1
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NÔNG MINH TUẤN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN THIẾT BỊ PIN NHIÊN LIỆU
VI SINH VẬT (MICROBIAL FUEL CELL) SỬ DỤNG LÀM
CẢM BIẾN SINH HỌC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG NƢỚC THẢI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NÔNG MINH TUẤN

Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, con xin gửi lời cảm ơn tới
Bố, Mẹ và những người thân trong gia đình đã nuôi nấng, dậy dỗ, và luôn ủng hộ, động
viên con trong suốt quá trình học làm người.
Luận văn được thực hiện trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu mã số 08/HĐ -
ĐT.08.14/CNMT thuộc “Chương trình nghiên cứu khoa học, ứng dụng và chuyển giao công
nghệ phát triển ngành công nghiệp môi trường” của Bộ Công thương.

Hà Nội, ngày….tháng….năm 2014
Học Viên Nông Minh Tuấn

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH ẢNH
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 3
1.1 Ô NHIỄM NƢỚC TẠI VIỆT NAM 3
1.2 PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG NƢỚC THẢI SAU XỬ LÝ . 5
1.3 CẢM BIẾN SINH HỌC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG NƢỚC THẢI SAU
XỬ LÝ 7
1.3.1 Cảm biến sinh học dựa trên hành vi của sinh vật 7
1.3.2 Cảm biến sinh học vi sinh vật 9
1.4 PIN NHIÊN LIỆU VI SINH VẬT 12
1.4.1 Các loại Thiết kế MFC 15
1.4.2 Vật liệu cấu tạo MFC 17
1.4.2.1 Vật liệu cho điện cực 17


3.2.3 Kết quả phân lập hệ vi sinh vật trong điện cực anode của MFC sau khi làm
giàu thành công 57
3.2.4 Kết quả phân tích quần xã vi khuẩn bằng phƣơng pháp DGGE 60
3.2.5 Kết quả phân tích trình tự các băng DNA thu đƣợc từ các quần xã trên
DGGE 63
3.3 BƢỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM HỆ THỐNG MFC VỚI DUNG DỊCH MÔ
PHỎNG NƢỚC THẢI SAU XỬ LÝ TRONG PHÕNG THÍ NGHIỆM 66
KẾT LUẬN 68
KIẾN NGHỊ 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO 70
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ
Tên tiếng anh
Tên tiếng việt
AEM
Anion exchange membrane
Màng anion
BH
-
Nguồn quần xã từ bùn hoạt tính
BOD
Biochemical oxigen demand
Nhu cầu oxy sinh hóa

Phản ứng chuỗi trùng hợp
R
int
Internal resistance
Điện trở trong

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1 Nguyên lý hoạt động của một MFC 12
Hình 2: (a) Thiết kế MFC sử dụng chổi than chì là điện cực anode nhƣ là một bề
mặt cho vi sinh vật phát triển và với điện cực cathode sử dụng vải carbon (b) Biểu
diễn phƣơng thức truyền điện tử của trong màng biofilm: sản sinh nanowires, chất
truyền điện tử trung gian, và tiếp xúc qua bề mặt tế bào 13
Hình 3: Hai dạng thiết kế MFC 14
Hình 4: Vật liệu carbon sử dụng cho điện cực anodes: (A) giấy carbon, (B) vải các
bon, (C) lƣới carbon 18
Hình 5: Một vài vật liệu dùng làm điện cực cho MFC (A) Thanh than chì (B; C; D)
Tấm than chì 18
Hình 6: (A) Hạt than chì, (B; C) Chổi than chì (D) Sợ than chì 19
Hình 7: Các loại màng đƣợc sử dụng trong MFC 21
Hình 8: Cơ chế hoạt động của các loại màng phân tách 21
Hình 9: MFC hai khoang-khung thủy tinh 22
Hình 10: MFC một khoang-khung thủy tinh 22
Hình 11: MFC một khoang- khung polyacrylic 23
Hình 12: MFC hai khoang- khung polyacrylic 23
Hình 13: MFC dạng ống- khung polypropylen 23
Hình 14: MFC một khoang- khung Plexiglas 23
Hình 15 : MFC khoang chữ nhật 32

Bảng 1: Đặc trƣng thành phần nƣớc thải của một số ngành công nghiệp 3
Bảng 2: Tổng lƣợng nƣớc thải và lƣợng thải các chất ô nhiễm trong nƣớc thải từ
một số khu công nghiệp đồng bằng sông hồng 4
Bảng 3: Một số thông số ô nhiễm nƣớc thải trong công nghiệp theo tiêu chuẩn 5
Bảng 4: Theo dõi sự thay đổi hành vi của cá liên kết với điều kiện stress 8
Bảng 5: Tổng hợp nghiên cứu về cảm biến sinh học vi sinh vật quang học 10
Bảng 6: Các chủng vi khuẩn điện hóa trong MFC không sử dụng chất truyền điện tử
trung gian 26
Bảng 7: Môi trƣờng LB 35
Bảng 8: Môi trƣờng C 36
Bảng 9: Môi trƣờng PDA 36
Bảng 10: Môi trƣờng Hansen 37
Bảng 11: Môi trƣờng BG 11 37
Bảng 12: Thành phần của dung dịch Trace metal mix A5 38
Bảng 13: Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân gen16s rRNA 39
Bảng 14: Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân vùng V3 thuộc gen16s
rRNA 40
Bảng 15: Thành phần của dung dịch biến tính 0% và 60% 41
Bảng 16: Thành phần của “Working solution” 41
Bảng 17: Phân tích ƣu nhƣợc điểm của các vật liệu cấu tạo MFC 43
Bảng 18: Phân tích ƣu nhƣợc điểm vật liệu cấu tạo khung MFC 44
Bảng 19: Phân tích ƣu nhƣợc điểm của các loại màng phân tách 44
Bảng 20: Phân tích ƣu nhƣợc điểm các loại thiết kế MFC 45

Bảng 21: Tổng hợp các nghiên cứu về dạng MFC biosensor 46
Bảng 22: Bảng so sánh trình tự các băng DNA đƣợc thôi gel từ gel DGGE với dữ
liệu trình tự DNA trên NCBI 64
1
MỞ ĐẦU
Nƣớc là một phần thiết yếu trong quá trình sinh hoạt–sản xuất của con ngƣời.

theo dõi từ xa, dễ dàng sử dụng [9, 32, 66, 70, 73]. Trong đó, cảm biến sinh học
khai thác quá trình trao đổi chất của vi sinh vật đang đƣợc đặc biệt quan tâm nghiên
cứu và ứng dụng [32]. Pin nhiên liệu vi sinh vật là một dạng thiết bị cảm biến hoạt
động dựa trên hoạt tính điện hóa của vi sinh vật. Loại thiết bị này đƣợc nghiên cứu
tại nhiều quốc gia nhƣ Hàn Quốc, Hoa Kỳ, hay Châu Âu, chúng có ƣu điểm nhƣ có
khả năng chỉ dẫn BOD nƣớc thải, có thời gian phản ứng nhanh, dễ dàng sử dụng,
chi phí thấp [17, 25, 26, 29].
Tại Việt Nam hiện nay những nghiên cứu về pin nhiên liệu vi sinh vật cũng
nhƣ ứng dụng chúng làm cảm biến sinh học trong đánh giá chất lƣợng nƣớc thải còn
khá hạn chế [52]. Nhằm góp phần vào các nghiên cứu về pin nhiêu liệu vi sinh cũng
nhƣ phát triển một thiết bị cảm biến có khả năng đánh giá chất lƣợng nƣớc thải với
thời gian phân tích nhanh và khả năng sử dụng nhiều lần… chúng tôi tiến hành đề
tài “ Nghiên cứu phát triển thiết bị pin nhiên liệu vi sinh vật (Microbial fuel cell)
sử dụng làm cảm biến sinh học đánh giá chất lượng nước thải”.
3

Chƣơng 1 – TỔNG QUAN
1.1 Ô NHIỄM NƢỚC TẠI VIỆT NAM
Ô nhiễm nƣớc xuất phát từ nhiều nguyên nhân khác nhau, tuy nhiên tại Việt
Nam hiện nay có bốn nguồn gây ô nhiễm nƣớc chính: nƣớc thải nông nghiệp, công
nghiệp, sinh hoạt và y tế. Theo Báo cáo môi trƣờng quốc gia 2012 của Việt Nam,
nƣớc thải sinh hoạt chiếm 30% tổng lƣợng nƣớc thải trực tiếp ra các sông hồ; kênh
rạch. Trong giai đoạn đẩy mạnh công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nƣớc, nhiều
ngành công nghiệp đƣợc mở rộng quy mô sản xuất, cũng nhƣ phạm vi phân bố. Tuy

BOD, SS, pH, NH
4+

Độ đục, NO
3
-
, PO
4
3-

Cơ khí
COD, dầu mỡ, SS, CN
-
,
Cr, Ni
SS, Zn, Pb, Cd
4

Bảng 2: Tổng lƣợng nƣớc thải và lƣợng thải các chất ô nhiễm trong nƣớc thải
từ một số khu công nghiệp đồng bằng sông hồng [4]
Khu Vực
Lƣợng
nƣớc thải
(m
3
/ ngày)
Tổng lƣợng các chất ô nhiễm (Kg/ ngày)
TSS
BOD
5

467
644
Hải Dƣơng
23806
5237
3261
7594
1381
1904
Hƣng Yên
12350
2717
1692
3940
716
988
Ô nhiễm nƣớc đƣợc xem là một mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng, gây ra
thiệt hại lớn về kinh tế và phá hoại hệ sinh thái. Theo đánh giá của ngân hàng thế
giới, Việt Nam có thể chịu tổn thất do ô nhiễm môi trƣờng lên tới 5, 5 % GDP và
780 triệu USD trong lĩnh vực sức khỏe cộng đồng vì ô nhiễm môi trƣờng. Ô nhiễm
sông Thị Vải là một ví dụ điển hình: một đoạn sông dài khoảng 12 km (từ hợp lƣu
suối Cả-sông Thị Vải tới khu vực cảng Khú Mỹ, phía sau khu công nghiệp Mỹ
Xuân) hầu nhƣ không một loài tôm, cá, thủy sản nào có thể tồn tại và phát triển. Tại
khu vực này chỉ còn chứa các động-thực vật phù du. Ƣớc tính ban đầu diện tích
nông nghiệp bị thiệt hại là 1.438,5 ha, trong đó phần lớn là ao nuôi thủy sản và 29,5
ha là đất nông nghiệp. Một ví dụ khác, một nghiên cứu về ảnh hƣởng của hoạt động
sản xuất tại khu chế biến kim loại màu thuộc tỉnh Thái Nguyên chỉ ra rằng, hàm
lƣợng chì và arsen trong nƣớc thải sinh hoạt tại vùng này cao hơn 1,5 – 6 lần so với
vùng đối chứng. Qua xét nghiệm máu của phụ nữ trong độ tuổi sinh sản sống liên
tục ở vùng nghiên cứu 5 năm cho thấy hàm lƣợng chì và arsen trong máu của họ cao

Pt/Co
50
150
3
pH
-
6-9
5,5-9
4
BOD
5
(20
o
C)
mg/lít
30
50
5
COD
mg/lít
75
150
6
Chất rắn lơ lửng
mg/lít
50
100
7
Asen
mg/lít


tảo, nấm, động vật nguyên sinh…Tổng chất rắn (TS) đƣợc xác định bằng trọng
lƣợng khô thành phần còn lại sau khi cho bay hơi 1 lít mẫu nƣớc rồi sấy khô ở
103
o
C, hay chất rắn huyền phù (SS) là trọng lƣợng khô của chất rắn sau khi cho 1 lít
mẫu nƣớc đi qua giấy lọc sợi thủy tinh rồi sấy ở 103 – 105
o
C tới khối lƣợng không
đổi [1, 3, 54].
Các kim loại nặng trong nƣớc hay các chất độc hữu cơ (nhƣ phenol, DDT,
thuốc diệt cỏ…) có thể đƣợc đánh giá bằng các phƣơng pháp so màu với thuốc thử,
sắc ký, hoặc chuẩn độ theo thể tích với một chất hóa học. Ví dụ, để xác định hàm
lƣợng phenol có thể sử dụng một trong hai phƣơng pháp sau: (1) Phƣơng pháp xác
định phenol bằng phƣơng pháp đo màu theo nguyên tắc là tách phenol ra khỏi nƣớc
và cho tác dụng với 2-6 dicloroquinon diclorimmid để tạo phức màu xanh của
indophenol, và qua cƣờng độ màu thu đƣợc ta biết đƣợc hàm lƣợng phenol (đo bƣớc
sóng 610 nm). (2) phƣơng pháp chuẩn độ thể tích theo phép đo iot bằng cách cho
phenol trong nƣớc tác dụng với brom tạo thành tribromophenol, khi thêm kali iodua
vào dung dịch, lƣợng brom phản ứng thừa với phenol sẽ đẩy iot ra khỏi muối
kaliiodua, sau đó ta tiến hành định lƣợng iot bằng natri thiosunfat và qua đó ta tính
đƣợc hàm lƣợng phenol. Một ví dụ khác là phƣơng pháp xác định hàm lƣợng asen
trong nƣớc thải bằng cách so màu trên quang sắc kế với bạc dietylthiocacbamat:
dùng hydro mới sinh để khử muối asen thành khí asin (AsH
3
); asin sau khi đi qua
một ống chứa bông thủy tinh hoặc giấy lọc tẩm chì axetat rồi đi vào ống hấp thụ có
chứa bạc dietylthiocacbamat hòa tan trong pirindin. Trong ống hấp phụ asen phản
ứng với muối bạc tạo thành một phức tan màu đỏ sử dụng để so màu, cƣờng độ màu
sẽ tỷ lệ với hàm lƣợng asen có trong nƣớc (đo ở bƣớc sóng 350 - 540 nm) [1, 3].

pháp thƣờng sử dụng hiện nay để đo chỉ số BOD của nƣớc là chỉ số BOD
5
: tức là
xác định lƣợng oxy cần thiết để oxy hóa chất hữu cơ trong 5 ngày tại nhiệt độ 20
o
C
trong bóng tối [1, 3, 54].
Các phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng nƣớc thải ở trên có ƣu điểm là: định
lƣợng chính xác nồng độ chất gây ô nhiễm, đã đƣợc áp dụng rộng rãi tại nhiều nƣớc
trong thời gian dài. Tuy nhiên chúng lại có những nhƣợc điểm nhƣ: không thể chi ra
nhiều tác nhân gây ô nhiễm cùng một lúc, thời gian phân tích khá dài, giá thành đắt,
quy trình phân tích đòi hỏi ngƣời có chuyên môn cao và máy móc-hóa chất đắt
tiền… Vậy nhằm hƣớng tới sự thuận tiện và hiệu quả (đặc biệt là về mặt thời gian)
trong việc đánh giá chất lƣợng nƣớc thải của ngƣời quản lý hay các công ty tƣ nhân,
việc đƣa ra đƣợc một phƣơng pháp đánh giá nhanh chất lƣợng nƣớc thải sau xử lý,
với chi phí cạnh tranh và dễ sử dụng đang là một nhu cầu bức thiết.
1.3 CẢM BIẾN SINH HỌC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG NƢỚC THẢI SAU
XỬ LÝ
Một cảm biến sinh học (Biosensor) là một hệ thống phân tích sử dụng các tác
nhân sinh học nhƣ DNA, enzymes, mô, cơ thể sống kết hợp với việc đánh giá – đo
lƣờng các dấu hiệu hóa – lý của các tác nhân sinh học đó. Các dạng cảm biến sinh
học hay đƣợc sử dụng hiện nay để đánh giá chất lƣợng nƣớc thải thƣờng thuộc hai
dạng: (i) cảm biến dựa trên hành vi của sinh vật, hoặc (ii) cảm biến sử dụng vi sinh
vật [8, 32, 65, 66].
1.3.1 Cảm biến sinh học dựa trên hành vi của sinh vật
Nghiên cứu hành vi của sinh vật cung cấp các hiểu biết liên quan đến sinh lý
và sinh thái của sinh vật và môi trƣờng của chúng. Các đặc tính hành vi này gồm
8

chuỗi của hành động có thể xác định. . Việc nghiên cứu các đặc tính này cần dựa

Cá thái dƣơng
Cd, Cr, Zn
Trạng thái kích động
Ellgaard 1978
Cá vàng
Cu
Sự nhanh nhẹn, sự
thay đổi góc bơi
Kleerekoper và
cộng sự 1972
Cá thái dƣơng
DDT
Trạng thái kích động
Ellgaard 1977
Cá hồi đốm đem
Hỗn hợp kim loại
nặng
Hành vi tránh xa
Svecevicius 2001
9

Mô hình cá trong kiểm tra đặc tính hành vi độc tố (Bảng 4): Cá là một mô
hình lý tƣởng cho việc nghiên cứu các hành vi của động vật với các tác nhân stress
và các độc tố bởi vì: (i) cơ thể cá tiếp xúc trực tiếp với nƣớc của môi trƣờng có chứa
nhiều chất hóa học cần thử nghiệm, (ii) môi trƣờng sống của cá khá đa dạng, (iii) cá
dễ dàng nuôi; có khả năng sinh sản; và đƣợc nghiên cứu nhiều với các độc tố. Bất
cứ nghiên cứu nào hƣớng tới phát triển một mô hình cảm biến dựa trên phản ứng
hành vi của cá cần phải dựa trên những nghiên cứu về đặc điểm sinh thái của loài
tƣơng ứng [8].
Mô hình Bọ nước (Daphnia) phát hiện độc tố trong nước: Bọ nƣớc đƣợc sử

Ni
2+
và Co
2+

Ralstonia eutropha AE2515
Phát quang
Arsenite
E. coli DH5α (pPR-arsR-ABS,
biểu hiện gen egfp
Phát quang
Toluen
P. fluorescens A506 (pTolLHB)
Huỳnh quang
BOD
P. putida
Huỳnh quang
Sự phát quang sinh học có liên kết với ánh sáng phát ra từ tế bào vi sinh vật
và đóng vai trò quan trọng trong sự chỉ thị trực tiếp chất ô nhiễm. Gen phát quang
lux đã đƣợc phát hiện ở Vibrio fischeri và nghiên cứu ứng dụng rộng rãi. Có thể
thông qua sự biểu hiện của gen lux để đánh giá nồng độ của chất độc ta quan tâm,
bằng cách khai thác quá trình điều hòa của gen này; và qua đó có thể dễ dàng phân
tích số lƣợng nồng độ chất độc dựa vào cƣờng độ phát quang sinh học của sinh vật
chứa gen lux. Ngoài ra các gen có khả năng tạo protein huỳnh quang cũng đã đƣợc
ứng dụng trong việc thiết kế cảm biến sinh học vi sinh vật phát quang nhƣ: gen gfp
mã hóa protein phát huỳnh quang màu xanh lá cây [32].
Cảm biến sinh học vi sinh vật điện-hóa: Các cảm biến này hoạt động dựa
trên sự biến đổi của dòng điện (amperometric), điện thế (potentiometric) hay độ dẫn
điện (conductometric) trong mối tƣơng quan đến hoạt động trao đổi chất của vi sinh
vật [32].

Pin nhiên liệu vi sinh vật (MFC) là dạng cảm biến sinh học đã đƣợc nghiên
cứu nhƣ một cảm biến đo BOD trong một thời gian dài, từ khi Karube và cộng sự
công bố cảm biến BOD kiểu MFC đƣợc sử dụng sản xuất khí hydro bởi Clostridium
butyricum vào năm 1977 [32]. Cảm biến MFC trong việc đánh giá BOD ngày càng
đƣợc phát triển và tối ƣu nhằm mục đích dễ dàng sử dụng, phát hiện nhanh-trực tiếp
nồng độ BOD [17, 25, 26, 35, 36, 45]. Ngoài ra hệ thống MFC có thể sử dụng làm
cảm biến phát hiện độc tố, nhờ dựa vào sự ức chế cơ chế di chuyển electron hoặc
quá trình trao đổi chất của vi khuẩn bởi các thành phần độc tố có trong môi trƣờng.
Theo Mia và cộng sự khi thử nghiệm MFC với các chất độc nhƣ: Pb, Hg, PCB, có
thể dễ dàng nhận thấy sự sụt giảm dòng điện phát sinh trong MFC [29].
12

1.4 PIN NHIÊN LIỆU VI SINH VẬT
Pin nhiên liệu vi sinh vật (MFC) là hệ thống có khả năng phát sinh dòng điện
từ sự oxy hóa cơ chất bằng cách sử dụng vi sinh vật. Nghiên cứu sớm nhất về MFC
đƣợc thực hiện bởi Potter vào năm 1911, khi tác giả đã thu đƣợc dòng điện phát
sinh trong MFC khi nuôi cấy Escherichia coli và Saccharomyces. Tuy nhiên, MFC
không gây đƣợc sự chú ý cho đến những năm 1980 khi có những phát hiện rằng mật
độ dòng điện và năng lƣợng đầu ra có thể đƣợc tăng lên cao bằng cách thêm vào
MFC chất truyền điện tử trung gian (electron mediator), là chất có thể mang điện
tích từ ngoài tế bào tới điện cực âm (anode). Phần lớn các vi sinh vật có các thành
phần màng lipid, peptidoglycans, lipopolysaccharides và không dẫn điện, có thể cản
trở việc di chuyển của electron tới anode [37, 38].

Hình 1 Nguyên lý hoạt động của một MFC [38]
Ghi chú: Bacterium: vi khuẩn; Anode: cực âm; Cathode: cực dƣơng:
MED: chất truyền điện tử trung gian: e-: điện tử
Hiện nay, các nghiên cứu về hệ vi sinh vật nằm trong màng biofilm tại anode
của MFC cho thấy có hai phƣơng cơ chế vận chuyển điện tử: thông qua kết nối trực
tiếp giữa bề mặt điện cực với màng ngoài tế bào nhờ các cytochrome (vận chuyển e

Các chất truyền điện tử trung gian thƣờng đƣợc đƣa vào MFC với mục đích
nhằm tăng khả năng sản sinh dòng điện của chúng. Những nhiên cứu của Poster,
Bond và Lovley đã nhận thấy đối với E. coli khi đƣợc nuôi cấy thuần trong MFC
mà không bổ sung chất truyền điện tử trung gian sẽ không có khả năng phát sinh
dòng điện trong MFC. Một số chất đóng vai trò làm chất truyền điện tử trung gian
thƣờng đƣợc bổ xung vào MFC nhƣ là: đỏ trung tính, anthraquinone-2-6,
disulfonate [37, 38].
Rabaey và cộng sự đã chứng minh rằng các chất truyền điện tử trung gian có
thể đƣợc vi sinh vật trong MFC tự sản xuất, ví dụ nhƣ pycoanin và một vài thành
phần tƣơng tự sản xuất bởi Pseudomonas aeruginosa. Chúng có thể vận chuyển
electron tới điện cực và sản xuất dòng điện trong MFC. Việc sản xuất nồng độ cao
chất truyền điện tử trung gian bằng cách nuôi cấy hỗn hợp có P. aeruginosa là loài
chủ yếu, trong thiết kế MFC sử dụng ferricyanide ở cathode ( thay cho oxy), sản
xuất 3.1 tới 4.2 W/m
2
trong MFC [38, 59]. Hình 3: Hai dạng thiết kế MFC [38]