đại học quốc gia hà nội
trờng đại học khoa học tự nhiên
KHOA HểA HC
=== ===
CAO HONG
NGHIấN CU PHN LP, XC NH CU TRC
V KHO ST HOT TNH SINH HC CA CC HP
CHT PHENOLIC T CY
ALPINIA PINNANENSIS T. L. WU ET SENJEN
(ZINGIBERACEAE)
Chuyờn ngnh: Hoỏ hc hu c
Mó s: 60 44 27

luận VĂN thạc sĩ khoa học
Cỏn b hng dn: PGS. TS. Phan Minh Giang

H Ni 2009
1
®¹i häc quèc gia hµ néi
trêng ®¹i häc khoa häc tù nhiªn
KHOA HÓA HỌC
===  ===
CAO HOÀNG
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP
CHẤT PHENOLIC TỪ CÂY
ALPINIA PINNANENSIS T. L. WU ET SENJEN
(ZINGIBERACEAE)

luËn V¡N th¹c sÜ khoa häc


1. 2 Các nghiên cứu về hoá học và hoạt tính sinh học của các hợp chất
phenolic chi Alpinia (Zingiberaceae) ……………………….…..……………6
1.3 Các nghiên cứu hoá học và hoạt tính sinh học của một số hợp chất khác
từ chi Alpinia (Zingiberaceae) ………………………………………………21
CHƯƠNG 2: NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………...…....25
2.1 Nhiệm vụ nghiên cứu .………………………………………………..…25
2.2 Phương pháp nghiên cứu ..…………………………….………………..25
2.2.1 Các phương pháp xử lý mẫu và chiết ……...……………………….…....25
2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp
chất .…………………………………………………………………..…….. 26
2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc … ..…………………...………26
2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học chống oxi hóa ……..…….…26
CHƯƠNG 3: PHẦN THỰC NGHIỆM ……………………………...…………...…… 28
3.1 Thiết bị và hoá chất ……….………………….………………………… 28
3.2. Nguyên liệu thực vật…..….……………………….........……………… 29
3.3. Điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis …..…..….. 29
3.4 Phân tích thành phần các phần chiết bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
(TLC) ……………..…………………………………………………………30
3.4.1 Phần chiết n -hexan ( AP1 )…………………...…..……………………. 30
4
3.4.2 Phần chiết điclometan ( AP2 ) …………………..……………..……… 31
3.4.3 Phần chiết etyl axetat ( AP3 )……………………..….….. …………… 31
3.5 Phân tách sắc ký các phần chiết và phân lập các hợp chất .………… 31
3.5.1 Phân tách phần chiết n -hexan ( AP1 ) ………………… ……………… 31
3.5.2 Phân tách phần chiết điclometan ( AP2 ) ................................................32
3.5.3 Phân tách phần chiết etyl axetat ( AP3 )..…….…………………..…. ....33
3.6 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất được phân lập…….…... 34
3.7 Thử hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính quét gốc tự do DPPH…………..36
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..……………....……………………38
4.1 Đối tượng nghiên cứu .…...……..……………………………………... 38

DEPT :(Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer): Phổ DEPT
6
MỤC LỤC CÁC BẢNG
Bảng 1: Các loài Alpinia ở Việt Nam
Bảng 2: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis
Bảng 3: Phân tích TLC phần chiết n-hexan (AP1)
Bảng 4: Phân tích TLC phần chiết điclometan (AP2)
Bảng 5: Phân tích TLC phần chiết etyl axetat (AP3)

7
MỤC LỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Hình 1: Một số loài Alpinia (Zingiberaceae) của Việt Nam
Hình 2: Alpinia pinnanensis T. L. Wu et Senjen (Zingiberaceae)
Sơ đồ 1: Quy trình điều chế các phần chiết n-hexan (AP1), điclometan
(AP2) và etyl axetat (AP3)
Sơ đồ 2: Quá trình phân tách sắc ký phần chiết n-hexan (AP1)
Sơ đồ 3: Quá trình phân tách sắc ký phần chiết điclometan (AP2)
Sơ đồ 4: Quá trình phân tách sắc ký phần chiết etyl axetat (AP3)
Sơ đồ 5: Sự phân mảnh EI-MS của AP1.18
Sơ đồ 6: Sự phân mảnh EI-MS của AP1.22
Sơ đồ 7: Sự phân mảnh EI-MS của AP3.4
8
MỤC LỤC CÁC PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Phổ IR của AP1.11
Phụ lục 2: Phổ EI-MS của AP1.15
Phụ lục 3: Phổ
1
H-NMR của AP1.15
Phụ lục 4: Phổ
13

chúng tôi như Alpinia gagnepainii, Alpinia naponensis, Alpinia maclurei,
Alpinia pinnanensis… Nghiên cứu xác định các thành phần hoá học của chi
này có ý nghĩa đóng góp vào các hiểu biết về sự phân loại thực vật theo hoá
học của chi Alpinia cũng như các chức năng sinh học của các hợp chất được
phân lập. Trong một nghiên cứu trước các cấu trúc tổng hợp (hybrid) thú vị
giữa chalcon và điarylheptanoit cùng với các hợp chất phenolic (2′,4′-
dihydroxy-6′-methoxychalcon, 4′,6′-dimethylchalconavingenin, alpinentin,
naringenin 5-0-methyl ether và (3S,5S)-trans-3,5-dihydroxy-1,7-diphenyl-1-
hepten) và phytosterol β-sitosterol, stigmasterol và β-sitosterol-3-O-β-D-
glucopyranosid đã được phát hiện từ loài Alpinia pinnanensis được thu thập
tại Vĩnh Phúc [24]. Sau đó, cardamomin đã được phát hiện từ Alpinia
conchigera là một tác nhân chống viêm đầy triển vọng qua các nghiên cứu sự
ngăn chặn của hợp chất này lên các đường truyền tín hiệu của yếu tố phiên mã
NF-kappa B [14]. Tiếp tục nghiên cứu các thành phần hóa học của loài
Alpinia pinnanensis được thu thập tại Lào Cai trong nghiên cứu của Luận văn
này, chúng tôi mong muốn đóng góp thêm những hiểu biết mới về hoá học và
hoạt tính sinh học của loài Alpinia pinnanensis vào chi Alpinia
(Zingiberaceae) của Việt Nam.
10
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về chi Alpinia
1.1.1 Đặc điểm thực vật học [1, 2]
Các cây thuộc chi Alpinia (chi Riềng) thuộc loại thân thảo thẳng, cao từ
0,4 – 2,5 m. Thân rễ khỏe bò dưới đất. Lá hình mác hẹp hoặc hình xoan,
thường có mũi nhọn, không cuống hoặc cuống ngắn. Bẹ lá và lưỡi bẹ cuộn
kín, dài. Cụm hoa ở dạng bông hoặc hình truỳ, các nhánh gần như không có,
có khi rất ngắn, mang một hoa (ít khi có nhánh nhỏ). Các lá bắc của các
nhánh lớn như lá bắc con của hoa có hình ống, cái này lồng vào cái kia, có
dạng phẳng hoặc lõm, thường lớn hơn lá bắc bọc ngoài, cuống hoa thường

Ninh Binh, Lâm
Đồng
2
Alpinia breviligulata
Gagnep.
Riềng mép ngắn,
Riềng lưỡi ngắn
Cả nước
3
Alpinia chinensis
(Retz.) Roscoe.
Riềng tàu,
Lương khương
Kontum, Lâm
Đồng, Lạng Sơn,
Hà Tây, Hà Tĩnh,
Thừa Thiên -Huế
4
Alpinia conchigera
Griff.
Riềng rừng Đồng Nai
5
Alpinia gagnepainii K.
Schum.
Riềng Ganepain Hà Nam Ninh
6
Alpinia galanga (L.)
Willd.
Riềng nếp Các tỉnh miền Bắc
7

(Vieill) K. Schum.
Riềng tía Sài Gòn
15
Alpinia siamensis
K. Schum.
Riềng Xiêm
Bình Trị Thiên, Bà
Rịa
16
Alpinia tonkinensis
Gagnep.
Riềng Bắc bộ,
Ré Bắc bộ
Hà Nam, Nam
Định, Ninh Bình
17 Alpinia venlutina Ridl. Riềng lông
18
Alpinia zerumbet
(Pers.), Alpinia
speciosa (Wall.)
Schum. Burtt et Sm.,
Alpinia nutans Roscoe
Riềng ấm
Các tỉnh miền Bắc,
Thừa Thiên-Huế,
Bà Rịa
Trong dân gian các cây thuộc chi Alpinia không chỉ là gia vị quen thuộc
mà còn có mặt trong nhiều bài thuốc chữa các bệnh như đau dạ dày, đau
bụng, đầy hơi, khó tiêu, ỉa chảy, sốt rét, sốt nóng, nôn mửa, làm ấm tì vị và
kích thích tiêu hoá, còn được dùng để chữa các vết thương, vết loét…

dihydroxylbenzoic là chất lần đầu tiên nhận được từ Alpinia officinarum. 1-
Phenyl-7-(3′-methoxy-4′-hyđroxy)phenyl-5-ol-3-hepton và một hợp chất mới,
15
1,7-diphenyl-3-5-heptandiol-phenyl-7-(3′-methoxyl-4′-hyđroxyl) phenyl-3,5-
heptadiol đã nhận được từ 1,7-diphenyl-5-ol-3-heptanon và 1-phenyl-7-(3′-
methoxyl-4′-hydroxyl) phenyl-5-ol-3-heptanon bằng sự khử hóa [12].
O OH
1
Điarylheptanoit 7-(4'-hydroxy-3'-methoxyphenyl)-1-phenylhept-4-en-3
-on (5) (HMP) là một chất hóa học có nguồn gốc thực vật được tìm thấy trong
Alpinia officinarum. Các tính chất chống viêm của hợp chất này trên dòng tế
bào đại thực bào chuột RAW 264.7 và các tế bào đơn nhân máu người ngoại
vi (PBMC) đã được nghiên cứu in vitro. Xử lý các tế bào 264.7 RAW với
HMP (6,25-25μM) ức chế mạnh sự sản sinh nitơ oxit (NO). Hợp chất này
cũng ức chế sự giải phóng các cytokin gây viêm interleukin-1β (IL-β) và
tumor necrosis factor-α (TNF-α) gây bởi LPS từ PB-MC người in vitro. Hơn
nữa, Western blotting và sự phân tích phản ứng mạch polymerase- sự phiên
mã ngược chứng tỏ rằng HMP làm giảm protein iNOS (inducible nitric oxit
synthase) và COX-2 (cyclooxygenase-2) gây bởi LPS và sự biểu hiện mRNA
trong các tế bào RAW 264.7. Hơn nữa, điều trị HMP cũng làm giảm sự liên
kết DNA của các NF-kappa B gây ra bởi LPS trong các tế bào RAW 264.7.
Để định giá các cơ chế phân tử cho sự ức chế của các thực thể trung gian gây
viêm bởi HMP (25 μM) tác dụng của HMP trên protein kinase được hoạt hóa
bởi mitrogen p38 và P44/42 (MAPK) gây bởi LPS đã được nghiên cứu. Sự
phosphoryl hóa của p44/42 MAPK trong các tế bào RAW 264.7 được hoạt
hóa bởi LPS đã làm giảm đáng kể bởi HMP, trong khi sự hoạt hóa của p38
MAPK không bị ảnh hưởng. Các kết quả này đã cho thấy HMP đã ức chế sự
16
sản sinh NO, IL-1β và TNF-α gây bởi LPS và sự biểu hiện gen iNOS và
COX-2 bằng cách ức chế sự hoạt hóa NF-kB và sự phosphoryl hóa P44/42

EPEC được phân lập lâm sàng và ức chế hiệu quả sự viêm gây bởi
lipopolissacarit của EPEC trong các tế bào máu đơn nhân người ngoại vi.
Phân tích docking in silico cho thấy điarylheptanoit có thể tương tác với một
đơn vị phụ A của DNA gyrase của E. coli. Các phân tử với hoạt tính nhị chức
như vậy có thể là các chất điều trị có tiềm năng cho các bệnh nhiễm khuẩn
[35].
O
OCH
3
OH
OH
6
Phần chiết 80% axeton-nước từ thân rễ Alpinia officinarum đã được phát
hiện ức chế melanogenesis trong các tế bào khối u 4A5-B16. Trong số các
hợp chất được phân lập 4 điarylheptanoit, 5-hyđroxy-1,7-diphenyl-3-heptanon
(7), 7-(3'',4''-methoxyphenyl)-1-phenylhept-4-en-3-on (8), 5-hyđroxy-7-(4''-
hydroxy-3''-methoxyphenyl)-1-phe-nyl-3-heptanon (9) và 3,5-dihyđroxy-1,7-
diphenylheptan (10) và 2 flavonol kaempferid (11) và galangin (12) ức chế
melanogenesis với các giá trị IC
50
từ 10-48 µM và một số yêu cầu về cấu trúc
của các hợp chất có hoạt tính cho sự ức chế đã được làm rõ. Ngoài ra 7-(4''-
hyđroxy-3''-methoxyphenyl)-1-phenylhept-4-en-3-on, kaempferid và galangin
ức chế sự biểu hiện mRNA của tyrosinase, tyrosinase và các protein-1 và 2
liên quan đến tyrosinase, và mức protein của một yếu tố phiên mã liên kết với
microphthalmia [23].
18
OH OH

OHO

S
16 H H OCH
3
R

15 H H OH S
R
1
R
2
R
3
5-OH
OHO
R
1
R
2
R
3
OH
OCH
3
O
HO
OH
OH
18
Phân tách định hướng bằng thử nghiệm sinh học phần chiết ete của
Alpinia officinarum Hance đã phân lập được 2 hợp chất mới, 6-hydroxy-1,7-

Một điarylheptanoit mới, cùng với 5 điarylheptanoit đã biết, đã được
phân lập từ thân rễ Alpinia officinarum. Cấu trúc của hợp chất mới đã được
xác định là trans,trans-1(3′-methoxy-4′-hydroxyphenyl)-7-phenyl-5-ol-4,6-
dien-3-heptanon (24) [10].
Trong nghiên cứu thành phần glycozit từ thân rễ Alpinia officinarum
Hance, một este glycozit, 4′-hydroxy-2′-methoxyphenyl-β-D-{6-O-[4′′-
hyđroxy-3′′,5′′-dime- thoxy(benzoat)]}-glucopyranosid (25) cùng với một
chất đã biết n-butyl-β-D- fructopyranosid (26), đã được phân lập. Alpinosid A
(25) là một chất mới và 26 đã được phân lập lần đầu tiên từ chi Alpinia [13].
Sáu điarylheptanoit được phân lập từ thân rễ Alpinia officinarum là các
chất ức chế sự sản sinh NO trong đại thực bào RAW 264.7 được hoạt hoá
bằng lipopolysacarit. Một liên kết đôi C-4 của mạch liên kết giữa các vòng
thơm đã được phát hiện là yếu tố cấu trúc cần thiết cho hoạt tính. Hơn nữa,
các điarylheptanoit đã ngăn chặn sự biểu hiện của protein và mRNA enzym
inducible NO synthase. Kết quả này đã cho thấy tác dụng truyền thống của
thân rễ Alpinia officinarum làm thuốc chống viêm đã được giải thích một phần
bằng hoạt tính ức chế sự sản sinh NO trong đại thực bào được hoạt hóa [21].
Phần chiết 80% axeton - nước từ thân rễ Alpinia officinarum đã được
phát hiện ức chế sự sản sinh nitơ oxit (NO) trong các đại thực bào màng bụng
được hoạt hoá bằng lipopolysacarit (LPS). Qua phân tách theo định hướng
hoạt tính sinh học đã phân lập được hai điarylheptanoit 7-(4′′-hydroxy-3′′-
21
methoxyphenyl-1-phenylhept-4-en-3-on (27) và 3,5-đihyđroxy-1,7-điphenyl-
heptan (28) và một flavonol, galangin (29); các hợp chất này ức chế đáng kể
sự sản sinh NO với các giá trị IC
50
từ 33-62 µM. Để làm sáng tỏ mối quan hệ
cấu trúc - hoạt tính sinh học (SAR) của các điarylheptanoit, các điaryl-
heptanoit từ Curcuma zedoaria đã được nghiên cứu. Các kết quả cho thấy liên
kết đôi hoặc phần enon ở các vị trí 1-7 là các yếu tố cấu trúc quan trọng cho

H

30
Qua nghiên cứu SAR dựa trên 1’S-1’-axetoxychavicol axetat (30) đối
với hoạt tính chống dị ứng loại I bằng cách đánh chỉ số sự giải phóng β-
hexosaminidase, một chất đánh dấu của sự mất hạt gây bởi kháng nguyên
antigen IgE trong các tế bào RBL-2H3, một chất tương tự bền và có hoạt tính
mạnh hơn, 4-(methoxycacbonyloxy phenylmethyl)phenyl axetat đã được phát
triển. Hợp chất này cũng ức chế mạnh TNF-α và sự sản sinh IL-4 gây bởi
kháng nguyên IgE [30].
Phân tách theo định hướng hoạt tính sinh học ức chế virut HIV-1 qua
ngăn chặn vận chuyển protein điều chỉnh virut HIV-1 (Rev), đã phát hiện
được 1′-acetoxychavicol acetat (ACA) (30) từ rễ Alpinia galanga là một chất
ức chế mới sự chuyển nhân của Rev. Phân tích cơ chế tác dụng với mẫu thử
(31) và một vài chất tổng hợp tương tự đã xác định được các phần quyết định
trong cấu trúc của 32 cho hoạt tính ức chế Rev-export [18].
23
O
O
O
O
31
O
O
O
NH
S
HN NH
O
O

mức độ biểu hiện của các gen đồng hóa của collagen II, SOX9 và aggrecan đã
được tăng lên. Nghiên cứu cho thấy p-hydroxycinnaldehyd từ A. galanga là
một tác nhân tiềm năng cho điều trị bệnh viêm khớp [29].
OH
O
H
H
H
33
Alpinia pricei Hayata là một thuốc cổ truyền Trung Quốc ở Đài Loan.
Tác dụng của các phần chiết etanol (70%) từ thân rễ A. pricei có thể gây
apoptosis trong các tế bào ung thư biểu mô người KB đã được nghiên cứu. Xử
25

Trích đoạn Thiết bị và hoỏ chất Phõn tỏch phần chiết n-hexan(AP1)

---