1TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
MÃ SỐ: 304

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
VI KHUẨN LACTIC
CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN
TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN Sinh viên thực hiện

ĐẶNG THỊ THU THẢO
MSSV: 0753040084
LỚP: ĐH NTTS K2
Cần Thơ, 2011
2011

3

XÁC NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Luận văn kèm theo đây với tựa đề: “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có
khả năng kháng khuẩn từ các sản phẩm thủy sản lên men”.
Do sinh viên Đặng Thị Thu Thảo thực hiện và báo cáo đã được Hội đồng chấm
luận văn thông qua.
Phản biện Ủy viên
Cần Thơ, ngày 13 tháng 07 năm 2011
Chủ tịch hội đồng 4

5

TÓM TẮT
Vi khuẩn lactic có ý nghĩa rất quan trọng trong các quá trình lên men thực
phẩm. Chúng sinh ra nhiều chất để bảo vệ thực phẩm như: axít lactic, H
2
O
2
và
chất kháng khuẩn. Do đó, việc tìm ra những chất kháng khuẩn sinh ra từ vi
khuẩn lactic nhằm bổ sung cho những nghiên cứu về chất kháng khuẩn và ứng
dụng chất kháng khuẩn vào trong nuôi trồng thủy sản. Nghiên cứu sử dụng môi
trường MRS để phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic, sử dụng phương pháp
trực tiếp để kiểm tra sự kháng lại vi khuẩn Pediococcus pentosakeus. Kết quả
cho thấy có tổng số 83 dòng vi khuẩn lactic được phân lập từ 37 mẫu mắm và
nước mắm (thu ngẫu nhiên ở những chợ thuộc vùng nước ngọt và nước lợ mặn)
và có 19 dòng cho vòng kháng khuẩn đối với dòng chỉ thị. Độ dày vòng kháng
khuẩn từ 0,1 – 0,85 cm, trong đó có 9 dòng vi khuẩn lactic cho bề dày vòng
kháng khuẩn lớn nhất (hơn 0,6 cm), 1 dòng cho bề dày vòng kháng khuẩn
0,1 cm là nhỏ nhất. Như vậy, có thể sử dụng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên
men thủy sản để kháng lại vi khuẩn Pediococcus pentosakeus.
Từ khóa: Vi khuẩn lactic, Chất kháng khuẩn, Phương pháp trực tiếp,
Pediococcus pentosakeus.

6

MỤC LỤC

3.4 Phân tích và xử lý số liệu 20
3.4.1 Phân tích VKL 20
3.4.2 Phân tích khả năng kháng khuẩn 20
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 21
4.1 Phân lập một số dòng VKL từ các sản phẩm thủy sản lên men 21
4.1.1 Thu mẫu 21
4.1.2 Tăng sinh mẫu lần 1 21
4.1.3 C
ấy ria trên đĩa pêtri 23
7

4.1.4 Thử catalase và nhuộm Gram 25
4.1.5 Tăng sinh mẫu lần 2 26
4.1.6 Lưu trữ mẫu 26
4.2 Kiểm tra khả năng sinh CKK từ các dòng VKL thu được 26
4.2.1 Tối ưu hóa quy trình 26
4.2.2 Thử khả năng sinh CKK từ các dòng VKL thu được 27
CHƯƠNG 5: KẾT QUẢ ĐỀ XUẤT 31
5.1 Kết quả 31
5.2 Đề xuất 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO 32
PHỤ LỤC A A
PHỤ LỤC B B
PHỤ LỤC C C
PHỤ LỤC D D1
PHỤ LỤC E E
PHỤ LỤC F F1
PHỤ LỤC G G
Bảng 4.5: Kết quả thử với Pediococcus pentosakeus 30
Bảng A1: Thành phần môi trường MRS_broth A
Bảng A2: Thành phần môi trường MRS_agar A
Bảng D1: Bảng mã mẫu D1
Bảng D2: Kết quả thử khả năng sinh CKK của VKL phân lập được D3
Bảng F1: Quan sát khuẩn lạc F1

9

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1: Quy trình sản xuất mắm cá 3
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
VKL: Vi khuẩn lactic
CKK: Chất kháng khuẩn

10

CHƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Ở nước ta, nuôi trồng thủy sản ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh
tế. Trong những năm gần đây, nhằm nâng cao năng suất thủy sản phục vụ nhu
cầu xuất khẩu nên mức độ nuôi thâm canh hóa ngày càng cao. Bệnh trên tôm, cá
và các loài thủy đặc sản khác cũng xuất hiện ngày càng nhiều. Bệnh đã gây
nhiều tổn thất cho nghề nuôi thủy sản. Sản phẩm làm ra không được tiêu thụ
hoặc chất lượng sản phẩm giảm, không đảm bảo cho tiêu dùng và xuất khẩu.
Do đó, công tác phòng trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản đang đòi hỏi cấp bách.
(Bùi Quang Tề, 2008). Tuy nhiên, nhiều sản phẩm thuốc thủy sản hiện nay đã
dần mất tác dụng với các loại mầm bệnh quen thuộc do việc sử dụng thuốc quá
mức và không đảm bảo liều lượng theo yêu cầu dẫn đến tình trạng kháng thuốc
của các loại mầm bệnh ngày một gia tăng. Việc sử dụng các dòng vi khuẩn có
lợi để ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh hiện đang được chú trọng, đặc biệt
là nhóm vi khuẩn lactic (VKL).
VKL là tên gọi của nhóm vi khuẩn sinh ra axit lactic như là sản phẩm chính
trong quá trình chuyển hoá chất bột đường và chúng được xếp vào họ
Lactobacteriaceae (Lê Văn Nhương và csv., 2009). VKL có ứng dụng rộng rãi


12

CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Một số quy trình lên men thủy sản
Mắm là sản phẩm đặc trưng của các tỉnh Nam Bộ, tùy vào điều kiện tự nhiên
đặc trưng của mỗi vùng mà các sản phẩm mắm cũng đa dạng không kém. Ở các
tỉnh đầu nguồn như An Giang, Đồng Tháp nổi tiếng với các sản phẩm mắm cá
nước ngọt như mắm cá Lóc, mắm cá Trèn, mắm cá Rô…. Có nhiều cơ sở mắm
đã đăng kí bảng quyền thương hiệu và được xuất khẩu như Mắm bà giáo Khỏe,
Mắm cô Tư Ấu. Về các tỉnh ven biển Bạc Liêu, Cà Mau cũng vang danh với các

(
1 kg mu
ối cho 5 kg cá
)

Chao mắm với cơm rượu trộn
chung với đường chảy nấu lỏng
Cho vào mái đầm đậy kín
(1 tháng)
Cho vào mái đầm đậy kín
(
2 tháng
)

Mắm thành phẩm
Cho vào mái đầm đậy kín
(
2 tháng
)

13

Quy trình làm mắm tép


Phơi nắng 2 ngày
14

Quy trình làm mắm tôm

Hình 2.3: Quy trình sản xuất mắm tôm
(Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009)
Các công đoạn làm mắm ruốc
Hình 2.4: Quy trình sản xuất mắm ruốc
(Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009)

Ruốc tươi đem xào sơ với một

Hình 2.5: Quy trình sản xuất nước mắm
(Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009) Cá
Lựa chọn
Xử lý
Trộn muối
Lên men
Làm nguội
Chiết rút
Nước mắm
thành phẩm
Bã
Phụ gia

sản phẩm từ sữa (Sharp, 1981 được trích dẫn bởi Einar Ringø et al., 1997), các
sản phẩm thủy sản (Mauguin và Novel, 1994 được trích dẫn bởi Einar Ringo et
al., 1997), và trên một số bề mặt hệ thực vật (Keddie, 1959 được trích dẫn bởi
Einar Ringø et al., 1997). Chúng thường được dùng trong sản xuất và bảo tồn
các sản phẩm thực phẩm như pho mát, thịt, sữa chua (McKay và Baldwin, 1990
được trích dẫn bởi Einar Ringo et al., 1997). Một vài VKL được tìm thấy trong
các sản phẩm thủy sản lên men của Hàn Quốc (Lee, 1993 được trích dẫn bởi
Gyu Sung Cho và Hyung Ki Do, 2006). Ngoài đặc tính lên men axit lactic, VKL
còn giúp chuyển hoá thức ăn trong cơ thể, hạn chế sự phát triển của vi sinh vật
gây bệnh (tạo ra axit formic, axit bezoic, H
2
O
2
, chất kháng khuẩn ), giúp phòng
một số bệnh (cao huyết áp) (Lê Văn Nhương và csv, 2009).
2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn lên men lactic
Vi khuẩn lên men axit lactic có hai dạng hình chính là hình cầu và hình que.
Tuy nhiên, khi nuôi cấy trong điều kiện môi trường hay các điều kiện ngoại
cảnh khác nhau thì có hình dạng khác nhau nhưng chúng đều có một số đặc
điểm sau: chúng là những vi khuẩn Gram dương, không có khả năng sinh bào
tử, catalase âm tính, oxydase âm tính, khử natri âm tính và hầu hết đều không
chuyển động, chúng không có khả năng tổng hợp nhân hem của các
polyphyrine, chúng không có chứa xitocrom. Chúng có thể sinh trưởng được khi
17

có mặt oxy, là loại cơ thể duy nhất có khả năng lên men hiếu khí cũng như yếm
khí (Lê Văn Nhương và csv , 2009).
Theo hình dáng tế bào và cách sắp xếp tế bào trong môi trường người ta thường
chia VKL thành 4 giống (4 chi): Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và
Leuconotoc. Các chủng thuộc 4 chi này có thể lên men đồng hình hay dị hình.

lượng. Sau khi kết thúc quá trình giữ lạnh ở nhiệt độ khác nhau, VKL qua quá
trình kiểm tra có từ 10
6
– 10
8
CFU/g (Schulze, 1985 được trích dẫn bởi Zorn
et al., 1993). Trong nghiên cứu của Zorn et al. (1993) mật số vi khuẩn
18

Carnobacteria vượt trội trong sản phẩm cá Hồi đóng gói hút chân không được
bảo quản ở nhiệt độ 8
o
C và 20
o
C. Một số nghiên cứu trước kia trên sản phẩm
cá được hút chân không giữ lạnh. Sau khi kết thúc giai đoạn giữ lạnh sự biến đổi
của hệ sinh vật tỷ lệ với vi khuẩn lactic, Enterobacteriaceae và một số vi khuẩn
khác đã được quan sát thấy trong sản phẩm được lưu trữ ở nhiệt độ ướp lạnh.
Mật số VKL từ 10
6
– 10
8
CFU/g (Joffraud et al., 2001 được trích dẫn bởi Ulrike
Lyhs, 2002). Trong một vài trường hợp, số lượng vi khuẩn lactic 10
6
– 10
7CFU/g cùng với mật số vi khuẩn Gram âm từ 10 19

Hiện nay, CKK được chia thành 4 nhóm
Nhóm I: là nhóm lantibiotic, là loại polypeptit có khối lượng phân tử nhỏ
(< 5 KDa), chứa amino acid lanthionine, β – methyllanthionine.
Nhóm II: gồm các CKK không phải là lantibiotic, khối lượng phân tử nhỏ
(< 10 KDa). Cấu trúc gấp nếp β, bền nhiệt, có thể chịu được nhiệt độ khoảng
100 – 121
o
C.
Nhóm III: các CKK có khối lượng phân tử lớn (>30 KDa), khả năng bền nhiệt
cao.
Nhóm IV: Đây là nhóm CKK phức tạp. Trong cấu trúc phân tử ngoài protein,
chúng còn chứa các thành phần khác là lipid, carbohydrat. Tiêu biểu của nhóm
này là: plataricin S, leconocin S, lactocin 27 và pediocin SJ – 1.
Trong đó, nhóm I và II được nghiên cứu nhiều nhất và chúng cũng đa dạng
nhất.
Bảng 2.1: Các đặc tính CKK của VKL
Chất kháng
khuẩn
Tên
vi khuẩn
sản xuất
Phổ ức chế pH
hoạt
động


2901 α
chymotr
ypsin,
ficin,
proteina
se K
Lactocein S Lactobacillus
sake 145
Staphycoccus
carnosus
Carnobacteria,
lactobacilli
Pediococcus,
lactococci
<5,5 3778 Trysin,
protease
loại XIV 20

2. Nhóm II
Lactococcin
A
Lactococcus lactic
subsp cremoris
LMG 2130
Lactococci 5778 Trypsin,
endo –

pepsin,
proteina
se K,
α
chymotr
ypsin
Curvacin A Lactobacillus
curvatus LTH
1174
Lactobacilli,
Carnobacteria
5000 proteina
se K,
trypsin
3.Nhóm III
Helveticin J Lactobacillus
Helveticus 481
Lactobacilli 37511 Trypsin,
pepsin,
pronase,
proteina
se K
Caseicin 80 Lactobacillus 109 Lactobacillusca
sei 109
3 – 9 4000 α
chymotr
ypsin,
trypsin,
pepsin,
proteinas

Hình 2.6: Pediococcus
Pediococcus có hoạt tính thủy phân protein rất yếu, Gram dương, quá trình trao
đổi chất của nó là quá trình lên men đồng hình. Chúng là những vi khuẩn yếm
khí tùy tiện, có thể phát triển trên môi trường rắn với sự có mặt của không khí.
Chủng này yêu cầu rất cao về thành phần dinh dưỡng từ môi trường. Vì chúng
22

không có khả năng sinh tổng hợp các chất cần thiết cho sự phát triển của cơ thể.
Các loài Pediococcus khác nhau về tính chịu nhiệt, chịu axit và chịu NaCl.
2.6 Những nghiên cứu trong và ngoài nước
2.6.1 Những nghiên cứu trong nước
Hiện nay, ở nước ta việc nghiên cứu về CKK do VKL sinh tổng hợp nên đã và
đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Tuy nhiên, các nghiên cứu về ứng
dụng của CKK còn ít và chưa thu được những kết quả khả quan. Một số nghiên
cứu tiêu biểu về VKL và CKK
• Tuyển chọn định hướng VKL sinh CKK từ một số thực phẩm giàu
protein lên men lactic ở Việt Nam (Mai Thị Hằng và csv, 2000).
• Phân lập và tuyển chọn một số chủng VKL sinh chất diệt khuẩn sinh học
CKK (Nguyễn Thị Hương Trà và csv, 2001).
• Tối ưu hoá quá trình lên men Entecocin của chủng vi khuẩn enterococus
sp. Tn43 phân lập từ nem chua. Phần I-Nghiên cứu ảnh hưởng của một
số yếu tố tới khả năng sinh bacteriocin của chủng VKL Enterococus sp.
Tn43. 34 (Lê Thanh Mai và csv, 2001).
• Nghiên cứu công nghệ sản xuất CKK từ chủng VKL ST20 (Nguyễn Thị
Hương Trà và csv, 2002).
• Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp CKK của loài Lactobacillus
plantarum L24. (Nguyễn Thị Hoài Hà và csv, 2005). Trung tâm Công

của vi khuẩn gram dương và cho ra nhiều kết quả có giá trị. Nghiên cứu
đã cho biết được tính đối kháng của CKK, cách đặt tên và phân loại
CKK, chiết tách và tinh sạch CKK, phân tích hoạt tính CKK, các loại
hoạt động của CKK và ứng dụng của CKK.
• Năm 1992 tại Laramie, Yang et al., đã nghiên cứu một phương pháp mới
để chiết tách một lượng lớn CKK từ VKL. Phương pháp này dùng môi
trường pediocin AcH, nisin, sakacin A, leuconocin Lcm1 làm tăng hiệu
quả chiết tách và thu được một lượng CKK nhiều hơn quá trình phân lập.
• Năm 1999 tại Bỉ, Raf Callewaert và Luc De Vuyst đã nghiên cứu việc
sinh tổng hợp CKK của Lactobacillus amylovorus DCE 471 và có ứng
dụng cải tiến và làm ổn định các sản phẩm lên men. Việc sinh tổng hợp
thu nhận CKK bị ức chế bởi nồng độ của nguồn nitrogen.
• Năm 1999 tại Pakistan, Khalid et al., đã nghiên cứu tìm ra một loại CKK
mới có tên lactocin LC-09. Lactocin LC-09 được phân lập từ chủng vi
khuẩn lactobacillus có trong một mẫu bệnh.
• Năm 2002 Soore và ctv đã nghiên cứu việc tạo ra một chất kháng đặc
biệt của VKL gọi là CKK. CKK được sử dụng như một chất bảo quản
thực phẩm tự nhiên có khả năng thay thế các loại hoá chất bảo quản
khác. CKK có bản chất là protein nên rất an toàn đối với sức khoẻ con
người.
24

• Năm 2002 tại Thái Lan, Pongtep Wilaipun et al. đã tìm thấy khă năng
sinh CKK của Enterococcus faecium được phân lập từ các sản phẩm thủy
sản lên men của Thái.
• Năm 2004, Todorov, S.D., Van Reenen, C.A. và Dicks K.M. (Nam Phi)
đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp CKK của chủng Lactobacillus
plantarum ST13BR , một chủng được phân lập từ bia Barley.
• Năm 2006, 50 chủng VKL được tìm thấy từ sản phẩm lên men truyền
thống suan-tsai của Đài Loan. Với các chủng sau khi phân lập tiếp tục

3.1.2 Thời gian thực hiện
Từ tháng 3 năm 2011 đến tháng 5 năm 2011.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
Dụng cụ thí nghiệm cố định
 Tủ cấy vi sinh CEMACO.
 Tủ ấm vi sinh Memmert.
 Tủ lạnh SanYo.
 Tủ sấy Memmert.
 Nồi Autolave STURDY – SA 300 VF.
 Máy khuấy từ Yellowline.
 Cân 2 số lẻ Sartorius.
 Tủ hút.
Dụng cụ thí nghiệm không cố định
 Máy Vortex.
 Ống nghiệm có nắp, giá để ống nghiệm.
 Đĩa petri, cốc 100 ml.
 Micropipet BIOHIT 20 – 200 µl , 100 – 1.000 µl , 1.000 – 5.000 µl;
 Đầu típ 200 µl, 1.000 µl, 5.000 µl.
 Đèn cồn, hột quẹt.
 Đũa tán thủy tinh đầu tam giác, que cấy đầu nhọn, que cấy đầu tròn.
 Cây nhíp, dao mổ nhỏ, kéo.
 Bao hấp, giấy bạc gói, thun, parafilm, bọc, băng keo giấy, bông gòn, giấy
thấm.
 Khay nhựa, hộp nhựa nhỏ, thao nhựa, bình tia.
 Ống falcon 2 ml, ống effendoft 1,5 ml.
 Chai thủy tinh nấu môi trường 500 ml, cá từ.
 Găng tay, khẩu trang.