BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

NGUYỄN HỮU QUÂN
NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH CỦA CHITINASE
TỰ NHIÊN VÀ BIỂU HIỆN CHITINASE TÁI TỔ HỢP
TỪ CHỦNG NẤM LECANICILLIUM LECANII
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, 2015
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận án là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS. Quyền Đình Thi, PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, sự
giúp đỡ của các cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ
Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các số liệu và kết
quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần kết quả đã được công bố trên
các tạp chí khoa học chuyên ngành dưới sự cho phép của các đồng tác giả, phần
còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ các công trình nào khác. Mọi trích dẫn
đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả luận án
Nguyễn Hữu Quân

ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Quyền Đình Thi đã định hướng
nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện hóa chất, thiết bị và hỗ trợ
kinh phí để tôi hoàn thành luận án này.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh
đã chỉ bảo, sửa luận án để tôi hoàn thành luận án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và đồng nghiệp Phòng Công nghệ
sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, hợp tác và chia sẻ kinh
nghiệm chuyên môn cho tôi trong quá trình tiến hành thực nghiệm đề tài.
Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ của đề tài “Nghiên cứu sản xuất và sử dụng chế
phẩm từ nấm Lecanicillium spp. để diệt rệp muội (Aphididae) gây hại cây trồng”

4. Những đóng góp mới của luận án 3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4
1.1. Nấm Lecanicillium lecanii
4
1.2. Chitinase
5
1.2.1. Nguồn gốc của chitinase 6
1.2.2. Phân loại chitinase 7
1.2.3. Cấu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase 9
1.2.4. Cơ chế phản ứng của chitinase 12
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase 14
1.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp chitinase 16
iv
1.3. Ứng dụng của nấm L. lecanii và chitinase 18
1.3.1. Trong lĩnh vực nông nghiệp và bảo vệ môi trường 18
1.3.2. Trong lĩnh vực y học 22
1.3.3. Trong lĩnh vực công nghệ sinh học 23
1.4. Một số nghiên cứu về gen và biểu hiện gen mã hóa chitinase
24
1.4.1. Trên thế giới 24
1.4.2. Ở Việt Nam 28
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31
2.1. Vật liệu và hóa chất
31
2.1.1. Chủng giống 31
2.1.2. Thiết bị 31
2.1.3. Hóa chất 31
2.1.4. Dung dịch và đệm 32


59
3.3. Nhân dòng gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H
66
3.4. Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của rChit trong
nấm men P. pastoris X33

70
3.4.1. Thiết kế plasmid pPChit biểu hiện gen Chit trong nấm men 70
3.4.2. Biểu hiện chitinase tái tổ hợp trong nấm men P. pastoris 71
3.4.3. Tinh sạch rChit 76
3.4.4. Đánh giá tính chất lý hóa của rChit từ nấm men P. pastoris X33 78
3.5. Thử nghiệm khả năng ức chế rệp và nấm bệnh của chitinase và
bào tử từ nấm L. lecanii

84
3.5.1. Ảnh hưởng của chitinase tới sự phát triển của nấm bệnh hại cây
trồng

84
3.5.2. Ảnh hưởng của rChit tới khả năng phát triển của rệp 86
vi
3.5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của sợi nấm 87
3.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nẩy mầm của bào tử nấm 88
3.5.5. Khả năng diệt rệp của chủng nấm L. lecanii 43H 89
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
92
1. KẾT LUẬN 92
2. KIẾN NGHỊ 92
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

kb Kilo base Kilo base
kDa Kilo Dalton Kilo Dalton
M Marker Thang chuẩn
OD Optical density Mật độ quang
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen
RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic
viii
RNase Ribonuclease Enzyme thủy phân RNA
RT-PCR Reverse transcription polymerase
chain reaction
Phản ứng khuếch đại gen
rChit Recombinante chitinase Chitinase tái tổ hợp
SDS-
PAGE
Sodium dodecyl sulfate
Polyacrylamide gel
electrophoresis
Điện di protein
Taq Thermus aquaticus Thermus aquaticus
TBE Tris boric acid EDTA Tris boric acid EDTA
TE Tris EDTA Tris EDTA
TEMED
N,N,N,N-
Tetramethylethylenediamine
N,N,N,N-
Tetramethylethylenediamine
v/v Volume/volume Thể tích/thể tích
w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích

ix

50
Hình 3.3. Trình tự đoạn gen 28S rRNA từ chủng nấm L. lecanii 43H;
Cây phân loại trình tự gen 28S rRNA từ chủng nấm L. lecanii 43H với
các loài khác 51
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ nuôi cấy đến khả
năng sinh tổng hợp chitinase

52
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ chitin huyền phù và nguồn nitơ đến
x
khả năng sinh tổng hợp chitinase 54
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và pH nuôi cấy lên khả năng
sinh tổng hợp chitinase

55
Hình 3.7. Hình ảnh điện di SDS-PAGE của chitinase tinh sạch từ chủng
nấm L. lecanii 43H và hoạt tính chitinase của các phân đoạn qua cột
DEAE-Sephadex A-50 trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất chitin huyền phù
0,5%
58
Hình 3.8. Nhiệt độ và pH thích hợp của chitinase 60
Hình 3.9. Độ bền nhiệt và độ bền pH của chitinase 61
Hình 3.10. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính
chitinase

Hình 3.23. Độ bền nhiệt và độ bền pH của rChit 80
Hình 3.24. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính
rChit

83
Hình 3.25. Ức chế sự phát triển của nấm bệnh F. oxysporum và R. solani
bởi chitinase

86
Hình 3.26. Sợi nấm của R. solani và F. oxysporum được xử lý với nước
và với chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H

86
Hình 3.27. Hỗn hợp chitin của rệp được xử lý với nước và rChit từ nấm
men P. pastoris X33

87
Hình 3.28. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỉ lệ nẩy mầm của
bào tử nấm L. lecanii 43H

89
Hình 3.29. Mô hình lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm và
biểu đồ thể hiện khả năng diệt rệp bằng bào tử của chủng nấm L. lecanii
43H 91
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, các biện pháp sinh học như sử dụng nấm kí sinh
hay các loài thiên địch trong việc phòng chống sâu hại cây trồng đang được quan
tâm nghiên cứu. Các chế phẩm sinh học từ nấm ra đời đã được sử dụng để diệt
trừ các loại sâu, nhện, bọ trĩ và bọ cánh phấn. Tuy nhiên, việc sử dụng biện pháp
vi nấm kí sinh đối với rệp là vấn đề đang còn mới mẻ trong nông nghiệp. Cùng
với sự phát triển kinh tế - xã hội, con người ngày càng có nhu cầu sử dụng các
sản phẩm rau quả sạch, hạn chế mức thấp nhất việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa
học dùng trong sản xuất rau, củ quả. Các loài thiên địch như nấm kí sinh côn
trùng gây hại cây trồng đã được sử dụng, do chúng có khả năng phát tán rất
nhanh và chỉ diệt các loài côn trùng có hại mà không ảnh hưởng tới nguồn nước,
môi trường sinh thái và sức khỏe con người, vật nuôi.
Nấm kí sinh côn trùng thường tác động đến những loại mô nhất định như
tuyến mỡ và các mô khác bị hòa tan là do các enzyme (chitinase, protease) của
nấm. Trong quá trình tác động lên côn trùng, nấm tiết ra các enzyme càng mạnh
thì tốc độ hủy hoại và tiêu diệt côn trùng gây bệnh càng nhanh, tiết kiệm được
thời gian. Dựa vào đặc tính này của nấm, việc tạo ra một lượng lớn enzyme đặc
biệt là chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học là rất cần thiết.
Chitinase là enzyme thuỷ phân chitin thành các đơn phân N-acetyl
glucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết
β-1,4-glucoside giữa C
1
và C

(4) Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chitinase, tinh sạch và nghiên cứu một số
tính chất lí hóa của chitinase tái tổ hợp.
(5) Nghiên cứu khả năng ức chế của chitinase đối với sự phát triển một số loài
nấm bệnh và rệp hại cây trồng.
3
4. Những đóng góp mới của luận án
4.1. Luận án đã tinh sạch, đánh giá một số tính chất lý hóa và chứng minh được
khả năng ức chế sự phát triển sợi nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia
solani của exochitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H. Bước đầu đánh giá được
khả năng diệt được rệp của bào tử nấm L. lecanii.
4.2. Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống từ phân lập, tách dòng, biểu
hiện gen chitinase và đánh giá khả năng diệt rệp hại cây trồng. Cụ thể là: (i) Gen
Chit từ chủng nấm L. lecanii 43H được phân lập, tách dòng thành công và xác
định được trình tự; đoạn gen Chit được đăng kí trong GenBank với mã số
JX665045. (ii) Biểu hiện thành công gen Chit mã hóa endochitinase thuộc họ
18 glycosyl hydrolase trong nấm men P. pastoris X33 cho hoạt tính cao. Tinh
sạch được chitinase tái tổ hợp và đánh giá được một số tính chất lý hóa cơ bản.
(iii) Chứng minh được rChit có khả năng làm suy giảm lớp vỏ chitin của rệp.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
5.1. Về khoa học
i) Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về phương pháp
tinh sạch chitinase, các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase và khả năng
diệt nấm bệnh của chitinase từ chủng nấm L. lecanii.
ii) Cung cấp những thông tin về gen mã hóa chitinase ở chủng nấm L. lecanii
43H, chitinase tái tổ hợp và các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính rChit và khả năng
thủy phân lớp vỏ rệp của rChit.
iii) Cung cấp thông tin về khả năng diệt rệp của bào tử và đặc điểm sinh học của
nấm L. lecanii.
5.2. Về thực tiễn
Những kết quả đánh giá toàn diện từ khâu lựa chọn điều kiện sinh tổng hợp

nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu
chỉ dừng lại ở từng khâu nghiên cứu riêng lẻ và hoạt tính chitinase sinh ra còn rất
thấp. Mặt khác, chủng nấm L. lecanii nói riêng và các vi sinh vật nói chung
thường hay xuất hiện các biến dị và quá trình sinh chitinase luôn thay đổi ở các
5
điều kiện môi trường, dẫn tới tính chất của chitinase sinh ra từ các chủng nấm là
khác nhau. Do vậy, quá trình nghiên cứu đầy đủ về chitinase từ bước lựa chọn
điều kiện môi trường thích hợp cho việc nâng cao khả năng tổng hợp chitinase
đến tinh sạch và xác định các điều kiện ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme; cũng
như việc nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii
trong nấm men để nâng cao khả năng biểu hiện, sau đó thử nghiệm hoạt tính của
chitinase và chế phẩm bào tử trong quá trình diệt rệp và nấm bệnh hại cây trồng
là hướng nghiên cứu cần thiết để nâng cao hiệu quả của chế phẩm sinh học.
1.2. Chitinase
Chitinase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng phân cắt liên kết
β-1,4-glycoside giữa C
1
và C
4
của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp
nhau trong phân tử chitin, chitobiose và chitotriose. Chitinase được chia thành 2
loại chính là endochitinase (EC 3.2.1.14) và exochitinase. Exochitinase gồm
chitobiosidase (EC 3.2.1.29) và N-acetyl glucosaminidase (EC 3.2.1.30). Mỗi
loại enzyme tham gia vào thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ sự
phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn
toàn tạo các đơn phân N-acetyl glucosamine.
Cơ chất thủy phân của chitinase thường là chitin. Chitin là một
polysacharide mạch thẳng không cuộn xoắn, có màu trắng, cứng và không đàn
hồi được tạo nên từ các đơn phân N-acetyl glucosamine thông qua liên kết
1,4-β glycoside. Chitin là chất hữu cơ đứng thứ 2 trong tự nhiên sau cellulose.

Streptomycetes [72], [144].
Chitinase được tạo ra từ vi sinh vật có vai trò phân giải chitin trong tự
nhiên. Thành tế bào của nấm sợi và nấm men được tạo nên từ các phân tử chitin
và các hợp chất khác (manan, glucan, cellulose). Tuy nhiên, cấu trúc chitin này
so với chitin trong tự nhiên có sự khác nhau về tính không tan, kích thước, độ
nhớt, độ phức tạp phân tử và tính không đồng nhất nên không bị thủy phân bởi
chitinase của cơ thể.
7
Ở thực vật, chitinase có mặt chủ yếu trong thân, củ, hạt và hoa của các loài
như khoai tây, thuốc lá, đậu, cà chua, ngô, khoai lang và đậu Hà Lan. Chitinase
được sinh ra trong giai đoạn phát triển sớm của cơ thể có vai trò tham gia vào
quá trình hình thành và phát triển phôi. Chitinase trong cây được sinh ra khi có
sự kích thích của mầm bệnh giúp cây chống lại sự tấn công của các nấm kí sinh
gây bệnh. Ở thực vật, chitinase chủ yếu thuộc loại endochitinase và có kích
thước nhỏ hơn so với các nhóm khác.
Bên cạnh đó, hệ chitinase có thể được thu nhận từ một số động vật nguyên
sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật
không xương như ruột khoang, giun tròn, chân đốt, thân mềm (ví dụ trong dịch
ruột của ốc sên Helix aspersa). Đối với động vật có xương sống, chitinase được
tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ,
trong dịch dạ dày của các loài chim, thú ăn sâu bọ [89], [90].
Ngoài ra, hệ chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong
suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm
thay vỏ, lột da. Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng cuticun của chúng trong
quá trình biến thái hay lột xác.
1.2.2. Phân loại chitinase
Theo danh pháp quốc tế, Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh
học phân tử quốc tế xếp chitinase vào phân lớp 3 (hydrolase, các enzyme xúc tác
phản ứng thủy phân), tổ 2 (glycosidase, thủy phân các liên kết glycoside), nhóm
1 (thủy phân liên kết O- và S-glycoside) (International Union of Biochemistry

acetyl hexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người.
Dựa vào trình tự amino acid đầu N, sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện,
peptide nhận biết và vùng cảm ứng, chitinase được phân chia thành 5 nhóm: là
nhóm I, II, III, IV và V. Nhóm I là những đồng phân enzyme trong phân tử có
đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc
prolin ở đầu cacboxyl (C) (peptide nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trò quan
9
trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt
động xúc tác. Nhóm II là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc
tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptide nhận biết ở đầu C, có trình tự
amino acid tương tự chitinase nhóm I. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, vi
khuẩn, chúng được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài. Nhóm III là trình tự
amino acid hoàn toàn khác với nhóm I và II. Nhóm IV là những đồng phân
enzyme chủ yếu có ở lá của cây 2 lá mầm, 41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc
tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein
nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I. Nhóm V
được nhận biết dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn
chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở
thực vật bậc cao [106].
1.2.3. Cấu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase
1.2.3.1. Cấu trúc bậc một và bậc hai của chitinase
Các chitinase được sinh ra từ các cơ thể khác nhau có thành phần cấu tạo và
cấu trúc khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trước hết ở sự đa dạng về khối
lượng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi
polypeptide. Ở vi khuẩn, chitinase từ B. cereus có khối lượng 37 kDa được mã
hóa bởi 360 amino acid [53], từ Streptomyces sp. M-20 có khối lượng 20 kDa
[72], từ Streptomyces griserus HUT 6039 có khối lượng 49 kDa [132].
Ở nấm, chitinase từ Trichoderma atroviride có khối lượng phân tử 33 kDa
mã hóa bởi 321 amino acid [88]. Chitinase từ Coccidioides immitis gồm 427
amino acid [135]. Chitinase từ Clonostachys rosea (Crch1) có khối lượng

Trong khi, chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp. A-471 thuộc họ glycosyl
hydrolase 19 được cấu tạo nên từ 6 chuỗi xoắn α là α1 (từ vị trí 111-123), α2 (từ
vị trí 129-141), α3 (từ vị trí 163-177), α4 (từ vị trí 186-204), α5 (từ vị trí 207-
216) và α6 (từ vị trí 234-247); và 1 xoắn 3
10
(từ vị trí 154-156). Vị trí thủy phân
(Glu141) được xác định ở điểm cuối của xoắn α2 và được che phủ với vòng lặp
dài nhất L-7 (từ vị trí 217-233), nơi nối giữa xoắn α5 và α6. L-7 được gắn bởi
mạng lưới liên kết hydro và tạo nên một khoang hình ống (Hình 1.2) [131].

Hình 1.2. Cấu trúc của chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp. A-471 [131]
1.2.3.3. Trung tâm hoạt động và vùng liên kết cơ chất
Trung tâm hoạt động của chitinase từ nấm L. lecanii chứa 9 gốc amino acid
(Phe-Asp-Gly-Ile-Asp-Trp-Glu). Vai trò liên kết cơ chất khi tham gia xúc tác
thủy phân chitin của chitinase được thực hiện nhờ các vùng liên kết đặc hiệu.
Các vùng liên kết đó có thể nằm trong trung tâm hoạt động của enzyme hoặc
không. Tùy thuộc vào từng loại enzyme mà vùng liên kết này có cấu tạo hóa học
và cấu trúc không gian khác nhau. Vùng liên kết với cơ chất của chitinase từ