trờng đạI học nông nghiệp hà nội
Khoa Công nghệ sinh học
***
Khoá luận tốt nghiệp
đề tài:
Lai chuyn gen v chn lc gen khỏng bnh bc lỏ
hu hiu xa-5, Xa-7, Xa-21 vo mt s ging lỳa tt
bng ch th phõn t DNA
Ngời hớng dẫn : 1. pgs.ts. phan hữu tôn
2. KS. Tống văn hải
Bộ môn: Công nghệ sinh học ứng dụng
Khoa Công nghệ sinh học - Trờng ĐHNN
Ngời thực hiện : NGUYễN THị HIÊN
Lớp : CNSH K3 hồng đức
hà nội - 2009
Lời cảm ơn!
Trong quá trình học tập và thực hiện đề tài tốt nghiệp, ngoài sự nỗ
lực và cố gắng của bản thân, tôi đã nhận đợc sự giúp đỡ quý báu của rất
nhiều thầy cô, gia đình cùng bạn bè.
Trớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phan Hữu
Tôn, thầy đã trực tiêp hớng dẫn, nhiệt tình chỉ bảo và truyền đạt cho tôi
những phơng pháp, bài học quý báu trong công việc cũng nh trong cuộc sống.
Tôi xin chân thành cảm ơn K.S Tống Văn Hải, ngời đã trực tiếp hớng
dẫn, dìu dắt tôi trong thời gian thực tập tại trờng.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo cung cấp cho tôi những
kiến thức bổ ích trong quá trình thực tập.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những ngời thân
trong gia đình cùng bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học
tập và thực hiện đề tài.
Hà Nội, ngày 10 tháng 8 năm 2009
Sinh viên

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
3.1. V t li u, a i m, th i gian nghiên c uậ ệ đị đ ể ờ ứ 26
3.1.1. V t li u nghiên c uậ ệ ứ 26
3.1.2. a i m, th i gian nghiên c uĐị đ ể ờ ứ 26
3.2. N i dung nghiên c uộ ứ 26
3.3. Ph ng pháp nghiên c uươ ứ 27
3.3.1. Thí nghi m ngo i ng ru ng kh o sát t p o nệ à đồ ộ ả ậ đ à 27
3.3.2. Thí nghi m trong phòng.ệ 31
PHẦN 4.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
4.1. c i m nông sinh h c c a các gi ngĐặ đ ể ọ ủ ố 36
ii
4.1.1. Th i gian qua các giai o n sinh tr ngờ đ ạ ưở 36
4.1.2. M t s c i m nông sinh h c c a các gi ng b , m s d ng ộ ố đặ đ ể ọ ủ ố ố ẹ ử ụ
lai Backcrossđể 40
4.1.3. N ng su t v các y u t c u th nh n ng su tă ấ à ế ố ấ à ă ấ 41
4.2. Ph n ng c a các gi ng b , m v các t h p lai F1 v i ch ng vi ả ứ ủ ố ố ẹ à ổ ợ ớ ủ
khu n gây b nh b c láẩ ệ ạ 44
4.3. K t qu ti n h nh ph n ng PCRế ả ế à ả ứ 47
PHẦN 5.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52
5.1. K t lu nế ậ 52
5.2. nghĐề ị 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54
iii
DANH MỤC BẢNG
B ng 1: Kí hi u các t h p lai F1 dùng l m cây m lai l i ả ệ ổ ợ à ẹ để ạ
v i gi ng c n chuy n genớ ố ầ ể 26
B ng 2: Th i gian qua các giai o n sinh tr ng c a các gi ng ả ờ đ ạ ưở ủ ố
b , m s d ng lai Backross.ố ẹ ử ụ 37

gây ra.
Đối với bệnh bạc lá, hiện nay chưa có loại thuốc hóa học nào đặc trị
bệnh này, mặt khác sử dụng nhiều thuốc hóa học còn gây ô nhiễm môi trường,
mất cân bằng sinh thái. Biện pháp phòng trừ chủ yếu là biện pháp canh tác
nhưng biện pháp này không có khả năng dập tắt dịch nhanh chóng. Do vậy,
việc tạo ra các giống lúa có khả năng kháng bệnh bền vững được xem là hiệu
quả nhất. Giống lúa có khả năng kháng bệnh bền vững là giống có nhiều gen
kháng khác nhau. Do mỗi gen kháng chỉ kháng được một hay một số chủng vi
khuẩn nhất định, trong khi đó mỗi vùng trồng lúa lại tồn tại nhiều chủng vi
khuẩn khác nhau nên nếu giống chỉ chứa một gen kháng thì sau một thời gian
ngắn sẽ bị nhiễm bệnh. Vì vậy cần phải quy tụ nhiều gen kháng vào một giống
để giống đó có khả năng kháng được nhiều chủng vi khuẩn khác nhau.
Người ta đã phát hiện được 29 gen kháng bệnh ký hiệu từ Xa-1 đến Xa-
29 (K.S Lee và CS, 2003) gồm 22 gen trội và 7 gen lặn. Theo kết quả nghiên
cứu của Phan Hữu Tôn thì các gen Xa-4, xa-5, Xa-7, Xa-21 kháng được hầu
hết các chủng vi khuẩn ở miền Bắc Việt Nam. Để đưa gen kháng bệnh bạc lá
1
hữu hiệu vào một giống, theo phương pháp truyền thống người ta lai
Backcross, sau đó chọn cây có gen kháng lai lại với giống bố tốt. Bằng lây
nhiễm nhân tạo người ta phát hiện sự có mặt của gen kháng. Tuy nhiên,
phương pháp này tốn nhiều thời gian và công sức, thậm chí không chính xác
do tác động của môi trường. Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ sinh
học đặc biệt là sinh học phân tử các nhà chọn giống đã kết hợp lai hữu tính
với sử dụng chỉ thị phân tử DNA để chọn lọc gen kháng. Áp dụng chỉ thị
phân tử DNA có thể phát hiện sự hiện diện của gen kháng thông qua đoạn
DNA dò đặc hiệu liên kết với gen đó với khoảng cách liên kết nhất định. Hiện
nay, đã xác định được vị trí của một số gen kháng quan trọng như: gen Xa-4
liên kết với REPL ở Locus Npb181 và Npb76 trên NST số 11, với khoảng
cách di truyền là 1.7cM (Yoshida et al, 1992). Gen xa-5 liên kết với chỉ thị
phân tử RZ390, RG556, RG207 trên NST số 5, với khoảng cách di truyền 0-

- Tiến hành phản ứng PCR để chọn lọc gen kháng bệnh bạc lá hữu hiệu
xa-5, Xa-7, Xa-21.
3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về bệnh bạc lá lúa
2.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh bạc lá lúa
2.1.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh bạc lá lúa trên thế giới
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae gây ra là
một trong những bệnh hại nghiêm trọng đối với các vùng thâm canh lúa trên
thế giới, đặc biệt là ở các nước Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Việt Nam…Vì
vậy, việc nghiên cứu nguyên nhân, biện pháp phòng trừ bệnh được các nhà
khoa học đặc biệt quan tâm.
Bệnh bạc lá lúa được phát hiện lần đầu tiên trên cánh đồng lúa Fukuora
(Nhật Bản) vào năm 1884-1885. Ban đầu, các nhà khoa học Nhật Bản nhầm
tưởng rằng đó là bệnh sinh lý do đất chua gây ra. Năm 1908, Takaishi đã tìm
thấy vi khuẩn trong giọt dịch và lây lại được. Dựa trên kết quả phân lập năm
1991, Bokura đã kết luận triệu chứng bệnh bạc lá do vi khuẩn gây nên chứ
không phải do sinh lý[2]. Từ năm 1950-1970, bệnh bạc lá lúa phát triển mạnh
ở Nhật Bản trừ miền Bắc đảo Hokaido (Tagami và Miukami, 1960;
Srivartawa, 1972)[5].
Ở Ấn Độ, bệnh bạc lá lúa được phát hiện năm 1940 (Raina và CS,
1981), với tên địa phương là Dansukh (có nghĩa là trắng hay khô lá)[5]. Đến
năm 1965, người ta mới xác định được đúng nguyên nhân gây bệnh là do vi
khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae gây ra.
Ở Philippine, Raiking đã miêu tả triệu chứng bệnh bạc lá do vi khuẩn
gây nên nhưng lại nhầm với bệnh đốm sọc do vi khuẩn Xanthomonas
oryzicola. Mãi đến năm 1957, hai bệnh này mới được phân biệt rõ rệt.
Bệnh bạc lá lúa cũng được phát hiện ở Indonexia vào năm 1950 khi
nghiên cứu các triệu chứng héo. Reisma và Schure gọi tên bệnh bạc lá là
Krese và xác định do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae gây ra.

các giống lúa.
Trong 3 năm 2001-2003, nhóm nghiên cứu bạc lá trường ĐHNN Hà
Nội đã phân lập và bảo quản được 154 isolate vi khuẩn Xanthomonas oryzae
pv. Oryzae ở 11 tỉnh phía Bắc Việt Nam trên 27 giống. Đồng thời, xác định
được các gen kháng hữu hiệu bệnh bạc lá ở các tỉnh phía bắc là Xa-4, xa-5,
Xa-7, Xa-21. Khả năng kháng của gen xa-5 tương đương với các giống chứa
gen xa-5/10, xa-5/7, vì vậy thay vào việc chuyển đồng thời 2 gen kháng ta chỉ
cần tìm cách chuyển gen xa-5 cũng đủ khả năng kháng.
Trường ĐHNN, từ năm 2001-2002 đã thu được 385 mẫu lá bệnh từ 28
giống lúa trồng ở 11 tỉnh, thành phố các hệ thống sông Hồng, Lô, Gấm, Đà và
sông Lam thuộc miền Bắc Việt Nam.
Công trình nghiên cứu của Yoshimura, Bùi Trọng Thuỷ (2003) đã xác
định được ở miền Bắc Việt Nam tồn tại ít nhất 10 chủng vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. Oryzae. Bằng phương pháp nghiên cứu đơn tế bào
kết hợp với kỹ thuật PCR để nhận diện loại vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.
Oryzae, phân lập được 154 isolate và xác định được chúng thuộc 10 chủng vi
khuẩn gây bệnh bạc lá khác nhau ký hiệu từ 1 đến 10. Trong đó chủng 2 gồm
3 chủng phụ: 2A, 2A’, 2B; chủng 3 gồm 3 chủng phụ: 3A, 3A’, 3B; chủng 5
gồm 2 chủng phụ: 5A, 5B; chủng 7 gồm 2 chủng phụ: 7, 7’ (Phan Hữu Tôn,
2006)[29]. Đến nay, bằng phương pháp phân lập mẫu bệnh và ứng dụng sinh
học phân tử đã nuôi cấy, sau đó bằng kỹ thuật PCR xác định được 16 chủng
vi khuẩn gây bệnh bạc lá.
2.1.2. Nguyên nhân, triệu chứng và tác hại của bệnh bạc lá
2.1.2.1. Nguyên nhân
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae gây ra. Vi
khuẩn hình gậy, hai đầu hơi tròn, có một lông roi ở một đầu, kích thước 1-
6
2×0.5-0.9µm. Trên môi trường nhân tạo có khuẩn lạc hình tròn, màu vàng
xốp, rìa nhẵn, là vi khuẩn Gram âm, không có khả năng khử NO
3

một phần dự trữ bệnh ban đầu. Ở Trung Quốc, những công trình nghiên cứu
của Phương Trung Đạt khẳng định nguồn bệnh chủ yếu là ở hạt giống.
Ở Việt Nam, kết quả nghiên cứu của bộ môn bệnh cây - ĐHNN Hà Nội
đã kết luận: nguồn bệnh bạc lá lúa tồn tại ở hạt giống và tàn dư cây bệnh là
chủ yếu, ngoài ra nguồn bệnh tồn tại ở dạng hạt keo vi khuẩn trong các ký chủ
cỏ dại (cỏ lồng vực, cỏ môi, cỏ gừng bò…)[8].
2.1.2.2. Triệu chứng
Bệnh bạc lá phát sinh phá hoại từ thời kì mạ đến chín nhưng có triệu
chứng điển hình là ở thời kì lúa cấy từ sau khi đẻ nhánh đến chín sữa.
7
Trên mạ triệu chứng không đặc trưng như trên lúa, do đó dễ nhầm lẫn
với các loại bệnh sinh lý khác. Triệu chứng biểu hiện ở mép lá tạo thành
những vết dài, ngắn khác nhau, màu xanh vàng rồi nâu bạc, lá dễ bị khô.
Trên lá lúa triệu chứng thể hiện rõ rệt hơn, tuy có thể biến đổi ít nhiều
theo giống lúa, điều kiện bên ngoài nhưng nói chung bệnh có đặc điểm điển
hình sau: vết bệnh xuất hiện ở mép lá, mút lá lan dần vào phiến lá, hoặc lan
thẳng xuống gân chính, một số trường hợp vết bệnh có khi bắt đầu ngay giữa
phiến lá. Vết bệnh lan rộng theo đường lượn sóng hoặc thẳng. Mô bệnh tái
xanh, vàng lục và cuối cùng cháy khô có màu nâu xám. Trên một số giống lúa
mới ngắn ngày, chịu phân, được bón nhiều phân đạm thì vết bệnh biểu hiện
nhanh, phiến lá đột ngột xanh sẫm, khô tái đi, lá mất sắc bóng, có màu xanh
mờ đục, mô bệnh không kịp chuyển sang màu vàng mà đã khô xác, nâu bạc,
chết lụi, khô táp.
Trong điều kiện ẩm, nhiệt độ tương đối cao, vết bệnh dễ xuất hiện giọt
dịch vi khuẩn hình tròn, nhỏ, keo đặc lại, có màu hơi vàng lục, khi rắn cứng
có màu nâu hổ phách, màu mật ong[8].
2.1.2.3. Tác hại
Bệnh bạc lá tìm thấy ở khắp các vùng trồng lúa trên thế giới. Bệnh gây
ra những thiệt hại đáng kể về năng suất và phẩm chất lúa gạo. Hàng năm, theo
thống kê năng suất lúa trên toàn thế giới giảm từ 10-20% do bệnh vi khuẩn,

có thể xuất hiện ở nhiều địa phương.
Ở miền Bắc Việt Nam, bệnh bạc lá có thể phát triển ở cả vụ xuân và vụ
mùa. Vụ đông xuân bệnh thường phát sinh phát triển vào tháng 3-4, nhưng
phát triển mạnh hơn vào cuối giai đoạn sinh trưởng của cây lúa vào tháng 5-6
(dương lịch) khi lúa xuân đã trỗ và chín. Vụ mùa bệnh phát sinh sớm từ trung
9
tuần tháng 8 lúc lúa đang đẻ nhánh và tiếp tục phát triển mạnh vào thời kỳ
làm đòng, trỗ đến chín.
Diễn biến của bệnh trên đồng ruộng nhiều năm đều theo một quy luật
tương đối rõ: bệnh phát sinh phát triển trong điều kiện nhiệt độ không khí
tương đối cao 26-30
0
C, ẩm độ cao và nhất là trong những đợt mưa, gió bão,
và lúc lúa ở giai đoạn đòng, trỗ trở đi. Trong suốt thời gian mà nhiệt độ thích
hợp cho sự phát triển của bệnh, thì ẩm độ cao lượng mưa lớn, rải đều liên tiếp
sẽ làm cho bệnh phát triển mạnh[8].
2.1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển của bệnh
Ẩm độ và lượng mưa là hai yếu tố quyết định đến sự phát sinh, phát triển
của bệnh bạc lá. Những đợt mưa to gió lớn không những gây nên những vết
thương cho lá mà còn tạo điều kiện cho vi khuẩn phát sinh, phát triển mạnh. Số
lượng dịch vi khuẩn tiết ra trên lá không những tạo thêm nhiều cơ hội cho bệnh
xâm nhiễm dễ dàng mà nó còn là yếu tố trực tiếp giúp bệnh truyền lan đi nhanh
và xa cùng với sự tác động của nước chảy trên các cánh đồng[8].
Ảnh hưởng của kỹ thuật trồng trọt đối với sự phát sinh, phát triển của
bệnh tương đối phức tạp. Một mặt ảnh hưởng trực tiếp tới tình hình sinh
trưởng làm tăng hay giảm sức chống chịu bệnh, mặt khác cũng ảnh hưởng tới
tiểu khí hậu của ruộng. Trong các yếu tố kỹ thuật thì phân bón (nhất là phân
đạm vô cơ) có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát sinh, phát triển của bệnh. Căn cứ
vào các nhận xét nhiều năm thí nghiệm ở Viện bảo vệ thực vật, Trường
ĐHNN Hà Nội thì bón đạm với số lượng nhiều, cây lúa xanh tốt, thân lá mềm

2.1.3.3. Biện pháp phòng trừ
Đối với bệnh bạc lá biện pháp cơ bản nhất để phòng trừ bệnh là dùng
giống kháng bệnh, xây dựng ruộng nhân giống không bệnh và điều chỉnh sinh
trưởng của cây lúa bằng các biện pháp kỹ thuật canh tác nhất là kỹ thuật bón
11
phân và tưới nước. Đồng thời, trên cơ sở các biện pháp đó trong các trường
hợp cụ thể cần làm tốt công tác xử lý hạt giống và dùng vôi, kali, phân hữu cơ
bón lót, bón thúc sớm, giữ mực nước nông, phun thuốc hoá học để phòng trừ
bệnh bạc lá và các bệnh khác. Trong đó sử dụng giống kháng bệnh là biện
pháp chủ động, hiệu quả và khả thi nhất, không gây ô nhiễm môi trường lại
tạo ra sản phẩm sạch.
2.2. Cơ sở khoa học của chọn giống kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp
chỉ thị phân tử DNA
2.2.1. Cơ sở sinh hoá và sinh thái
Theo Kiryu và Mizuta (1995), khi phân tích các đặc trưng hình thái của
giống kháng, giống trung gian và giống nhiễm nhận thấy các giống có bản lá
hẹp, ngắn, đứng thường có bản chất kháng[26].
Thành phần dinh dưỡng bên trong của cây ký chủ cũng là một yếu tố
rất quan trọng trong việc xác định tính kháng và nhiễm.Theo Fang và CS
(1963), các giống nhiễm có hàm lượng amino acid tự do cao hơn giống
kháng, hàm lượng polyphenols thấp hơn và hàm lượng đường giảm xuống.
Những phân tích của IRRI ở Philippin cho thấy, hàm lượng đường giảm đi ở
mức độ cao đối với đạm tổng số ở các giống nhiễm[23]. Theo Uchara (1960),
sự tạo ra phytoalexin (chất kim hãm sự nhân lên của vi khuẩn) được xác định
ở các giống kháng nhưng không xác định ở các giống nhiễm. Ngoài ra có sự
thay đổi về hàm lượng các hợp chất Cacbonhydrates, Nitrogenous và Phospho
trong lá bệnh (Misawa và miyazaki, 1972)[28].
Khi nghiên cứu về tính kháng, Watanabe và CS (1976, 1977) thấy rằng
khi lây nhiễm vi khuẩn vào ký chủ nếu không có sự tương hợp giữa ký sinh
và ký chủ thì ký chủ sẽ tiết ra các hợp chất để chống lại vi khuẩn. Các tác giả

13
Tính kháng ngang (horizontal resistance): biểu hiện khi tất cả các cây
trồng đều có khả năng kháng không chuyên biệt chống lại tất cả các vi sinh
vật gây bệnh hoặc tấn công cây đó. Tính kháng ngang còn được gọi là kháng
không chuyên biệt, kháng tổng quát hoặc kháng thành thục. Tính kháng
ngang do nhiều gen kiểm soát, vì vậy người ta gọi là kháng đa gen. Mỗi một
gen đơn độc có thể chống lại kí sinh một cách không hiệu quả hoặc đóng vai
trò tối thiểu trong tổng số tính kháng ngang. Các gen kháng đều có vai trò
quan trọng để kiểm soát nhiều bước xảy ra trong tiến trình có liên quan đến
bệnh lý cây trồng nhằm cung cấp vật liệu cũng như cấu trúc cho hoạt động
của cơ chế tự bảo vệ. Bên cạnh đó, dưới tác động của môi trường, tính kháng
ngang bị ảnh hưởng và có thể dễ thay đổi hơn tính kháng dọc. Một cách tổng
quát, tính kháng ngang không bảo vệ cây trồng khi cây nhiễm nhưng giảm
dần sự phát triển của kí sinh tại điểm xâm nhập. Do đó tính kháng ngang
không làm giảm bớt nguồn bệnh ban đầu như tính kháng dọc nhưng làm giảm
tốc độ phát triển của dịch bệnh và thời gian tồn tại của tính kháng ngang là
lâu dài hơn. Như vậy, tính kháng ngang bền vững hơn tính kháng dọc.
* Tính kháng bền vững, tính kháng không hoàn toàn
Theo Johnson (1984) tính kháng bệnh bền vững là khả năng duy trì tính
kháng một thời gian dài trong môi trường sống thuận lợi cho kí sinh gây bệnh.
Khả năng kháng bền vững có thể có được ở những giống chứa hai hay nhiều
gen kháng đặc thù với từng nòi sinh lý. Chỉ khi các nòi này đồng loạt tạo nên
nhiều đột biến độc lập mới có thể phá vỡ hàng rào kháng bệnh của giống đó.
Trên thực tế tính kháng bền vững thường kết hợp với tính kháng không
chuyên tính và có tính chất số lượng, nhưng sự hiểu biết về mối quan hệ này
vẫn chưa rõ ràng về mặt sinh hoá. Thông qua phân tích di truyền Wang và
cộng tác viên kết luận rằng có thể dựa trên kiểu hình của tính kháng bệnh bền
vững để giải thích tính di truyền của nó. Do đó, để tạo ra giống kháng bệnh
bền vững người ta chú ý đến việc tìm kiếm nguồn gen kháng phong phú với
14

khác nhau tồn tại những nòi sinh lý khác nhau. Nên có những giống kháng
bệnh rất hiệu quả ở vùng này nhưng lại nhiễm bệnh nặng ở vùng khác. Vì
vậy, để tạo ra giống kháng bệnh phù hợp cho từng vùng sinh thái cần xác định
được nòi sinh lý, khu vực phân bố và khả năng kháng của gen đối với nòi đó.
Viện lúa quốc tế IRRI đã tạo ra các dòng đẳng gen chứa các gen kháng bệnh
bạc lá khác nhau bằng phương pháp lai lại giữa giống IR24 và giống chứa gen
kháng bệnh bạc lá khác nhau. Các dòng đẳng gen có nền gen chung là IR24,
chỉ khác nhau ở gen kháng bệnh bạc lá. Do đó có thể phân biệt được các nòi
sinh lý dựa vào phổ kháng-nhiễm đặc trưng của từng gen kháng. Đây là
phương pháp có ý nghĩa lớn trong việc phát triển giống kháng bệnh bạc lá.
2.4. Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh
bạc lá
2.4.1. Giới thiệu về chỉ thị phân tử DNA
Bất kỳ đoạn DNA nào được sử dụng để phân biệt sự khác nhau về kiểu
hình (tính trạng) giữa các cá thể, dòng, giống và giữa các loài đều được gọi là
chỉ thị phân tử DNA đánh dấu gen[16]. Hiện nay chỉ thị phân tử DNA được sử
dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền và chọn giống. Chỉ thị DNA đánh dấu
gen gồm 9 phương pháp, sắp xếp theo thứ tự thường được sử dụng như sau:
Các loại DNA markers thông dụng
Marker Tên đầy đủ
RFLP Restriction fragment length polymorphism
ALP Amplicon length polymorphism
AFLP Amplified fragment length polymorphism
RAPD Random amplified polymorphic DNA
DA F DNA amplification fingerprinting
SSR Simple sequence repeat (microsatellite)
AP-PCR Arbitrary primer-PCR
SSCP Single strand conformation polymorphism
MRDHV-DNA Moderately repeated, dispersed, and highly variable
16

đó đính đoạn DNA adapter tương ứng với từng Enzym một, rồi thiết kế đoạn
mồi trên cơ sở các adapter có bổ sung thêm 1-2 nucleotid ngẫu nhiên gắn vào
đầu 3’của adapter, dùng kỹ nghệ PCR để nhân các đoạn DNA được cắt lên sẽ
tạo ra sự đa hình phong phú. Chỉ thị AFLP là một kĩ thuật hữu ích trong
nghiên cứu di truyền và chọn giống, được ứng dụng để nghiên cứu đa dạng di
truyền và lập bản đồ liên kết.
* Chỉ thi RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): phương pháp
này được William, Wegsh McClelland đề xuất năm 1990. Phương pháp
RAPD - Sự đa hình các đoạn DNA được nhân lên ngẫu nhiên trên cơ sở
phương pháp PCR nhưng chỉ dùng một đoạn mồi. Chỉ thị RAPD cho phép
đánh giá được tính đa hình của DNA các mẫu nghiên cứu, xem xét được sự
đồng dạng và sai khác về mặt di truyền của các đối tượng nghiên cứu.
* Chỉ thị DAF (DNA Amplification Fingerprinting): phương pháp nhân
DNA in vân tay, dùng rất nhiều đoạn mồi đơn ngắn. Sử dụng chỉ thị DAF để
xây dựng bản đồ liên kết, phân lập các kiểu gen, xác định quan hệ họ hàng
của sinh vật, nghiên cứu đa hình của các đoạn lặp lại đơn giản trong genom,
tìm chọn các dòng bất dục, duy trì phục hồi TGMS và PGMS trong nghiên
cứu và sản xuất lúa lai, xác định đa dạng di truyền giữa hai bố, mẹ trên cơ sở
đó dự đoán được ưu thế lai, xác định các gen số lượng, các gen chủ đạo tạo ra
ưu thế lai và dự đoán khả năng phối hợp.
* Chỉ thị SSR (Single Sequence Repeats): phương pháp nhân hoặc lai
những đoạn DNA lặp lại trong genom để tìm sự đa hình. Cho đến nay chỉ thị
này đang được sử dụng rộng rãi hơn trong lĩnh vực di truyền phân tử của
nhiều đối tượng khác nhau như đánh dấu gen, xác định giống, chuẩn đoán
bệnh di truyền.
*Chỉ thị AP-PCR (Arbitrary Primer – PCR): phương pháp dùng hai đoạn
mồi tùy hứng để nhân gen DNA bằng PCR nhằm xác định sự đa hình của các
18
kiểu gen.
* Chỉ thi SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism): đa hình về

Gen Tính trạng Nguồn
cho
NST RFLP và độ
liên kết
Tài liệu tham
khảo
Xa-1 Chống bạc
lá
Kogyoku 4 Npb235
3.3cM
Npb197
7.2 cM
Yoshimura et
al. 1992
Xa-2 Chống bạc
lá
Tetep 4 Npb235
3.4cM
Npb197
9.4 cM
Yoshimura et
al. 1992
Xa-3 Chống bạc
lá
Chugoku4
5
11 Npb181
2.3cM
Npb78
3.5cM

nata
11 pTA818,pTA2
48
0-1 cM
RG103
Ronald et al.
1992
2.4.3. Kỹ thuật PCR trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh
2.4.3.1. Giới thiệu chung về kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo ngoài cơ thể các đoạn
DNA với tốc độ nhanh chưa từng thấy và độ chính xác gần như tuyệt đối
được thực hiện trong máy chu trình nhiệt (máy PCR).
Kỹ thuật PCR được Kary Mullis phát minh vào năm 1985 và tiếp tục
được hoàn thiện, phát triển thông qua việc sản xuất thành công Enzyme tổng
20