Di truyền học và ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số 6 – 2010 J. Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology
Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi
1
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC DÙNG TRONG CHẾ
BIẾN VÀ BẢO QUẢN THỨC ĂN THÔ XANH VÀ PHỤ PHẨM NÔNG
NGHIỆP CHO GIA SÚC NHAI LẠI

Đào Thị Lƣơng, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên,
Dƣơng Văn Hợp
Viện Vi sinh vật và CNSH-Đại học Quốc Gia Hà Nội
Trần Quốc Việt, Ninh Thị Len, Bùi Thị Thu Huyền
Viện Chăn nuôi

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bảo quản thức ăn cho gia súc ở quy mô
lớn là vấn đề đang được các nhà chăn nuôi
quan tâm. Nó giúp thức ăn cho động vật
không bị hỏng và giữ được dinh dưỡng
trong thời gian dài. Bảo quản thức ăn cho
gia súc bằng phương pháp ủ chua có bổ sung
vi khuẩn lactic dựa vào khả năng ức chế các
vi khuẩn gây thối, gây bệnh của axit lactic
và kháng sinh bacterioxin do chúng sinh ra
là một phương pháp bảo quản được nhiều
quốc gia trên thế giới ứng dụng.
Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có
hoạt tính sinh học cao nhằm ứng dụng trong
bảo quản thức ăn gia súc, giúp cho quá trình

4
.7H
2
O- 0,58;
Cao nấm men-5,0; MnSO
4
.4H
2
O- 0,28;
Tween 80- 1 ml; Thạch- 15,0; Nước cất vừa
đủ- 1lít; pH= 6,0; khử trùng 121
o
C/15 phút.
- Môi trường MRS dịch thể (g/l): Có thành
phần như trên ngoại trừ thạch và CaCO
3
.
- Môi trường canh thang nuôi vi sinh vật
kiểm định(g/l): Cao thịt - 3,0; Pepton- 5,0;
NaCl- 1,0; Thạch-15,0; Nước cất vừa đủ-1
lít; pH 7,0; khử trùng 121
o
C/15 phút.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phương pháp định tính và định
lượng
- Định lượng axit theo Therner (Emanuel và
cộng sự, 2005)
- Xác định hàm lượng axit lactic bằng sắc ký
lỏng cao áp (Bevilacqua và Califano, 1989)

sự, 1997. Các trình tự được so sánh với trình
tự ADNr 16S của các loài đã công bố từ dữ
liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. Cây phát
sinh được xây dựng theo Kimura (1980), sử
dụng phương pháp của Saitou và Nei
(1987); phân tích Bootstrap (Felsenstein,
1985) được thực hiện từ 1000 lần lặp lại
ngẫu nhiên.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi
khuẩn lactic lên men đồng hình
3.1.1. Phân lập vi khuẩn sinh axit
Từ 30 nguồn cỏ, ngô, nước dưa cà,
nước bún, 134 chủng vi khuẩn đã được phân
lập và tinh sạch trên môi trường MRS, sau 2
ngày ở nhiệt độ 30
o
C.
3.1.2. Tuyển chọn các vi khuẩn lactic
- Xác định khả năng sinh axit lên men đồng
hình của các vi khuẩn phân lập
Các chủng phân lập được nuôi trên môi
trường MRS dịch thể có đặt ống Durham.
Sau 3 ngày nuôi cấy, trong số 134 chủng
phân lập có 131 chủng không sinh khí trong
ống Durham là lên men đồng hình.
- Xác định khả năng chịu nhiệt của các vi
khuẩn sinh axit
Các chủng vi khuẩn sử dụng làm giống
khởi động phải có khả năng sinh trưởng

dài trong khoảng từ 15,3 đến 21 mg/ml dịch
nuôi. Khả năng kháng các vi sinh vật kiểm
định của dịch nuôi vi khuẩn cũng rất mạnh.
Kích thước vòng kháng (D-d) của dịch nuôi
các chủng đối với E. coli từ 20-30 mm, M.
luteus từ 14-20 mm, Salmonella typhi từ 20-
34 mm và Shigella flexneri 10-34 mm.
Khả năng sinh bacterioxin của dịch nuôi
các chủng nghiên cứu cũng được xác định.
Dịch nuôi được trung hòa về pH-6 và được
kiểm tra khả năng kháng với vi khuẩn kiểm
định. Kết quả chỉ rõ cả 18 chủng đều có khả
năng sinh bacterioxin kháng lại các vi khuẩn
kiểm định. Kích thước vòng kháng (D-d) đối
với E. coli từ 8-12 mm, M. luteus từ 2-6
mm, Salmonella typhi từ 3-6 mm và Shigella
flexneri 10-12 mm.
Từ các kết quả trên, 8 chủng vi khuẩn
(2-9; 2-10; 3-5; 3-10; 4-4, 8-10; 9-17 và
L10) có hoạt tính cao và là các chủng đại
diện cho các mẫu khác nhau sẽ được kiểm
tra một số đặc tính sinh học và tiến hành
phân loại.
- Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các
chủng lựa chọn
Tám chủng lựa chọn được nuôi trên môi
trường MRS trong 3 ngày ở nhiệt độ 37
o
C,
hoạt tính enzyme ngoại bào của dịch nuôi

sinh enzyme ngoại bào phân giải các cơ chất
có trong thành phần ủ thức ăn chăn nuôi.
- Xác định khả năng đối kháng giữa các
chủng lựa chọn
Tám chủng nghiên cứu được nuôi trên
môi trường MRS bằng phương pháp cấy
vạch tiếp xúc giữa các chủng với nhau. Sau
3 ngày, ở nhiệt độ 37
o
C, ở tất cả các mẫu
đều sinh trưởng tốt. Kết quả này cho thấy 8
chủng không đối kháng nhau và hoàn toàn
có thể được sử dụng kết hợp với nhau trong
quá trình lên men chế biến thức ăn gia súc.
3.2. Phân loại các chủng đƣợc tuyển chọn
3.2.1. Xác định trình tự 16S ADNr và xây
dựng cây phân loại
ADN hệ gen của 8 chủng nghiên cứu
được tách chiết. Đoạn gen mã cho ARNr
16S được khuếch đại nhờ phản ứng PCR sử
dụng cặp mồi phổ biến 27F và 1525R, sau
đó được tinh sạch và dùng làm khuôn trong
phản ứng đọc trình tự với các mồi xuôi và
mồi ngược. Kết quả đọc trình tự được xử lý
bằng phần mềm Clustal X và so sánh với dữ
liệu của DDBJ, EMBL, GenBank bằng công
cụ Blast Search để xác định đến tên loài.
Trình tự ADNr 16S của 8 chủng nghiên
cứu được xác định. Cây phả hệ được xây
dựng dựa trên trình tự ADNr 16S từ 1400 bp

Qua nghiên cứu các đặc điểm hình thái,
sinh lý và sinh hoá của 8 chủng vi khuẩn
cho thấy tất cả 08 chủng này đều thuộc
nhóm vi khuẩn Gram dương, phản ứng
catalaza âm tính, không có khả năng di
động, lên men đồng hình, có khả năng đông
tụ sữa, sinh trưởng ở pH 4-8,5; nhiệt độ 20-
40
o
C và nồng độ muối 0-8%. Hình thái tế
bào có 2 dạng: hình que (chủng 2-9, 2-10, 3-
5, 3-10, 4-14, 8-4 và 9-17) và hình cầu
(chủng L01). Các chủng có khả năng lên
men và tạo axit từ các nguồn cacbon:
glucose, L-arabinose, D-fructose, galactose
(trừ chủng 4-14), D-lactose (trừ chủng 8-
10), maltose, D-mannitol, D-raffinose (trừ
chủng 4-14), D-ribose, sucrose, D-sorbitol,
và trehalose (trừ chủng 4-14 và 8-10). Sáu
trong số các chủng nghiên cứu không lên
men từ các nguồn glycerol và D-xylose (trừ
chủng 2-9 và L01).
Chưa thể kết luận được 7 chủng nghiên
cứu có tế bào hình que thuộc chính xác loài
nào nếu chỉ dựa trên trình tự gen 16S rRNA
vì chúng có độ tương đồng là 99.7% -100%
so với các loài thuộc nhóm Lactobacillus
plantarum. Tuy nhiên, theo một số nghiên
cứu trước đây, L. pentosus thường lên men
glycerol và xylose trong khi L. plantarum và

72
66
72
62
100
53
Enterococcus lactis_DQ255948
L01
Enterococcus faecium_AJ301830
86
Enterococcus durans_AJ276354
Enterococcus hirae_Y17302
94
64
Enterococcus mundtii_AF061013
82
Enterococcus pseudoavium_ AF061002
98
Enterococcus gallinarum_ AF039900
Enterococcus faecalis_AB012212
54
56
52
100
55
0.02
Di truyền học và ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số 6 – 2010 J. Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mƣợn,
Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch,
Phạm Văn Ty (1976), Một số phương
pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 2,
Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.
Bevilacqua A.E., Califano A.N. (1989).
Determination of organic acids in dairy
products by high performance liquid
chromatography. J. Food Sci. 54: 1076-
1079 (1989).
Bringel, F., Curk, M. C. & Hubert, J. C.
(1996). Characterization of lactobacilli by
Southern-type hybridization with a
Lactobacillus plantarum pyrDFE probe.
Int J Syst Bacteriol 46: 588–594.
Curk M.C., Hubert J.C. & Bringel F.
(1996). Lactobacillus paraplantarum sp.
nov., a new species related to
Lactobacillus plantarum. Int J Syst
Bacteriol 46: 595–598.
Emanuel, V., Adrian, V., Ovidiu, P.,
Gheorghe, C. (2005). Isolation of a
Lactobacillus plantarum strain used for
obtaining a product for the preservation of
fodders. African Journal of Biotechnology
4(5): 403-408.
Felsenstein J. (1985). Confidence limits on
phylogenies: an approach using the
bootstrap. Evolution 39: 783-791