lý giữa 2 loài phụ bò nuôi Bos indicus và
Bos taurus phản ánh sự đáp ứng rõ rệt với các điều kiện môi trường khác nhau. Bò
Bos indicus chủ yếu sống ở vùng khí hậu khô nóng hoặc bán khô nóng của Châu Á
và Châu Phi. Trong khi đó bò Bos taurus thường sống ở những vùng ôn đới có
lượng mưa cao. Bò Bos indicus có tỷ lệ trao đổi chất cơ bản và nhu cầu về nước
thấp hơn, tuyến mồ hôi to và hoạt động mạnh hơn, chúng có khả năng kháng với
bệnh ve và bệnh ký sinh trùng tốt hơn bò Bos taurus (Payne, 1995). Hơn nữa, Bos
indicus còn thể hiện các tập tính nhạy cảm và bản năng tập trung bầy đàn mạnh hơn
so với bò Bos taurus.
Hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng tổ tiên hoang dã của tất cả bò nuôi hiện
nay là bò rừng cổ đã tuyệt chủng - Bos primigenious (Epstein và Mason, 1984). Bò
rừng cổ được cho rằng đã tiến hoá ở châu Á từ tổ tiên Bos acutfrons thuộc kỷ
Plioxen. Bò rừng cổ có phạm vi phân bố địa lý rất rộng, bằng chứng là những dấu
tích hoá thạch còn lại đã được tìm thấy tại những vị trí rất xa nhau như ở Anh và
Trung Quốc. Do sự phân bố trong phạm vi rộng như vậy nên dẫn đến hình thành
các loài phụ khác biệt về địa lý.
Á (vùng Cận Đông) và có thể ở châu Phi. Nguồn gốc tổ tiên của bò Bos taurus
thuần hoá tại châu Phi và bò Bos indicus vẫn chưa được xác định, trong khi đó
nguồn gốc tổ tiên của bò Bos taurus thuần hoá tại vùng Cận Đông được xác định từ
loại phụ bò rừng cổ Bos primigenius primingenius (Meadow, 1984; 1993; Lotus và
cộng sự, 1994a)
Trong vòng một thiên niên kỷ sau đó, bò thuần hóa được phổ biến rất nhanh
cùng với những người nông dân thời kỳ đồ đá. Sự di cư rộng rãi của con người đã
làm cho phân tán bò khắp nơi trên thế giới, một số nhóm người di cư đến vùng bán
đảo Ả Rập, một số di cư đến phía bắc, tây và đông của Châu Phi, một số nhóm di
cư đến châu Âu và Ấn Độ. Sự mở rộng giao lưu và liên kết thương mại giữa các
nền văn minh mới hình thành sau đó đã làm cho phát tán và pha trộn của nhiều kiểu
bò khác nhau (Hình 1.3)
9Hình 1.3: Sự phổ biến của bò thuần hoá ở khắp nới trên thế giới cổ sinh theo
Epstein và Mason (nguồn MacHugh, 1996).
1.1.3. Sự đa dạng và phân bố của bò nuôi ngày nay
Trải qua một thời gian dài chọn lọc và phát triển, hiện nay trên thế giới có
khoảng hơn 800 giống bò khác nhau. Chúng là các dạng biến thể của hai loài phụ
Bos taurus và Bos indicus. Sự phân bố các các loại bò nuôi khác nhau hiện nay ở
Châu Á, Châu Âu và Châu Phi được minh hoạ ở bản đồ hình 1.4. Trong đó, các
giống bò của Châu Âu đều thuộc loài phụ Bos taurus và có nguồn gốc thuần hoá từ
vùng Cận Đông. Ở phía đông bắc Châu Á chủ yếu phân bố của bò thuộc loài phụ
Bos taurus, ở khu vực Trung Á và Tây Á là sự phân bố của các giống thuộc bò Bos
indicus, ở phía Đông Nam châu Á bao gồm Việt Nam là bò lai giữa Bos taurus và
Bos indicus. Ở Châu Phi do sự du nhập của các nhóm bò Bos taurus từ phía Tây
Nam Á và bò Bos indicus từ Ấn Độ kết hợp với nhóm bò Bos taurus được thuần
10
gan, lá cây
Không Thấp Đồng trội
Microsatellite ADN Có Trung bình Đồng trội
ADN
fingerprints
ADN Không Trung bình Trội
RAPD ADN Có Trung bình
thấp
Trội
AFLP ADN Có Trung bình cao
Trội
RFLP ADN Không Trung bình Đồng trội
SSCP ADN Có Trung bình Đồng trội
Giải trình tự
ADN
ADN Có Trung bình Đồng trội
SNP ADN Có Trung bình cao
Đồng trội
1.3. CHỈ THỊ MICROSATELLITE
1.3.1. Giới thiệu
12
Thuật ngữ microsatellite được Litt và Luty giới thiệu vào năm 1989 nhằm chỉ
các trình tự ADN lặp lại một cách liên tiếp (Tandemly repeated DNA sequence), có
độ dài chỉ vài cặp bazơ (2-6 bp), có tính đa hình cao và có thể được nhân lên bằng
phản ứng PCR.
Các microsatellite phân bố trên toàn bộ hệ gen, tập trung thành những đám
lặp lại phổ biến khác như kiểu lặp lại 2 nucleotit như (CA)/(GT). Các nghiên cứu
về di truyền học và hóa sinh cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite
là do sự trượt lỗi của enzym polymerase trong quá trình sao chép ADN.
1.3.2. Vai trò của microsatellite
Các microsatellite được dùng như một chỉ thị (marker) di truyền để nghiên
cứu di truyền quần thể, quan hệ tiến hoá, lập bản đồ gen Tuy nhiên có rất nhiều
chứng cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc
nhân tố điều hòa. Nhân tố điều hoà microsatellite được tìm thấy ở khắp nơi trong
phần trước của vùng bắt đầu phiên mã của trình tự mã hoá. Vùng điều khiển có
chứa microsatellite hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và
những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gen.
Microsatellite cũng được thể hiện ra các protein bám mà các protein này có chức
năng bám dính vào các trình tự khởi động của gen, khi trình tự này được giải phóng
thì gen có thể được khởi động và sao mã. Rất nhiều nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng
thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các
đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó. Như một trình tự mang
mã, microsatellite đã được tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau ở
số lần lặp lại của một đoạn amino-acide giống nhau liên quan đến chức năng tác
động. Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, ảnh hưởng chiều dài khác nhau
14
microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan được tổng kết lại
như một yếu tố chức năng của hệ gen. Những tính chất đặc biệt của microsatellite
như sự đột biến điểm dẫn đến những giả thuyết cho rằng microsatellite có thể là
một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lượng và quá trình tiến hoá
thích nghi (Kashi và cộng sự, 1997). Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại
nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc hoặc trôi dạt, nó hoạt
động như một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gen đặc biệt có thể điều chỉnh
nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hoá
(King và cộng sự, 1997, 1999).
màu huỳnh quang khác nhau.
Chất huỳnh quang này được gắn vào một đầu 5’ của cặp mồi, 40 ng mồi loại
này đủ dùng cho 10.000 phản ứng PCR. Kết quả được thể hiện trên máy tính, qua
đó chúng ta có thể xác định được chính xác kích thước của alen, loại trừ những
băng lặp lại (stuter band) hoặc thêm một nucleotide A. Trong quá trình nhỏ mẫu
người ta nhỏ cách nhau từng giếng sau đó nhỏ lại để có thể xác định được mức độ
sang lấn giếng bên cạnh. Người ta thường thiết kế trong cùng một loại chất huỳnh
quang, kích thước trung bình của các alen cách nhau 50bp và chiều dài tốt nhất của
các đoạn ADN là từ 100-300 bp, do vậy mỗi chất nhuộm huỳnh quang tốt nhất là
dùng xác định từ 3-5 locút.
Trong những năm gần đây, kỹ thụât microsatellite đã được ứng dụng để
nghiên cứu cấu trúc và đa dạng di truyền của nhiều quần thể vật nuôi và hoang dã
với số lượng các locút được sử dụng rất khác nhau (Bảng 1.2).
16
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu đa dạng di truyền ở vật nuôi sử dụng kỹ thuật
microsatellite
Loài vật
nuôi
Tác giả Đối tượng nghiên cứu
Số locút
microsatellite
Lợn
Kim và cộng
sự (2005).
Li và cộng sự
(2004)
Nghiên cứu cấu trúc di truyền
của một số giống lợn của Hàn
Zhang và cộng
sự (2007)
Nghiên cứu sự đa dạng di
truyền và sự phân ly của quần
thể Trâu Trung Quốc.
30
Hươu nuôi
nhốt
Thevenon và
cộng sự (2004)
Nghiên c
ứu đa dạng di truyền
hươu sao Việt Nam
9
17
1.4. KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ADN HỆ GEN TY THỂ (mtDNA)
ADN ty thể là một trong những chỉ thị di truyền được sử dụng rộng rãi trong
nghiên cứu cấu trúc và đa dạng di truyền quần thể (Nabholz và cộng sự, 2008). Cấu
trúc ADN ty thể ở động vật có dạng mạch vòng kín với độ dài vào khoảng 15-20 kb
và chứa đựng khoảng 37 gen (Hình 1.5).
Hình 1.5: Cấu trúc phân tử ADN ty thể của bò nuôi
Vùng điều khiển D-loop (displacement loop) có kích thước khoảng 1 kb có vai
trò khởi đầu quá trình sao chép và phiên mã. Ở ADN ty thể, đặc biệt là ở một số
đoạn của vùng điều khiển (D-loop), cytochrome b và locút 12S rARN chúng có
mức độ tiến hóa rất nhanh và đã được chứng minh là rất hiệu quả trong việc nghiên
cứu về cấu trúc và đa dạng di truyền. Phân tử ADN ty thể không trải qua bất kỳ một
trạng thái tái tổ hợp nào. Hơn nữa, hệ gen ty thể có đặc tính di truyền theo dòng mẹ
1.5. NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở BÒ
1.5.1. Sử dụng kỹ thuật phân tích đa hình protein
Trong những năm trước kia, nghiên cứu về đa dạng di truyền ở các quần thể
bò nuôi được thực hiện chủ yếu ở mức độ sinh hoá. Những nghiên cứu này được
thực hiện bởi sự hợp tác của các nhà khoa học từ nhiều chuyên ngành khác nhau
như động vật học, di truyền học, thú y và các nhà tạo giống. Các nghiên cứu về đa
dạng di truyền ở quần thể bò nuôi được thực hiện ở phạm vi rộng từ các quần thể ở
nhiều vùng địa lý khác nhau trên trái đất (Manwell và Baker,1980; Graml và cộng
sự, 1986) cho đến các quần thể có quan hệ gần nhau và cùng phân bố ở một khu
vực địa lý (Kidd và Pirchner, 1971; Kidd và cộng sự, 1980).
Ở bò có mười nhóm máu đã được nhận dạng (A, B, C, FV, J, M, S, Z, R và T)
và chúng đã được sử dụng như các chỉ thị di truyền để xác định sự giống và khác
nhau giữa các quần thể trong nhiều năm (Bell, 1983). Trong những năm 1970, rất
nhiều nghiên cứu về đa dạng di truyền sử dụng hệ thống các nhóm máu và allozyme
được thực hiện ở bò. Hầu hết các kết quả của những nghiên cứu này đều giải thích
rằng bò Bos taurus và Bos indicus có mối quan hệ với nhau về sự phân ly ở mức độ
protein. Manwell và Baker là những người đầu tiên đưa ra kết quả về sự phân ly
nguồn gốc của hai loại bò Bos taurus và Bos indicus.
1.5.2. Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN hệ gen ty thể
Nhiều báo cáo về nghiên cứu đa dạng di truyền ở bò dựa trên phân tử ADN
được đăng tải vào những năm 1990 (Bhat và cộng sự, 1990; Bradley và cộng sự,
1994; 1996; Loftus và cộng sự; 1994a; 1994b; Machugh và cộng sự, 1994; Suzuki
và cộng sự, 1993). Trong số đó, Loftus và cộng sự (1994b) đã chỉ ra rằng phân tích
trình tự ADN ty thể có thể đưa ra một sự ước lượng chính xác thời gian phân ly
giữa hai nhóm bò Bos taurus và Bos indicus và các tác giả đã chỉ ra rằng hai nhóm
bò nói trên được thuần hoá một cách độc lập. Những nghiên cứu gần đây với một
20
số lượng lớn các dữ liệu về trình tự ADN ty thể đưa ra giả thiết rằng bò Bos taurus
của Châu Âu và Bos taurus Châu Phi có thể được thuần hoá độc lập tại các địa
1.5.3. Sử dụng kỹ thuật microsatellite
Kỹ thuật microsatellite đã được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc và đa dạng di
truyền trên nhiều quần thể bò từ khắp các châu lục và với số lượng locút
microsatellite sử dụng cũng rất khác nhau. Moazami-Goudazi và cộng sự (1997)
sử dụng 17 locút microsatellite để nghiên cứu đa dạng di truyền và mối quan hệ di
truyền của 10 giống bò ở Pháp. Schmid và cộng sự (1999) sử dụng 30 locút
microsatellite để nghiên cưu đa dạng di truyền của một số giống bò của ở Thụy Sĩ.
MacHugh và cộng sự (1998) đã sử dụng 20 locút microsatellite để xác đinh cấu
trúc di truyền của 7 giống bò của châu Âu. Martin-Buriel và cộng sự (1999) sử
dụng 30 locút microsatellite để nghiên cứu đa dạng di truyền của 6 giống bò bản
địa Tây Ban Nha. Loftus và cộng sự (1999) sử dụng 20 locút microsatellite để
nghiên cứu mối quan hệ di truyền và tính đa dạng di truyền của một số giống bò
gồm cả Bos taurus và Bos indicus ở vùng Cận Đông, Châu Âu và Tây Phi. Canon
và cộng sự (2001) đã sử dụng 16 chỉ thị microsatellite để xác định cấu trúc di
truyền, mối quan hệ di truyền và tính đa dạng di truyền của 18 giống bò thịt bản địa
của Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha và Pháp nhằm cung cấp những thông tin về tính đa
dạng di truyền và đặc điểm di truyền phân tử phục vụ cho mục đích bảo tồn. Kim
và cộng sự (2002) sử dụng 13 locút microsatellite để nghiên cứu sự sai khác di
truyền và mối quan hệ di truyền của các giống bò ở Đông Bắc Á bao gồm Bắc
Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản, kết quả cho thấy tính đa dạng thể hiện cao
nhất là giống bò của Trung Quốc sau đó là Hàn Quốc và Nhật Bản. Mukesh và
cộng sự (2004) đã sử dụng 20 locút microsatellite để nghiên cứu tính đa dạng di
Copyright: Tài liệu đại học ©