Trao đổi trực tuyến tại:
http://www.mientayvn.com/Y_online.html
TS. BS. Đỗ Thị Thanh Thủy

Realtime PCR
Nguyên tắc và ứng dụng PCR
PCR VÀ GIỚI HẠN CỦA PCR
PCR và phát hiện sản phẩm bằng
điện di trên gel agarose

1. Phát hiện điểm cuối
(End-Point Detection)
2. Độ đặc hiệu kém
3. Độ nhạy thấp
4. Độ phân giải kém
4. Chỉ phân biệt dựa trên kích thước sản phẩm PCR
5. Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm
6. Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư)
REALTIME PCR
→ Real-time PCR là phản ứng PCR mà quá trình
nhân bản DNA được theo dõi trực tiếp trên máy
luân nhiệt theo từng chu kỳ nhiệt.

Kiểm soát tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi
chu kỳ phản ứng (tỉ lệ với lượng sản phẩm PCR
tạo thành trong từng chu kỳ nhiệt - Real time).

Phát hiện và định lượng nồng độ sản phẩm sau

Cycle 15
Cycle 19
Cycle 23
Cycle 26
Cycle 29
Cycle 31
Cycle 33
Cycle 34
Cycle 36
Cycle 39
Cycle 41
Cycle 13
Cycle 11
1 10 10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
Cycle 15
Cycle 19
Cycle 23
Cycle 26
Cycle 29
Cycle 31
Cycle 33


- Ct (Threshold cycle):
là số chu kỳ mà tại đó
tín hiệu huỳnh quang
của sản phẩm khuếch
đại vượt qua ngưỡng.

-Động học RealtimePCR
Phân tích tiến trình phản
ứng trong mỗi chu kỳ
nhiệt nhờ computer

THỜI ĐIỂM PHÁT HIỆN TÍN HIỆU
REALTIME PCR
REALTIME PCR
Rael time PCR định
lượng số copies trong
giai đoạn tăng lũy thừa
Log view
Primers
Taq polymerase
dNTP
PCR buffer
MgCl
2

Real-time

Không phân biệt được sản phẩm đặc hiệu hay không đặc hiệu
 Tính đặc hiệu không cao.
 Tầm soát sản phẩm trước khi sử dụng probe
đặc hiệu
 Thực hiện khi PCR đã được tối ưu hóa, không có
primer dimer, không có amplicon không đặc hiệu
SYBR GREEN I
PHÂN BIỆT SẢN PHẨM ĐẶC HIỆU
(Melting Curve)

Mục đích:
phân tích tính đặc hiệu của sản phẩm sau khuếch đại

Melting temperature (Tm) của dsDNA:
–T
o
tại đó ½ pt DNA ở dạng sợi đôi, ½ sợi đơn
–Phụ thuộc chiều dài và thành phần nucleotide

Thực hiện:
tăng T
o
, DNA tách nhau ra,
Đưa T
o
về 55
o

Primers
Tube phản ứng
R
Q
Probe
1. Biến tính 94
o
C
2. Bắt cặp và kéo dài 60
o
C
Taq
l
R
Q
NGUYÊN TẮC
HOẠT ĐỘNG
5’
3’
R
Q
5’
3’
Q
Taq
R
5’

C
A
A
A
G
T
A
T
C
A
T
C
C
C
T
C
C
A
G
G
G
C
G
G
C
C
A
A T
T
Q