ĐAI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HOC Tự NHIÊN
NGHIÊN CỨU PROTEINAZ Được TIẾT RA TỪ
CÁC VI KHUẨN GẦY BỆNH CÔN TRÙNG TRONG PHỨC
HỆ CỘNG SINH TUYẾN TRỪNG-VI KHUAN
MÃ SỐ: QT -01 - 15
CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI: TS. Trịnh Hổng Thái
đai họ c QUOC GIA HÀ N ỏ r
TRUNG TÂM t h ô n g Tin thư viện
D ĩ / 2 Ỹ Z s
CÁC CÁN BỘ THAM GIA:
1. ThS. Phan Thị Hà
2. CN. Lưong ThuỲ Dương
3. T rịnh T hị T ha nh H ươ ng
H A N ỘI - 2004
1.01 CAM ON
c I m u
V
It'll .XI li chan i l i j i i l i ( a m tin I n l i t ( i n i / n ( I n c f)ji
hoc (
2
HOC XI11 llủ Xnt, Hon kìm a hục-Cònạ li'Jic. ỉ ) ll(J( ilI,x .
Hun (itáiii iiicii ! rườnạ i)ụi Ihn KliOil hoc l ự nliicn. IỈUII Chú
nhiệm Khoa Si/ilì học, riiònx Klioa học- Côiiiỉ Iiạhệ vù riỉònỊi
lủi vụ l rườiiỵ DI1KIITN ilã AVI duyệt vù cunạ cáp kinh phí
di' thực h iậi (ít' lủi.
Ch lì IIX lôi xin chã II ! hủ nil cùm (in Till II i> lâm 67;//”
iiíịIìc smli hoc, DllQdllN. Tritníi tủm Sinh học phún íử YÙ
Côn lị iHịliệ lữ hào dã lạo mọi íliứu kiợn cá/ì ỉíìicĩ rỡ traiiy ihicl
bị cũni’ như ý úp dỡ VC (iìuycn lìióiì clc clí' lủi ill ực Ini'll vó kcí
quà.
PHIẾU ĐANG KÝ KẾT
QUẢ NGHIÊN c Cu KHOA HÓC'
BAO CAO TOM TĂT
Ten dỏ tài: Nghiên cứu proleinaz dirợc Iici la lừ các VI khuân i:áv benh Lt'II
trùng trong phức hệ cộn II sinh lu veil trìiriLi-\ 1 khuãn
Người (hực hiên:
• Chú trì dề tài: TS. Trinh Hóna Thái. Khoa Sinh hoc. Trưừriii Đại hoc
KHTN
• Các cán bộ tham gia:
ThS. Phan Thị Mà: Trung tâm Cóng nuhộ Sinh học. ĐI1QGHN
CN. Lương Thuỳ Dương: Khoa Sinh hoc, Trườn2 Đai hoc Khoa học
Tự nhiên.
- Trịnh Thị Thanh Hương: Khoa Sinh học, Trường Đai hoc Khoa học
Tự nhiên.
• Cơ quan chú trì: Trường Đai học Khoa hoc Tư nhien
Nội dung nghiên cứu đã đãng ký:
• Nuôi cấy vi khuẩn phân lập từ tu vốn trùnu
• Nghiên cứu thành phần và một số tính chất của protcinaz do vi khuán tiết
ra.
• Tinh sạch proteinaz chú yêu bằng phương pháp sắc ký
• Nghiên cứu một số tính chất của proteinaz
Các kết quả chính đà đat được:
• Phân lâp các chủng vi khuẩn từ tuyến trùng Steincrnema và
Heterorìiabdiús, nuôi cấy các chủng vi khuẩn phân lập được.
• N»hiên cứu một số tính chất của proteinaz ngoại bào từ các VI khuan gây
bệnh côn trùng.
• Tinh sạch một phán proteinaz ngoại bào từ VI khuẩn.
Sản phẩm khoa học đã hoàn thành:
• Một báo cáo tóm lát tham gia Hội nghị khoa học Khoa Sinh hoc và Hội
no hi khoa hoc Trường Đại học Khoa học tự nhiên. s
U M 1
khoang N 1
r
• Thử mlì hưone cua uk chai ức chi' il.k liiL‘11 nh- >n 1 chi> i!u_\ ciì/\in h ư-
mạnh iVvi 11)1 A vã r\lSI'. in'Hi! i!*» ư, dk' m.tnli nil/ll Km ỉ I )TA
• Trong số các ion kim loại hoá trị hai được thư, en/ym bị ức chê manh bới
Hg2\ sau đó đến Cu2". N r \ Zn2+. Co:~ và Pb:\ Nạược lại. các lon Mn:'.
Ca2+ đã làm tăng hoat đó enzvm.
• Proteinaz của VI khuán Photorhakdus limúnescens Hp đã được tách và tinh
sạch qua các bước: kết tủa băng axeton. sắc ký qua cột DEAE Sephadex A-
50 và cuối cùng qua cột Mini Q PE 4.6/50. Kết quá thu được 5 đính protein
có hoạt tinh enzym. Trong đó một dinh protein đã được gìn đi phân tích trình
tự axit amin.
8. Tinh hình sử dụng kinh phí:
• Tổng kinh phí được cáp:
28.000.000 d
Trong đó:
- Vật tư vãn phòng:
- Hội nghị:
900.000 d
900.000 đ
- Chi phí thuê mướn:
14.200.000 d
- Chi phí nghiệp vụ chuyên môn:
12.000.000 d
KHOA QUẢN LÝ
(Ký và ghi rõ họ tên)
ìiừ nội, niịủv 11 lliúiiíi 10 Iiăm 2004
CHÚ TRÌ ĐÍÌ TÀI
(Ký và ị»hi rồ ho tên)
+ Characterization of proteinases: their pH optimum was 8. temperature
optimum was c. the proteinasesvvere less stable in mcLihatini: ai 60 c.
Proteinases were strongly inhibited by EDTA and PMSF.
Results in training:
+ 3 student s scientific papers in Student Scientific Conference of
2002.
+ 1 MSc. Students will present her thesis in December 2004.
Publications:
+ Trinh Hong Thai, Trinh Thi Thanh Huong. I Alone Thuy Duoim.
Phan Thi Ha, (2002). Xenorhabdus sp. CA: characterization of
extracellular proteinases from enlomopaihogcnic bacteria.
Genetics and Applications (Biotechnology Number) pp. 1-5.
+ Trinh Hong Thai, Trinh Thi Thanh Huong, Phan Thi Ha, (2002 ).
Characterization of extracellular proteinuses from
entomopathogenic bacteria {Xeiioihabdits sp. XS4). Genetics and
Applications (Biotechnology Number) pp. 6-12.
+ Trinh Hong Thai, Trinh Thi Thanh Huong, Luong Thuy Duong.
Phan Thi Ha, (2004).: Composition of extracellular proteina.ses
produce by entomopathogenic bacteria (Xenoiliiibihts sp. CA) J.
of Science. Natural Sicence (in press).
+ Trinh Thi Thanh Huoniz. Trinh Hong Thai. (2004).
Characterization of extracellular proicinases from bacteria
Photoi'habclus luminesce/is HP. J. of Scicncc. Natural Siccikj
(Biological number) (in press).
BÁO CÁO CHI TIÊT
I. M Ở ĐẨU
Xenovhahdus và Photorhabdus là các VI khuân còng sinh với tuyên trùng
Stemem em a và Heterorhabditis tương ứng. Tuyến trùng ký sinh còn trùng dã được
chứng minh có tác dung gáy chết đối VỚI nhiểu loại sâu hai cây trông [6], Tuyến trùng
cam nhiễm mang trong ống tiêu hoá cua mình vi khuân còng sinh tao nên phức hộ
HC1 20mM, pH 8,0. Các protein không hấp phụ trên CỘI được rứa vái cùng dóm trẽn.
Sau đó thôi các protein híp phụ trên cột sứ dung cùng loa, đèm trẽn có chứa N ad v i
các nồng độ (M): 0,1; 0,2; 0.3; 0,4; 0,5 và ] 0.
Các phân đoạn có hoạt tính proteinaz thu được từ cột DEAE Sephadex AÕ0
được dôn lại và loại muối, sau đó được tinh sạch tiếp qua cột Mini Q PE 4.6/50
Xác định hoạt độ của protcinaz: hoạt độ' proteinaz đã được xác định theo
phương pháp Kunitz có cải tiên như đã mô tả trước đây [16]
Định lượng protein theo phương pháp Bradford sử dụng albumin huyết thanh ho
làm chuẩn.
Điên di protein trên gel polyacylamit có SDS (SDS-PAGE) theo phương phá,,
cùa Laemmli (1970) [10].
Điện di proteinaz theo phương pháp của Heussen vù Dovvdlc (1980) dược thực
hiện như đã mỏ ta từ trước [16],
III. KẾT QUẢ NGHIÊN cứ u
1. Protcinaz của vi khuẩn Xenorìiabdus
1.1. Nghiên cứu tính chất của proteinaz
l .1.1. pH thích hop của proteinaz
Sir thine các đệm có nỏnii (.lộ 0,2 M đè xác đinh pl í thích hop cun proicnu/ d,ì
cho Ihây: với xs. cn/ym hoạt đónt: mạnh (V pl 1 «s. ớ pll 10. hoại dọ L'11/vm Lii:im manh
chí còn khoáng MYi so vó'i hoạt đo cưc dai. Với mail CA. hoai độ của ni/vm il.it a IV
l ỉ a i ( í p l ] s . T u i p ] I
7
. h o a i d ô b ă n li k h o a n g
9 0
' r s o \ O I
111
t;i( đ o U I V ( X u ( l ì m l i I I
■ xs
« CA
Hình If Ảnh hướng của pH đến hoat độ proteinaz cùa vi khuẩn cóng sinh với
Mg2+ 10 3 104,1
111.4
M n2+ 10 3 92,1 70.56
Fe2+ 10 3 99,0
97.08
Co2+
103 60,6
61.04
Cu2+
103
32.6
57.29
Zn2+
10'3
26,1
49.17
Hg2+
1 0 3
0
25.28
1.1.4. Độ bén với nhiệt Ở60°c
Giữ dung dịch en/ym ớ 60°c, sau những khoang thời gian nhai clịnh làm !anh
nhanh chúng và xác định hoạt độ proteinaz ở 37°c. Kết quả cho thây hoạt đỏ cn/ym
giảm dần theo thời gian sử lý à 60"c (hình 3). Vứi xs. sau 20 phút, hoạt (lo con
khoản^ 50% so với hoạt độ ban đầu. Tuy nhiên, với CA, en/ym kém bén hơn, đe da»
được giá trị trên chí sail chưa đôn 10 phut.
Tlioi L'ian (pluit)
H ìn h .ì . Su- h icr. <1 I,.u . .ló p rm o in:,/ M U v i k lu ú n V n r , M>
ihco thoi eian \ứ lv t’ M I (
1.1.ĩ . 1’h a n lú-l, th à n h p h u n pw trìm r bm vi d ư n di
^ t)ó n g khó
Dịch cô đặc 10 lần
ký qua cột Scph adex G-100
Các phân đoạn có hoạt
tính enzym
^ S á c kv qua cót D E A E Sephadex A-50
Các Phân đoạn có hoat tính enzym
Quv trình 1
Dịch nuôi cấy vi khuẩn
4,S àc kv cót D EAE Sepliadi-X A-50
Các phân đoan có hoạt tính cnz\'in
Quy trình 2
Trong hai quy trình tinh sạch, quy trình 2 đơn gián hơn và cho kết quá tương dưưnii
với quy trình 1. Vì vạy, quy trình 2 đã được lựa chọn để tinh sạch proteinaz có trong
dịch nuôi cấy vi khuẩn Xeuorhabdus sp. Kết quả trên hình 5 cho thấy: các phân đoạn
có hoạt tính proteinaz chủ yếu là nhũng phân đoạn không hấp phụ trôn cột và đưoc rửa
khỏi cột trong một số lần rửa đẩu tiên bằng đệm Tris-HCl 2QmM, pH 8,0 . Proiemaz đã
được tách ra khỏi các protein hấp phụ trên cột.
0 10
P h ù n đi»ạn
20 30
4 fl Síi
(a)
(b)
Hình 6 : sắc ký trao đổi ion dịch nuôi cây vi khuẩn Xoưuhabdus sp. trẽn cột
DEAE Sephadex A-50 (a: xs, b: CA). Cột được cán băng với đệm Tns-HCl 2()mM. pi I
8.0. Thỏi protein hấp phụ trên cột hãng cùng đêm liên có NuCl ơ các nòng đỏ (Mj: 0.1;
0 °- 0 3' 0 4' 0 -V và 1,0. Tốc dó chay: 30 ml/ íĩiờ. The lích mỏi phân đoan: 3 ml.
Hấp phụ ờ 280nm,
< '.K h'H k in I' ‘.li
llình s- Anh liiro'Ui: ciut C.K' I' 'II k Im loại hoa 111 lu I len 111 UI 1 I ỉ'1 Ị 'I! 'U 11!,1 , 11K í I
ịlt.,ui hào \ 1 kliuâii r.lim un , (■/;• H r
2.1.4. Độ bén vói nhiệt ở 60"c
Enzym được ú ớ 60"c trong các khoảng thời gian 0. 5. 10. XI 311. 40. 5». 6(1
phút Sau mỏi thời gian ú. enzym đuực lấy ra va cho ngay vào 4T . Xác dịnh hoái dọ
proteinaz theo phương pháp Kunitz, ta có kết quả trẽn hình 9
Hình 9: Độ bển nhiệt của proteinaz trong địch ngoại bao vi khuán
p.luminescens ỉĩp
Kết quả cho thấy: sau 5 phút ủ 60°c hoạt tính enzvm giảm di nhanh chóng, chí
còn 50% và sau 10 phút ú 6 0 °c hoạt tính enzym chi còn 24% so với hoạt dò han dấu.
Có thể kết luận ràng enzym trong dịch ngoại bào do vi khuẩn p.luminescent up li cl ra
không bền với nhiệt độ.
2.1.5. Phán tích thành phán proteinaz bằng điện di
Bằng phương pháp điện di enzym chúng tỏi đã thu được kết quá vẽ thành phan
protcinaz trong dich nghiên cứu (hình 2 phụ lục).
1
Dưa vào kết quá điện di củ the chia các proteina/ thanh 3 khu vực lớn. Khu VƯU
I gổm các proteinaz có dò di dộng điện di (Rf) từ 0,03 đốn 0,08 Iron” dó có ha! bãim
en/.vm chính: hãn li I có Rí 0.03 và bãnu 2 LÓ 0,08. Khu vưc II chứa các pmtcma/ có
dô di đôn11 clicn di lừ 0.2^ đèn 0,39 va cn/.vm o' khu vực III có (tộ di đọni: (liện di (' ỹ
Điên di cn/vm ủ VỚI các chat ức chẽ dặc hiệu chúnLi tôi nhan thây PMSÍ- ƯL chõ các
prolcm i/ nãm iron í! kìm VIIV I và II. còn 1:1) ỉ A úc ché manh L.tv pioicin.1/ khu \!k I
\'à moi phan khu VIIV III. Như vay. cac pmtciiKi/ ihui'v. khu MR I hi Ưv d v Km .1
HDTA va PMSI
,™ „ r Jhư!n?,c" c;k ion kim h'“ ■"h'“ - P'V— o.
tit ,"^n
T.
ds'h0 lMy: nhin chuns- * «"*•
z
r—
'<õ
0
Z
0 10 20 30 40
Phân đoan
50
60
Hình 10: sác ký trao đổi ion dịch nuôi cấy vi khuẩn p.ìuminesccns llp trẽn CỘI DF.AK
Sephadex A-50. Mẫu lên cột: dịch nuôi cấy vi khuân p.ỉumnicsccns ///; dã dược tua
bằng 3 thê tích axètón. Cột được cân bằng với dận Tris-HCl 20 mM, pf [ 8.0. Protein hấp
phụ tròn cột dược rút xuống bằns dệm tiên có NaCl ỏ các nồng độ (M): 0,1; 0,2; 0,3 va 1,0.
Tòbdộ cháy: 30 ml/íiiờ. Thế tích mỏi phân đoạn: 3ml.
NaCI, 0 Hoạt dộ en/.vni.
Dịch nuôi cây vi khuán. sau khi tua bán SI axêiôn. được chay qua cột DÍÍAK
Scphadcx AÕO (hình 10), hoạt độ cn/.ym manh nhãì dược rút xuống cột à nony ilo
NaCI 0.2M. Các phân doan na\ dược don lại, sau k lì 1 loại imioi. được ch.iv Lị LUI mi
Mini Q PI: 4.6/30 (hình 1 1 ). Kcl C]uá dã thu được 5 đinh có hoai đó protcinu/. Tron^
đó dinh chù yếu đã dược iiửi cĩI phân tích trình lự axil amm.
HP302c401; I u v 1 280nm
HP302c40I: I Cone
HP3(J2c40 I: I Fractions
mAU
5.0
4 (J
3.0
I 4 8
I
81)
Nhu váy, trong mỏi Iruóng nuôi cấy vi khuân X tm riú M m va ri„.,„rhaMu> dã
tạo ra các proteinaz. Các enzyni này hoạt động mạnh a pH 8 và đirợc phán loại thuiy
nhóm proleinaz kim loại dựa Irên lính chát bị ức chế dác hiệu bói EDTA theo phán loai
cúa Hartley (1960) [9].
Proteinaz kim loại là enzym được tìm thấy ớ nhiều loai vi khuán gãy bệnh con
trùng như: Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis và Sen alia murcesccns
[11,12]. Proteinaz kim loại cung được tìm thấy ờ các vi khuấn cóng sinh với tuvón
trùng thuộc các chủng Xenorhabdus [14,15,16] và Photorhabdus [12,15.16],
Các nghiên cứu từ trước đều cho biêt vi khuấn cộr)2 sinh với tu yen tiùn° tiẽt ra
một lượng lớn proteinaz trong môi trường nuôi câv [4,12,14.15.161- Các proteinaz na\
được phân loại thuộc proteinaz kiềm với pH thích hợp bàng 8 và thuộc nhóm protein,!/
kim loại do chúng bị ức chế mạnh bởi ẸDTA. chúng không bị ức ché bới
PMSF[14,16]. Tuy nhiên, rất ít công trình nghiên cứu đi sâu phân lích thành phấn
proteinaz ngoại bào của vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng. Trong nghiên cứu này.
chúng tồi nhận thấy proteinaz ngoại bào của Xenorhabchts sp. CA. không những bị ức
chế mạnh bởi EDTA mà còn bị ức chế mạnh bởi PMSF. Bàng kỹ thuật điện di
protcinaz, chúng tôi đã xác đinh được thành phần của proteinax, tronti dó bán 12
protcinaz có hoạt đổ mạnh nhất thuộc vùng II bị ức chế mạnh bới cá EDTA và PMSI\
còn các bàng proteinaz trong vùns III bị ức chế mạnh bới PMSF nhưng cũng bị ức chó'
một phấn bới EDTA. Nghiên cứu ảnh hưởng của các lơn kim loai đốn hoạt độ proteina/
dã cho thấy các ion Ca2\ Ba2+. Mg2\ Mn:+ có tác tiling khôi phục hoạt tính cua ban.:
0.25 sau khi bị ức chế bới EDTA. còn Pb2+ chí có tác dung với hãng 0,31. Vì vây. có
thế cho rànơ hai băng này thuộc loại proteinaz kim loại-xêrin như dã dược tìm thây ơ
vi khuẩn Bacillus pumihts [5].
So sánh °iữa các chùim VI khuẩn dược nghiên cứu Xí’ii(>rh(ib(lu.\ và
PlìoỊorlnihdus. chú ne lôi nhàn 1 hâ> prolcina/. ngoai hao cua cluiiiy đcu hoa! il.mL’
manh oplis kém hen \iVi nhiệt. lín/vm hi ức chõ manh h.li i;i)l.\ va I'M,SI'.
Ptvin tích I hành’ pli.ìn pioiemu/ ba ny dicn ill il.ì cho [ha_\ L\I Xrncì ÌUIÌUÌII- .1
riio iorliuhiln s dcu co chưa kìni! protcm a/ hi irc LỈÌC h.M H ) I A \ ;i ['MSI- II: í:
urơn- này da ihn.vc 1’hnm Thi IV,MI H ull va llcniẠk l 'rK.nok | | " 7-Ị' tim ilú> •
I A \ a P M S I - .
VI. KIẾN NCỈH1
Dc „ hị úop UK a, V.U nsh iín aru ca, linh đ,:„ a u rn-u :,n,/ .1, null I.
nghK-n cứ,i sự mon. I.K' piíra lw l a " -,u klul;m ■ " "
111 yen trùng.
VII. TÀI LIÊU THAM KHẢO
1. Akhurst R.J., 1982. Antibiotic activity of Xenorhalulus spp bacteria
symbolically associated with insect pathogenic nematodes of the families
Heterorhabditidae and Steinernematidae. J. Gen. Microbiol 128: 3061- 3065.
2. Akhurst R.J., Dunphy G.B 1993, Tripartite interactions between symbolically
associated entomopathogenic bacteria, nematodes and their insect hosts. In:
Parasites and Pathogens of Insects. Beckagc N Thompson s Fedenci B. (Eds).
Academic Press, NewYork, Vol. 2 p. 1-23.
3. Bowen D.J and Ensign J.C 1998. Purification and characterization of a hight
molecular weight insecticidal protein complex produced by the
entomopathogenic bacterium Photorhabdus litmittescens. Appl. Enviror.
Microbiol., 64 (8 ): 3029-3035.
4. Caldas c., A. Cherqui, A. Pereira, N. Simoes, 2002. Purification and
characterization of an extracellular protease from Xenorhabdus liematopliila
involved in insect immunosuppression. Applied and Environmental
Microbiology, 68(3): 1297-1304.
5. Phạm Thị Trân Châu and Urbanek H., 1974. Serine neutral proteinase from
Bacillus pnmilus as metalloenzyme. Acta Microbioloqica Polonica Ser. B. 6,
(23):21-25.
6 . Nguyễn Ngọc Châu, 1998. Nghiên cứu sử dụnc tuyên trùng trong phòng trừ sinh
học sâu hại cây trổng ơ Việt Nam. Tạp chí khoa học và công nghệ. XXXVI (3):
24- 29.
7. Fly ° c. Keene K. and Roman H.G., 1980. Insect pathogenic properties of
Serratia marcesccus: phaue-resistant mutants with a decreased resistance lo
Cccropid immunity and a decreased virulence to Drosophila. J. Gen. Microbiol
PHỤ LỤC
Copyright: Tài liệu đại học ©