ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN
ĐỀ TÀI KHCN ĐẶC BIỆT CẮP ĐHQG
Tên đề tài: Đa dạng sinh học cùa vi khuẩn kỵ khỉ ôxy hóa Fe(II), khử nitrate
trong một số môi trường sình thái và khả năng ứng dụng của chủng
Mã sổ: QG. 07. 23
Chủ trì đề tài: TS. Đinh Thúy Hằng
Cơ quan: Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN
' HỌC Quoc GIA HA NỌI
tNJG TÁM THỎNG TIN THƯ VIỆN
o ự ẹ i u
Hà Nội, tháng ỉ năm 20ỉ 0
BÁO CÁO KÉT QUẢ THỰC H Ệ N ĐỀ TÀI KHCN ĐẶC BIỆT CÁP DHQG
BÁO CÁO TÓM TẮT
1. Tên đề tài: Đa dạng sinh học cùa vỉ khuẩn kỵ khí ôxy hoả Fe(II), khử nitrate trongmột số môi
trường sinh thái và khả nâng ứng dụng của chúng.
2. Mã số: QG.07.23
3. Thời gian thực biện: 2 năm (2007 - 2009)
4. Cấp quản lý: Đại học Quốc gia Hà nội
5. Chủ trì đề tài: TS. Đinh Thuý Hằng
Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - ĐHQGHN
Điện thoại: 37547694; Fax: 37547407; Email: [email protected]
6 . Cán bộ tham gia: CN. Nguyễn Thị Tuyền
ThS. Nguyễn Minh Giảng
7. Mục tỉêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu:
- Nghiên cứu vả so sánh đa dạng sinh học của vi khuẩn ôxy hoá Fe2+/khử NO3- tại một số môi
trường sinh thái khác nhau.
- Phân lập các nhóm vi khuẩn đại diện, chiếm đa số trong mỗi loại môi trường sinh thái và
nghiên cứu các đặc điểm phân loại, sinh lý, sinh hoá của chúng.
- Nghiên cứu khả năng ứng dụng các chủng vi khuẩn phân lập được vào việc kết hợp loại bỏ

acetate/C0 2 làm nguồn cacbon. Sự sinh trưởng của vi khuẩn trong các ống MPN được nhận
biết thông qua thay đổi màu sắc của môi trường nuôi cấy sang màu vàng nâu do Fe(II) bị ôxy
hoá thành Fe(III).
- DNA tổng số từ các ống MPN đại diện có vi sinh vật phát triển được tách chiết và sử dụng
làm khuôn trong phân ứng PCR khuyếch đại đoạn gen I6 S rDNA có độ dài 550 bp. Phân tích
điện đi biến tính đoạn gen trên cho thấy tính đa dạng khá cao của vi khuẩn trong các ống
MPN. Một số băng điện di đại diện được cắt và thôi gel để đọc trình tự, qua đó đã xác định
được các nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong các môi trường nghiên cứu, cụ thể là
Anaeromyxobacter, Pseudomonas và Paracoccus.
- Đã tiến hành nghiên cứu tính đa dạng của vi sinh vật sinh trưởng trong điều kiện oxy hoả
Fe(II) khử NO3- trong các dãy MPN thông qua phương pháp lai in situ sử dụng các đầu dò
huỳnh quang (FISH) đặc hiệu cho ba nhóm vi khuẩn a-, 0- và y-Proteobacterỉa.
12 chùng vi khuẩn kỵ khí được phân lập và tinh sạch (4 chùng đối với mỗi dạng môi trường
sinh thái). Tính đa dạng cùa các chủng này về mật di truyền được xác định thông qua phân
tích ARDRA đoạn gen mã hoá cho 16S rRNA đài 1500 bp sừ dụng hai enzyme Mspỉ và
Haeììl. Các chùng đại diện cho các nhóm ARDRA được giải trình tự để xác định vị trí phân
loại của cá nhóm vi khuẩn mà chúng đại diện.
- Bằng phương pháp xác định lượng Fe(ll) và NO3" trong môi trường nuôi cấy theo then gian,
chùng vi khuẩn IN 12 đã được chứng minh có khả năng chuyển hoá hai hợp chất này khá cao,
như vậy chủng này có tiềm năng sử dụng trong lĩnh vực môi trường. Bên cạnh đó khả năng sử
dụng Mn(II) thay cho Fe(II) cũng đâ được nghiên cứu, tuy nhiên chùng IN 12 không thể hiện
khả năng ửng dụng để loại bò Mn(IĨ) trong môi trường.
- Các kết quả nghiên cứu đã được công bố trong 02 bài báo khoa học, 01 báo cáo Poster tham
gia hội nghị về sinh thái sinh vật và 02 trình tự gen đăng ký trong GenBank.
- Đã tham gia đào tạo 01 học viên cao học
9. Tình hình sử dụng kỉnh phí
- Tổng kinh phí của đề tài được duyệt: 60.000.000 VNĐ
- Tổng kinh phí của đề tài đã chi: 60.027.400, bao gồm các mục:
+ Chi phí thuê mướn: 24.000.000
+ Chi phí nghiệp vụ chuyên môn: 29.522.400

dilution series in semi-liquid agar tubes.
Study physiology and phylogeny of the isolated strains, afterward select strains for the study
of application potential in elimination of Fe(II), Mn(II) and NO3- in contaminated waters.
8 . The obtained results
- Samples from three ecological environments, namely mud sediment freshwater pond, flooded
paddy soil and sediment from estuarine environment were collected for studying Fe(II)
oxidizing, nitrate reducing bacteria. These environments are known for significant
involvement of bacteria in Fe and nitrogen cycles. Samples at 10 cm depth below the
sediment surface were used for this study.
Number of Fe(II) oxidizing, nitrate reducing bacteria was enumerated via MPN method
earned out in anoxic media with freshwater mineral content (for the samples from freshwater
pond and paddy soil) or brackish water mineral content (for the sample from estuarine
environment). These media contained Fe(II) as electron donor, NO3- as electron acceptor and
trace acetate as carbon source. Growth of bacteria in the MPN series was recognized by
colour changing in the media, from white (Fell precipitation) to dark brown (Felll
precipitation).
Total DNA from representative MPN samples was purified and used in the PCR experiments
to amplify 550 bp fragments of the V3 region of the 16S rDNA and used for analyzing
diversity of bacteria in the communities with DGGE method. Most prominent DGGE bands
were excised, reamlified and sequenced to determine the phylogenetic affiliation of the
respective baterial groups.
Diversity of the bacterial communities in the samples was also analyzed by using in situ
hybridization (FISH) with fluorescent probes specific for the a-, P- and y-Proteobacteria.
12 bacterial strains were isolated and purified (4 strains for each studied environment).
Genetic diversity of these isolates was studied via ARDRA analyzes of Ỉ6 S rDNA with two
endonucleases Mspl and HaelU. 16S rDNA of the strains represented for the RFLP groups
were sequenced and comparatively aligned with the database to identify the phylogenetic
affiliation of the ARDRA groups.
Quantitative analyzes of the amount of Fe(II) and N o r in growth media of the isolated
strains allowed to select strain IN 12 as a candidate for application for simultaneous

3.1. Xác định sổ lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tại ] 5
các môi trường Dghiên cứu
3.2. Phân tích cấu trúc quần thể bằng điện di biến tính (DGGE) 16
3.3. Mức độ oxy hóa Fe(II), khử nitrate của vi sinh vật trong các mẫu 17
3.4. Phản lập vi khuẩn oxy hóa Fe(ll) khử nitrate từ các mẫu nghiên cứu 17
và đánh giá tính đa dạng của các chủng phân lập.
3.5. Phân tích đa dạng vi khuẩn trong các môi trường nghiên cứu 21
bằng phương pháp FISH
3.6. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, phân loại và hoạt tính sinh học 22
của các chủng vi khuẩn đại diện
KẾT LUẬN
KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Các trình tự gen
Phụ lục 2. Tham gia đào tạo khoa học
Phụ lục 3. Các công trình khoa học đã công
DANH MỤC CÁC CHỬVIÉT TẮT
ALF968 Fluorescence probe against a -Proteobacteria
ARDRA Amplified ribosomal DNA restriction analyses
BET42a Fluorescence probe against fi-Proteobacteria
BSA Bovin serum albumin
Cl Chloroform - isoamylalcohol
CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide
DAP1 4’,6-diamino-2-phenylindole
DNA Acid deoxyribonucleic
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate
DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis
EDTA Ethylene-diamine-tetraacetic acid

nước về dạng Fe(III) kết tủa, và hai là loại bỏ NO3-, chuyền thành dạng N2 không độc hại.
Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới cho thấy sự có mặt khá phổ biển của nhóm vi
khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate với mật độ khá cao (106 tể bào/g trầm tích) trong các điều kiện
môi trường khác nhau, bao gồm cả nước ngọt, nước lợ và nước mặn và tại nhiều vị trí địa iý khác
nhau trên thế giới (Straub, Buchholz-Cleven, 1998). Tuy nhiên ờ Việt nam cho đến này chưa có
công trình nghiên cứu nào đề cập đến quá trình sinh học dùng Fe(II) để khử NO3” cũng như các
loài vi khuẩn đảm nhiệm quá trình này. Do vậy, đề tài ' Đa dạng sinh học của vi khuẩn kỵ khí
oxy hoả Fe(IĨ), khử nitrate trong một sổ môi trường sinh thái và khả năng ứng dụng của
chúng ’’ được đặt ra với mục tiêu nghiên cứu tính đa dạng của vi khuẩn khử nitrate sử dụng Fe(II)
là nguồn điện tử duy nhất trong một sổ dạng môi trường sinh thái đặc trung ở Việt Nam, đồng
thời tìm hiểu khả năng ứng dụng của chúng trong việc xử lý các nguồn nước nhiễm ion sắt kim
loại và nitrogen.
1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn tham gia chu trình Fe
Sắt là một trong những kim loại phổ biến nhất và là nguyên tố có mặt trên trái đất với hàm
lượng lớn thứ tư, sau carbon, oxygen và nitrogen. Thông thường sắt tồn tại ờ đạng Fe2Ơ3 ít tan
trong nước và có màu vàng nâu. Trong môi trường pH trung tính, dạng hòa tan trong nước Fe(II)
chi tồn tại ở điều kiện không có oxygen, ví dụ như ở đáy các thủy vực, nơi oxygen hòa tan trong
nước đã bị các vi sinh vật hiếu khí sử đụng đề phân hủy các hợp chất hữu cơ. Quá trình oxy hóa -
khử giữa Fe(II) và Fe(III) có vai trò thiểt yếu trong chu trình sinh địa hóa môi trưởng và là một
trong những quá trình chuyển hoá vật chất quan ưọng có mặt từ rất sớm trên ưái đất. Fe(II) là
thành phần của các dạng khoáng phổ biến như siderite (khoáng chất có chứa FeCƠ3), vivianite
(Fe3(PC>4)2 .8 H2 0 ) hoặc pyrite (Fe$2), trong môi trường kỵ khí có tính acid yểu đến môi trường
trung tính (Straub et ai, 2001). Oxy hóa sắt diễn ra theo cả hai con đường hoá học và sinh học,
trong đó các quá trình sinh học cỏ vai trò đặc biệt quan trọng tại nhiều dạng môi trường sinh thái
khác nhau (hình 1.1). Với thế oxy hóa khử của cặp Fe(II)/Fe(III) là +770 mV đối với môi trường
acid và +200 mV dối với môi truờng trung tính, Fe(II) có thể được sử dụng như chất cho điện tử
để cung cấp đương lượng khử cho các quá trình đồng hóa carbon thành sinh khối nhờ các vi
khuẩn oxy hóa Fe(II) trong cả điều kiện kỵ khí và hiếu khí, còn Fe(III) có thể được sử dụng như

phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, bức tranh đa dạng của nhóm vi sinh vật này ngày càng trở
nên phong phú hơn.
1.2.2. Vi khuẩn quang họp ky khí oxy hỏa Fe(II)
Trong những khu vực có ánh sáng, Fe(III) có the cũng được tạo thành thông qua hoạt tính
oxy hóa Fe(II) của vi khuẩn quang hợp có khà năng sử dụng Fe(II) như một nguồn điện tử để tạo
các đương lượng khử cho quá trình đồng hóa carbon vô cơ (Weber et aỉ., 2006a). Vi khuẩn quang
hợp kỵ khí là vi khuẩn oxy hỏa Fe(II) kỵ khí được biết đến đầu tiên (Widdel et aỉ., 1993). Hiện
nay nhóm vi khuẩn này đã được mô tà với nhiều đại diện thuộc các chi Chỉorobium, Rhodobacier,
Thiodictyon, Rhodovuỉum, Rhodomicrobium (Ehrenreich, Widdel, 1994; Heising, Schink, 1998;
Heising et aì., 1999; Straub et al, 1999; Kappler, Newman, 2004).
Tuy nhiên quá trình oxy hóa Fe(II) bàng quang hợp trong môi trường tự nhiên bị giới hạn
ở độ sâu 200 um trong đất và trầm tích do hạn chế ánh sáng (Ciani et al, 2005). Hơn nữa, những
nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rầng vi khuẩn quang hợp oxy hóa Fe(II) không có khả năng sử dụng
Fe(II) ờ dạng khoảng mà chi có thể oxy hóa Fe(II) ở dạng hòa tan (Kappler, Newman. 2004), do
đó, chúng không đỏng vai trò đáng kể trong chu trình chuyển hoá sắt trên cạn.
3
1.2.3. Vi khuẩn khử nitrate, oxy hóa Fe(II)
Vi khuẩn oxy hoá Fe(II) kỵ khí đóng vai trò quan trọng trong chu trinh chuyển hoá sắt,
đặc biệt trong các lóp trầm tích nơi vi sinh vật bị hạn chế về oxygen hoà tan (Lack eí al., 2002;
Weber et al., 2001; Senn, Hemond, 2002; Straub et al., 2001; Weber et ai, 2006c). Với hiệu điện
thế oxy hóa khử Fe(III)/Fe(II) tại pH 7 vào khoảng +200 mV, Fe(ll) có thể ừờ thành nguồn điện
tử cho quá ưình hô hấp kỵ khí, khử nitrate thành N2 do một số nhóm vi khuẩn đảm nhiệm (Straub
et a i, 1996; Benz et a i, 1998; Weber et ai, 2006c). Quá trình oxy hóa Fe(II), khử nitrate được
tóm tát theo phương trình phản ứng như sau:
10 Fe2+ + 2 N 0 3“ + 24 H20 = 10 Fe(OH)3 ị + N2 T + 9 H21
Trong tự nhiên, quá trình oxy hóa Fe(II) với chất nhận điện tử là nitrate chù yểu diễn ra ở
ranh giới hiếu khí (có oxygen) và kỵ khí (không có oxygen) trong lớp trầm tích ờ đáy các thủy
vực. Vi khuẩn dùng ion Fe(II) làm nguồn cho điện tử để khử nitrate được phân lập đầu tiên từ các
lớp trầm tích ao, hồ nước ngọt tại Bremen (Đức) năm 1996 (Straub et a i, 1996). Một số công
trình nghiên cứu tiếp sau cho thấy sự có mặt phổ biển của nhóm vi khuẩn này với mật độ khá cao

- Gây hiện tượng phủ dưỡng trong các ao hồ: việc tăng hàm lượng nitrogen trong các
ao hồ kéo theo sinh trưởng rầm rộ cùa tảo và các thực vật thủy sinh, dẫn đến tâng nhu
cầu oxygen về đêm và làm ảnh hưởng đến hoạt động sống của các động vật thủy sinh.
- Làm giảm hiệu quả của chỉorỉn: ammonium kết hợp với chlorin tạo hợp chất
chloramin có tác dụng kháng khuẩn kém hom so với chlorin ở dạng tự do.
- Ần mòn: ammonium ở nồng độ trên 1 mg/L có thể gây ăn mòn cho các đường ống dẫn
nước và các công trình kim loại dưới nước.
Ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng
- Gây bệnh thiếu máu: nitrate là nguyên nhân gây bệnh thiếu máu (Methemoglobinemia)
ở người do bị khử thành nitrite trong hệ đường ruột, sau đó liên kết với hemoglobin
dưới dạng methemoglobin, không cỏ khả năng vận chuyển oxygen. Ở người khỏe mạnh,
hàm lượng methemogỉobin trong máu được giữ ổn định ở mức 1 - 2% nhờ enzyme
methemoglobin reductase. Trè em dễ bị ảnh hường cùa bệnh này hơn so với người
trưởng thành vì có độ pH trong dạ dày cao hom, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn
khử nitrate sinh trưởng. Vitamin c được biết đến với khả năng bảo vệ và giữ nồng độ
methemoglobin ở mức thấp.
- Gây bệnh ung thư: nitrite được tạo ra từ nitrate còn có thể kết hợp với các amine thứ
cấp để tạo thành nitrosamine, là tác nhân gây đột biến gen và một số bệnh ung thư như
ung thư dạ dày, ung thư bàng quang (Tricker, Preussmann, 1991; Lundberg, 2004).
Theo quy định quốc tế, giới hạn nitrate trong nước uổng là 10 mg/L.
1.3.2. Ảnh hirởng của nhiễm sắt trong các nguồn nước
Sắt là nguyên tố phổ biến trong tự nhiên, là một thành phần quan trọng trong tồng hợp
hemoglobin (chất vận chuyển oxygen cho các tế bào trong cơ thề) và myoglobin (chất dự trữ
oxygen cho cơ thể). Ngoài ra sắt còn tham gia vào thành phần một số enzyme oxy hoá khử như
cataỉase, peroxydase vả các cytochrome (những chất xúc tác sinh học quan trọng trong cơ thể).
Sắt đóng vai trò quan ưọng trong việc sản xuất ra năng lượng oxy hoá, vận chuyển oxygen, hô
hấp của ty lạp thể và bất hoạt các gốc oxy hóa cỏ hại. Tuy nhiên quá tải sắt trong cơ thể cũng gây
ứ đọng sắt tại các mô như tim, gan, tuyến nội tiết , dẫn đến rối loạn trầm trọng chức năng các cơ
quan này (Trần Thị Kiều My và Nguyễn Hà Thanh, 2006).
Cơ thể hấp thu sắt ở dạng Fe(II). Pepsin tách sắt khỏi các hợp chất hữu cơ và chuyển

lợ được thu ở ven biển Vân Đồn, Quảng Ninh. Mâu chân ruộng và ữầm tích ven biển được thu
thập ừong các ống thủy tính nút xoáy cho phép khoan sâu tới 60 cm dưới bề mặt trầm tích (hình
2.1). Mẫu đáy ao được thu thập trong binh thuỷ tinh, sau đó bổ sung nước vào toàn bộ thề tích để
giảm thiểu sự ảnh hường cùa oxygen trong không khí. Mầu được bảo quản ở nhiệt độ 4°c cho
đến khi tiến bành các thí nghỉệm tiếp theo.
Ỉ
Hình 2.1. Mẫu bùn và trầm tích thu thập ngoài
môi trường tự nhiên, được đảm bảo kỵ khí
nghiêm ngặt.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất được sừ đụng trong nghiên cứu vi sinh vật đều là những hóa chất có tiêu
chuẩn chất lượng cao của các hãng cung cấp lớn nhu Merck (Đức), Sigma (Mỹ). Hoá chất và
một số kit dùng cho phân tích sinh học phân tử do các hãng Bioneer (Hàn Quốc), Fermentas
(Đức), Qiagen (Mỹ), ABI (Mỹ), BioRad (Mỹ) cung cấp.
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cửu
Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - ĐHQGHN, sử
dụng các thiết bị chuyên môn dùng ừong vi sinh vật học, sinh học phân tử và hoá phân tích đạt
tiêu chuẩn quốc tế.
2.2. Phirong pháp nghiên cứu
2.2.1. Xác định số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate
Số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate được xác định thông qua phương pháp MPN
(American Public Health Association, 1969) trong môi trường dịch thể kỵ khí hoàn toàn có thành
phần khoáng tương úmg với nước ngọt (dùng cho mẫu bùn đáy ao và chân ruộng ngập nước) hoặc
nước lợ (dùng cho mẫu trầm tích ven biển) (bàng 2 .1 ).
7
Băng 2.1. Môi trường kboáng kỵ khí nirớc ngọt và nước lợ cho vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử
nitrate (Ratering, 1999).
Thàob phần
Nước ngọt
Nước lợ

Vitamin B12 0 , 1 ml 0 ,1 ml
Vitamin B2
1 ml 1 ml
Na-Acetate 1 M
I ml
1 ml
NaNƠ3 I M (chất nhận điện tử) 5 ml (5 mM)
5 ml (5 mM)
FeS04 1 M (chất cho điện tử) 10 ml (10 mM)
1 0 ml (10 mM)
NaHC03 1 M 30 ml
30 ml
Chuẩn pH ở 7-7,2, sau đó chia môi trường sang các bình serum và ống nghiệm rồi sục khí N2)
đậy bình và ống nghiệm bầng nút
cao su có kẹp nhôm hay nút vặn có lỗ hở.
Mẩu được bổ sung vào ống MPN đầu tiên với tỷ lệ 10% thể tích. Thí nghiệm được ủ tại
28 °c trong 8 tuần, sự phát triển của vi khuẩn trong ống MPN được ghi nhận thông qua đổi màu
môi trường từ trắng đục (màu của Fell) sang vàng nâu (màu cùa Felll).
2.2.2. Phân lập vỉ khuẩn kỵ khíoxy hoả Fe(IỈ) khử nitrate
Ống MPN ờ nồng độ pha loãng cao nhất có vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate phát triển
được sử đụng để làm nguồn phân lập các khuẩn lạc đơn. Việc phân lập được tiến hành theo
phương pháp pha loãng trên dãy ổng thạch bán lỏng ( 1%) với môi trường có thành phần tương tự
như môi trường dùng trong phương pháp MPN (Widdel, Bak, 1992). Ống thạch bán lòng sau khi
bổ sung nguồn vi sinh vật (10%) từ ống MPN (nguồn phân lập) được sục khí N2 và ủ ở tư thế đảo
8
ngược đầu tại 28°c trong bóng tối. Khuẩn lạc đom phát triển trong các ổng pha loãng được tách
bằng pipet Pasteur và chuyển sang môi trường dịch thể thích hợp (nước ngọt hay nước lợ).
2.2.3. Tách DNA tồng sổ từ mẫu quần thể và chủng vi sinh vật
DNA tổng số của quẩn thể vi sinh vật từ các ống MPN được tách chiết theo phương pháp
do Zhou và cộng sự (1996) mô tà với cải biến về nồng độ đệm phosphate là 120 mM thay cho

£<*># T uel Ec1f *
“ . / A.
___
^ mi
16S rDNA 0
VI V2 V3 , V4 j V5
i. ♦
+ E c S 1BrL a c ĩ W IAB2 WBAC7 £*1 406
HÕA2 ♦
itw
Hình 2.2. Vùng V3-V5 và vị trí các mồi trên gen 16S rDNA ở Lactobacillusplantarum
Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR khuyếch đại đoạn V3-V5 ờ vi khuẩn như sau:
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR khuyếch đại vùng V3-V5 của
gen 16S rĐNA
Thành phần phản ứng
Thể tích (jil)
Chu kỳ nhiệt (touch-down PCR)
h 20 m q 27
Taq polymerase được đưa vào phàn ứng sau
IOx Taq buffer 5
bước biến tính đầu tiên ờ 94 °c trong 1 phút
BSA
5
khi nhiệt độ đạt 80 °c. Nhiệt độ gắn mồi
MgCl2(20 mM)
4
được đặt cao hon 1 0 °c so với nhiệt độ lý
dNTP (2,5 mM mỗi loại)
4
thuyết (tức là 65 °C). Sau mỗi chu kỳ nhiệt

2.2.7. Phương pháp FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) (Amann et al., 1992)
Nguyên lý: FISH là phương pháp lai sử dụng các đầu dò thích hợp bắt cặp với rRNA nhàm xác
định phả hệ cùa vi sinh vật trong quần thể một cách trực tiếp, không qua bước phân lập và nuôi
Chuẩn bị bóa chất:
Formaldehyde 37% PBS I Ox
5 M NaCl I M Tris-HCl
0,5 M EDTA SDSỈ0%
Formamide DAPI (0,02 mg/ml)
Đầu dò: là các đoạn oligonucleotide đài 18-20 nucleotide gán chất huỳnh quang
sulphoindocyonide (CY3, hấp phụ bước sóng 552 nm). Các đầu dò đã sử dụng trong nghiên
cứu này được liệt kê trong bảng dưới đây (nồng độ 2 ng/^1).
Bảng 2.4. Các đầu dò sử dụng trong nghiên cứu
Tên đầu dò Đối tượng bắt cặp
Trình tự (5’-> 3’)
Formamide (%)
ALF968 a -Proteobacteria
GGTAAGGTTCTGCGCGTT 2 0
BET42a p -Proteobacíeria
GCCTTCCCACTTCGTTT 35
GAM42a y-Proteobacteria AAACGATGTGGGAAGGC
35
Bảng 2.5. Chuẩn bị đệm lai và đệm rửa
Dung dịch gổc
Thê tích
2 ml đệm lai 50 mi đệm rửa
5 M NaCl 360
9 ml 900 mM
1 M Tris/HCl
40 ụ\
1 ml 20 mM

48 °c trong 15 phút. Gạn bớt đệm và đổ mẫu ra đĩa Petri. Dùng kẹp gắp mẫu, nhúng qua
nước cất vô trùng trong vài giây và đặt lên giấy thấm cho khô (mật có mẫu ở trên).
Nhuôm đối chửng và quan sát:
- Đe nhuộm đối chứng, nhỏ 50 nl dung dịch DAPI lên mồi mẫu, giữ 3 phút trong tối, sau đó
rửa nhanh trong nước cất và rửa trong cồn 80% trong vài giây rồi để khô trong không khí (đặt
trong hộp tối). Mầu có thể được bảo quản trong -20°c trong vài ngày mà tín hiệu huỳnh
quang không bị thay đổi.
- Phủ một lớp Citifluor/Vecta shield (4:1 v/v) và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
2.2.9. Định lượng Fe(II), Mn(II) và nitrate
Định Iưựng Fe(II) bằng thuổc thử phenanthroiin {DIN 38406 E1-], 1983)
Nguyên lý: O- phenanthrolin phản ứng với Fe(II) tạo phức có màu tím đỏ trong khoảng pH 3 -9,
đo được ở bước sóng 510 run. Nồng độ Fe(II) cho phép là 0,01 - 5 mg/L. Ket quà của phép đo có
thể bị ảnh hưởng bời ion Mn và Cu.
12
Chuẩn bị:
Dung dịch HC1 25% (rửa dụng cụ): dụng cụ thủy tinh thí nghiệm phải được rửa qua dung
dịch HC125% sau đó tráng bằng nước cất trước khi sử dụng.
Dung dịch H2SO4 loãng (hạ pH): H2 SO4 đặc : nước =1:4
Dung dịch ammonium acetate 5,2 M (đệm):
CH3COONH4 40 g
CH3COOH 50 mi
Nước cất đủ 100 ml
Dung dịch phenanthrolin 21 mM (tạo phức):
C12H9C1N2.H20 0,5 g
Nước cất đủ 100 ml
(Bảo quản trong lọ tối, hạn sử dụng trong 1 tuần)
Dung dịch chuẩn:
FeS04.7H20 2,78 mg
HC1 25% 6,25 ml
Nước cất đù 100 ml

- Đo OD tại bước sóng 410 tun.
- Đường chuẩn được xây dựng trên các nồng độ dung dịch chuẩn trong khoảng từ 0-10 mM.
Định lượng Mn(n) bằng thuốc thử formaldoxime (Brewer and Spencer, 1971)
Nguyên lý: Mangan phản ứng màu với formaldoxime (formaldehyde oxime) trong môi trường
kiềm tạo thành phức có màu cam đò đậm, xác định ờ bước sóng 450 nm. Để không hình thành
các kết tủa hydroxiđ, pH tối ưu cùa phương pháp này lả 8 ,8 - 8,9.
Chuẩn bị:
Dung dịch formaldoxime:
20g Hydroxygenlamine hydrochloride hòa tan trong 450 ml nước cất, thêm 10 ml dung
dịch formaldehyde 37% và thêm nước đến 500m].
Dung dịch ammonia (NH3)
Hỗn hợp formalđoxime:ammonia theo ti lệ 5:2 (thể tích)
Dung dịch chuẩn (100 )ag mangan/ml):
Hòa tan 0,2876 g permanganate kali (KMn04) trong 100 ml nước cất, thêm 3 ml dung
dịch H2 SO4 đầm đặc, dẫn acid sunfurous (SO2 trong nước) cho đán khi dung dịch mất
màu. Đun sôi dung dịch để loại bỏ SO2 thừa sau đó iàm lạnh. Bổ sung nuớc cho đù 1 lít.
Tiến hành:
- Đưa 35 mi mẫu về pH = 8 , 8 - 8,9
- Thêm 3 ml hỗn hợp Formaldoxime/Ammonia vào lắc xoay tròn, đều.
- Sau 2 - 30 phút đo quang phổ hấp thụ ờ bước sóng 450 nm.
- Đường chuẩn được xây dựng trên các nồng độ dung địch chuẩn trong khoảng từ 0 - 10 mM.
14
CHƯƠNG IU. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xấc định số lưọng vi ldraẩn oxy hỏa Fe(]I), khử N O 3' tại các mỏi trưừng nghiên cứu
Ba môi trường đại diện được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu gồm có bủn đáy ao nước
ngọt, chân ruộng lúa ngâp nước và trầm tích nước lợ ven biển. Đây là những môi trường có hoạt
động vi sinh vật trong chu trình chuyển hoá sắt và nitrogen cao (Ratering, Schnell, 2000). số
lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử NO3" trong các mẫu thu thập được xác định thông qua
pbưcmg pháp MPN sử dụng môi trường địch thể chứa FeSC>4 làm chất cho điện tử và NaNƠ3 làm
chất nhận điện tử cuối cùng. Thành phần khoáng trong môi tnrờng tương ứng với điều kiện nước

- Bùn chân ruộng ngập nước; B - Bùn trầm tích ven biển.
Cỏ thể thấy rằng các loài Anaeromyxobacter có mặt trong cả 3 dạng môi trường nghiên
cứu. Đây là nhóm vi khuẩn nằm trong phân lớp h-Proteobacteria, hiện mới chi có một loài duy
nhất được công bố là A. dehaỉogenans cùng với một sổ đại diện chưa định đanh đến loài. Các
chủng Anaeromyxobacter đã công bố đều sinh trường kỵ khí khử Fe(III), chưa có chùng nào 4
được nghiên cứu về khả năng sinh trưởng khừ NO3”, sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Treude
et ai., 2003; Straub, Buchholz-Cleven, 1998; Straub et al., 1996). Trong môi trường nuôi cấy sử
dụng ờ đây (cũng như trong điều kiện tự nhiên), Fe(III) đồng thời tồn tại với Fe(II) đo kết quả
chuyển hoá Fe(II) bằng con đường hoá học (phàn ứng với lượng nhò oxygen trong môi trường)
và con đường sinh học (đo các vi sinh vật oxy hoá Fe(II) khử NC>3_). Do vậy, sự có mặt cùa các
loài sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III) như Anaeromyxobacter trong điều kiện môi trường nghiên
cứu trên (cũng như trong tự nhiên) là mắt xích khép kín chu trình chuyển hoá sẳt tại đây.
Hai nhóm vi khuẩn Paracoccus và Pseudomonas tương ứng chiếm ưu thế trong các mẫu
bùn ao nước ngọt và chân ruộng ngập nước. Đây là hai chi thuộc lófp Proíeobacteria, có nhiều đại
diện sinh trưởng kỵ khí khử NOj", bao gồm cả các loài có khả nãng sử dụng Fe(II) làm chất cho
điện tử (Weber et aỉ., 2006b,c; Ratering, Schnell, 2000). Như vậy có thề kết luận ràng trong môi
trường nước ngọt tại Việt Nam (đại diện là ao nước ngọt và ruộng ngập nước), Paracoccus và
16