ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
PHẠM THỊ QUỲNH LAI Tên đề tài:
TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN
SẢN XUẤT CHẤT ỨC CHẾ ENZYM
α
- GLUCOSIDASE
TỪ ASPERGILLUS ORYZAE T6 CHO CHẾ BIẾN THỰC PHẨM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Hệ chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm
Khoa : CNSH & CNTP
Lớp : 42 - CNTP
Khoá học : 2010 – 2014
Hệ đào tạo : Hệ chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm
Khoa : CNSH & CNTP
Lớp : 42 - CNTP
Khoá học : 2010 – 2014
Giảng viên hướng dẫn: 1. ThS. Nguyễn Đức Tiến
Viện cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch
2. ThS. Trần Thị Lý
Khoa CNSH & CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
Thái Nguyên, năm 2014
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận, Tôi xin trân
trọng cảm ơn bộ môn
Nghiên cứu phụ phẩm và Môi trường Nông nghiệp- Viện
Cơ điện Nông nghiệp và Bộ môn Công nghệ Sau thu hoạch
đã tạo điều kiện để
tôi hoàn thành khóa luận này.
Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy ThS. Nguyễn Đức Tiến
và cô ThS. Trần Thị Lý đã hướng dẫn tôi tận tình và chu đáo trong suốt thời gian
học tập và thực hiện bản khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn quan quản lý và các nhân viên đang làm việc tại
bộ môn
Nghiên cứu phụ phẩm và Môi trường Nông nghiệp- Viện Cơ điện
Nông nghiệp
Bảng 4.9 Bảng thiết kế ma trận 41
Bảng 4.10 Kết quả thiết kế ma trận 42
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cấu tạo của enzyme α - glucosidase 5
Hình 2.2 Cấu trúc không gian của enzyme α - glucosidase 5
Hình 2.3 Ảnh hưởng của chất AGIs đến quá trình trao đổi đường 6
Hình 2.4 Aspergillus oryzae (Cơ quan sinh sản vô tính) 14
Hình 2.5 Sản phẩm đậu đen lên men và sản phẩm đậu đen lên men có
hoạt chất AGIs 20
Hình 4.1 Phân tích phương sai ANOVA của mô hình tối ưu lên men 43
Hình 4.2 Phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng các yếu tố tới khả năng
sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryaze T6 43
Hình 4.3 Tương tác giữa độ ẩm với nhiệt độ tới khả năng sinh hoạt chất
AGIs của chủng A.oryzae T6 44
Hình 4.4 Tương tác giữa thời gian và độ ẩm tới khả năng sinh hoạt chất
AGIs của chủng A.oryzae T6 45
Hình 4.5 Tương tác giữa thời gian và nhiệt độ tới khả năng sinh hoạt chất
AGIs của chủng A.oryzae T6 46 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
trong cơ thể người 5
2.4.2.1. Hoạt chất AGIs tổng hợp bằng hóa học 7
2.4.2.2. AGIs tổng hợp tự nhiên 8
2.4.3. Tính an toàn của hoạt chất AGIs 11
2.4.3.1. Tính an toàn của hoạt chất AGIs đối với các enzyme tiêu hóa 11
2.4.3.2. Tính an toàn của của chất AGIs đối với người tiểu đường và béo phì 11
2.4.3.3. Tính an toàn về độc tố cấp tính 12
2.4.3.4. Tính an toàn về độc tố mãn tính 12
2.5. Giới thiệu về A.oryzae 12
2.5.1. Đặc điểm phân loại A.oryzae 13
2.5.2. Nguồn dinh dưỡng A.oryzae 14
2.6. Qúa trình Lên men của chủng A.oryzae 15
2.6.1. Lên men bề mặt 16
2.6.2. Nguyên liệu cho quá trình lên men 16
2.6.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bề mặt A.oryzae 17
2.7. Tình hình nghiên cứu, thử nghiệm và ứng dụng AGIs 19
2.7.1. Tình hình nghiên cứu, thử nghiệm AGIs từ đậu lên men trên thế giới . 19
2.7.2. Tình hình nghiên cứu, thử nghiệm và ứng dụng hoạt chất AGIs từ đậu
lên men ở Việt Nam 21
Phần 3 ĐỐI TƯỢNG,NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
3.1. Đối tượng nghiên cứu 23
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 23
3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng 23
3.3.1. Hóa chất 23
3.3.2. Thiết bị sử dụng 23
3.4. Nội dung nghiên cứu 24
3.4.1. Nghiên cứu quy trình lên men sinh hoạt chất AGIs bởi chủng A.oryzae
T6 24
3.4.1.1. Xác định pH môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng
4.1.2. Nghiên cứu xác định độ ẩm môi trường đến khả năng sinh hoạt chất
AGIs của chủng A.oryzae T6 32
4.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình lên men đến khả năng sinh
AGIs của chủng A.oryzae T6 33
4.1.4. Ảnh hưởng của độ thoáng khí trong quá trình lên men đến khả năng
sinh AGIs của chủng A.oryzae T6 34
4.1.5. Ảnh hưởng lượng giống nấm mốc ban đầu đến khả năng sinh AGIs của
chủng A.oryzae T6 35
4.2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu của môi trường đế khả năng sinh hoạt
chất AGIs của chủng A.oryzae T6 36
4.1.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của
chủng A.oryzae T6 38
4.2.Giải bài toán tối ưu 39
Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47
5.1. Kết luận 47
5.2. Kiến nghị 47
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
1
Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ăn uống là một nhu cầu thiết yếu của con người. Tuy nhiên việc ăn
uống không khoa học có thể dẫn con người đối mặt với nhiều nguy cơ khác
nhau, đặc biệt trong số đó con người phải đối mặt với nhiều căn bệnh mãn
tính như bệnh béo phì, tim mạch, ung thư,…Trong đó phải kể đến bệnh đái
tháo đường (ĐTĐ).
Theo dự báo của Hiệp hội đái tháo đường Quốc tế IDF,trong một thập
xuất thực phẩm chức năng”do Nguyễn Đức Tiến làm chủ nhiệm đề tài, được
sự đồng ý của chủ trì đề tài, Bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và Môi trường
Nông nghiệp- Viện Cơ điện Nông nghiệp và Bộ môn Công nghệ Sau thu
hoạch. Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện lên men sản xuất hoạt chất ức chế
AGIs, từ đó chọn ra các yếu tố quan trọng để thực hiện quá trình tối ưu nhằm
tạo ra hoạt tính ức chế cao cho chế biến thực phẩm.
Từ những lý do trên tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Tối ưu hóa các
điều kiện lên men sản xuất chất ức chế Enzym α- glucosidase từ
Aspergillus oryzae T6 cho chế biến thực phẩm”
1.2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu quá trình lên men (nhiệt độ, pH, độ ẩm, độ thoáng khí,tỷ lệ
nguyên liệu bổ sung, thời gian lên men và lượng nấm mốc ban đầu. Từ đó tối
ưu hóa điều kiện lên men để lượng hoạt chất ức chế Enzym α - glucosidase
tạo ra là lớn nhất làm cơ sở cho việc sản các sản phẩm chức năng.
1.3. Yêu cầu nghiên cứu
- Xác định được ảnh hưởng các điều kiện lên men cho sinh tổng hợp
hoạt chất AGIs: pH, nhiệt độ, độ ẩm, độ thoáng khí, lượng mốc bổ sung, tỷ lệ
cám gạo, thời gian.
- Tối ưu điều kiện lên men bằng phần mềm Desgin Expert 7.0.
3
Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về thực phẩm chức năng
Khái niệm thực phẩm chức năng (functional food) được người Nhật sử
dụng đầu tiên trong những năm 1980 để chỉ những thực phẩm chế biến có
chứa những thành phần tuy không có giá trị dinh dưỡng nhưng giúp nâng cao
sức khoẻ cho người sử dụng. Theo Viện Khoa học và Đời sống quốc tế
(International Life Science Institute - ILSI) thì "thực phẩm chức năng (TPCN)
là thực phẩm có lợi cho một hay nhiều hoạt động của cơ thể như cải thiện tình
trạng sức khoẻ và làm giảm nguy cơ mắc bệnh hơn là giá trị dinh dưỡng mà
thức, phương thức và mới cả về quản lý [12].
2.2. Enzyme α- glucosidase
Enzyme α - glucosidase là một enzyme có hoạt tính exohydrolysis từ
đầu khử đến đầu không khử của oligosaccharides chứa các α - D - glucose
nối với nhau bằng liên kết 1 - 4 glycosides. Enzyme α - glucosidase có thể
có nhiều nguồn gốc khác nhau: Từ vi khuẩn, nấm mốc, đường tiêu hóa
động vật Việc khác nhau về nguồn gốc α - glucosidase có thể dẫn đến sự
khác biệt về pH hoạt động, khoảng nhiệt độ hoạt động, hoạt độ của
enzyme Những thông số cơ này chỉ có thể thu nhận được qua thực
nghiệm trên một enzyme α - glucosidase cụ thể. Cấu tạo của enzyme α -
glucosidase tương tự như của maltose
5
Hình 2.1 Cấu tạo của enzyme α-glucosidase
Enzyme α-glucosidase được phân chia theo cấu trúc chính gồm có gen
mã hóa lysosomal alpha-glucosidase dài khoảng 20 kb.
Hình 2.2 Cấu trúc không gian của enzyme α-glucosidase
2.3.Hoạt chất AGIs
2.3.1. Cơ sở khoa học của việc sử dụng hoạt chất đến quá trình trao đổi
đường trong cơ thể người
Bệnh ĐTĐ haycòn gọi là bệnh tiểu đường, là một bệnh do rối loạn
chuyển hóacacbonhydrate khi hoocmon insulin của tuyến tụy bị thiếu hay
giảm tác động vào cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu cao hơn 7
mmol/l.ĐTĐ liên quan đến rối loạn chuyển hóa glucid, lipid, protid và điện
giải. Những rối loạn này thường dẫn tới hôn mê và tử vong trong thời gian
6
ngắn nếu không được điều trị kịp thời. Tăng đường huyết kéo dài sẽ gây ra rất
nhiều biến chứng nguy hiểm ở nhiều phủ tạng đặc biệt là mắt, bệnh tim mạch
vành, tai biến mạch máu não, suy thận…[35].
ứ
c ch
ế
Glucose Glucose Fructose
Glucose
Glucose huyết
Amylase
7
Từ các nghiên cứu trên thế giới đã làm sáng tỏ cơ sở khoa học của việc
sử dụng hoạt chất AGIs để điều trị bệnh đái tháo đường như sau: Tinh bột
hoặc đường (sucroza) là một chất dinh dưỡng quan trọng còn được gọi là
cacbonhydrat. Cấu tạo của nó gồm hai hay nhiều monosaccharit (glucoza
hoặc fructoza). Để cơ thể hấp thụ được, cacbonhydrate sẽ bị phân cắt hoàn
toàn thành các monosaccharide nhờ hệ thống enzyme tiêu hóa. Dưới tác dụng
của enzyme α - glucosidase chúng sẽ phân cắt thành các monosaccharide tại
ruột non.Chất AGIs có thể kìm hãm hoạt tính enzyme α-glucosidase nên ngăn
cản sự tạo thành monosaccharide từ disaccharide làm cho quá trình tổng hợp
insullin diễn ra dễ dàng hơn[23].
Enzyme α - glucosidase (α - glucosidase glucohydrolase) là một exo -
enzyme thủy phân hydratcacbon và giải phóng ra α - glucosidase từ đầu
không khử của cơ chất. Enzym này phổ biến trong vi sinh vật, thực vật, mô
động vật. Các chất kìm hãm enzyme α - glucosidasetồn tại phổ biến như: Hợp
chất đa vòng polyhydroxylated N - substituted, polyhydroxylated
cycloalkenes và oligomers của các phân tử giống như phân tử đường [36].
2.3.2. Nguồnthu nhận AGIs
Hoạt chấtAGIs có thể tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như:
trích ly từ thực vật, động vật, tổng hợp bằng con đường hóa học hoặc bằng
50
lần lượt là 3,2; 0,84;
0,59µg/µl. Các nghiên cứu thử nhiệm trên chuột chứng minh salacinol có khả
năng kìm hãm sự tăng nồng độ đường trong máu mạnh hơn arbose. Một vài
nghiên cứu lâm sàng cho thấy salacinol có tác dụng kiểm soát lượng đường
trong máu. Tại Nhận Bản, Salacinol oblonga đã được bán như một thực phẩm
chức năng và nó cũng được biết đến ở Mỹ với tên Saptrangi hay Ponkoranti
[32].Trong một nghiên cứu khác, Ye đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết
của dịch chiết một loại thảo mộc Trung Quốc có tên là Ramulus mori
(Sangzhi) trên chuột.
Kết quả cho thấy chuột bị gây tiểu đường bằng alloxan được uống dịch
chiết này đã làm giảm lượng đường huyết sau ăn, ổn định lượng đường trong
9
máu lúc đói.Tuy nhiên chất chiết này không gây ảnh hưởng đến sự hất thụ
glucose trong ruột non ở chuột bình thường [31].
Li và cộng sự đã công bố dịch chiết của hoa lựu Punica granatum có khả
năng kìm hãm α - glucosidase với giá trị IC
50
=1,8µg/ml. Các thử nhiệm trên
động vật cho thấy, khi cho chuột uống dịch chiết này thì lượng đường trong
máu của lô chuột bị bệnh tiểu đường đã giảm đáng kể còn ở lô chuột bình
thường thì không bị ảnh hưởng [17].
Năm 2007, Nilubon và cộng sự đã công bố dịch chiết bằng methanol từ
lá cây hoa sữa phơi khô (Alstonia scholaris) có khả năng kìm hãm α -
glucosidase ruột non chuột. AGIs đã được tìm thấy trong dịch chiết này là 3 -
O-β-d- xylopyranosyl .
Từ lâu đời nhân dân ta đã biết sử dụng lá vối (Cleistocalyx operculatus)
hay nụ vối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay hãm lấy nước
uống hàng ngày. Các kết quả nghiên cứu về vối cho thấy trong lá và nụ cây
vối chứa tanin, khoáng chất và vitamin … Gần đây, các nhà khoa học của
Saccharomyces cerevisiae Đã được nghiên cứu cho sinh tổng hợp chất
AGIs [18;33;17;34]. Một số AGIs phổ biến như: Acarbose - một pseudo -
tetrasaccharite được thu nhận từ canh trường lên men Actinoplanes spp. SE
50. Validamycin A từ Streptomyces hygroscopicus var. limoneus. Adiposin,
trestatin B, cyclophellitol và CKD - 711 được lấy từ Streptomyces calvus TM
- 521, Streptomyces dimorphogenes vàPhellinus spp [34]. Tuy nhiên AGIs từ
A.oryzae là hướng nghiên cứu mới.
Phần lớn các chất AGIs từ vi sinh vật có cấu trúc tương tự gốc
pyranosyl củaα-glucosidase,như: Acarbose và Voglibose từ vi sinh vật.
Acarbose (pseudotetrasaccharide được tách chiết từ dịch lên men loài
Actinoplanes SE50) là AGIs được tìm ra đầu tiên trên thế giới với giá trị IC
50
= 0,5µM [34]. Acarbose không làm tăng tiết insulin, không làm giảm glucose
11
trong máu lúc đói khi dùng điều trị ở người.Sau acarbose, năm 1984, Kameda
và cộng sự đã tìm ra Voglibose- AGIs từ vikhuẩn Streptomyces hygroscopicus
[18]. Năm 2000, các nhà khoa học Hàn Quốc đã phát hiện cyclo (dehydroala -
L-Leu), một AGIs từ dịch chiết của Penicillium sp. F 70614 có khả năng
AGIs của nấm men và của ruột non lợn [21].
2.3.3. Tính an toàn của hoạt chất AGIs
Trong phần giới thiệu về các sản phẩm hoạt chất AGIs từ nấm mốc
Aspergilluslên men đậu, Nippon cũng đã dẫn hàng loạt các nghiên cứu khoa
học của Fujita chứng minh về hiệu quả và tính an toàn của hoạt chất AGIs
chiết từ đậu lên men bởi nấm mốc thực phẩm [24].
2.3.3.1. Tính an toàn của hoạt chất AGIs đối với các enzyme tiêu hóa
Có nhiều công trình nghiên cứu chứng minh hoạt chất AGIs từ đậu lên
men là an toàn qua các thử nghiệm trên chuột và người. Hoạt chất AGIs được
sử dụng trước bữa ăn để cản trở quá trình thuỷ phân cacbonhydrat trong ruột
non. Các nghiên cứu của Hiroyuki Fujita và cộng sự cho thấy chất AGIs từ
ĐTĐ, để xác nhận sự an toàn, 9 người khỏe mạnh đã được uống 3g/ngày
trong 12 tuần. Kết quả là không có sự thay đổi về đường huyết và các chỉ số
hóa sinh máu, cân nặng… Điều này chứng minh hoạt chất AGIs từ đậu lên
men không có độc cấp tính [13].
2.3.3.4. Tính an toàn về độc tố mãn tính
Để đánh giá hoạt tính hoạt chất AGIs trong chế phẩm, 18 bệnh nhân
ĐTĐ typ 2 đã được thử nghiệm với liều 0,9 g/ngày (0,3g/bữa ăn) trong 6
tháng. Kết quả cho thấy hàm lượng đường máu ban đầu là 9,31 ± 0,71 mmol/l
và HbA1c: 10,24 ± 0,58%. Sau 6 tháng thử nghiệm, hàm lượng đường máu
giảm còn 8,61 ± 0,66 mmol/l, HbA1c: 8,96 ± 0,3%, chỉ số mỡ máu và tổng
cholesterol, triglycerit cũng giảm. Hơn nữa, enzym tiêu hóa không bị ảnh
hưởng trong suốt quá trình thử nghiệm [14;26].
2.4. Giới thiệu về A.oryzae
13
2.4.1. Đặc điểm. phân loại A.oryzae
Theo Từ điển nấm học, nấm mốc Aspergillus oryzae được phân loại như
sau:GiớiFungi, ngànhAscomycota,lớpEurotiomycetes, bộ Eurotiales, họ
Trichocomaceae, giống Aspergillus, loàiAspergillus oryzae (Kitamoco, 2002).
Theo khóa phân loại của Klich: A.oryzaecó đặc điểm phát triển khác
nhau khi nuôi cấy trên các môi trường czapek, czapek yeast agar (CYA25),
czapek yeast agar 20% sucrose (CY20S), malt extract agar (MEA). Quan sát
trên kính hiển vi ở vật kính 10 và 40 cho thấy đặc điểm hình thái của A.
oryzae như: Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất
mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh nhiều và có vách ngang chia sợi có
các cuống đính bào tử (dài 1 - 2 mm), ở đó có cơ quan sinh sản vô tính; phía
đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng, bọng đỉnh giá có hình quả lê,
hình chùy hoặc hình cầu đường kính từ (8) 22-50 (90) µm; cuống sinh bào tử
nhẵn hoặc sằn sùi, kích thước từ 500-2500 (5000) µm. Bào tử trần hình cầu
đến hình trứng, nhẵn đến có gai nhẹ, đường kính (3,5) 4-8,5 (10) µm, có màu
vàng lục hay màu vàng hoa cau. A.oryzae tiết ra môi trường các enzyme thủy
chất dinh dưỡng.
a. Nguồn cacbon
A.oryzae có thể sử dụng nguồn thức ăn cacbon khác nhau và không đòi
hỏi nghiêm ngặt đối với các loại thức ăn cacbon. Nhiều loài nấm mốc còn có
khả năng đồng hóa các hợp chất hữu cơ rất bền vững hoặc rất độc đối với
nhiều sinh vật khác (các hợp chất n - ankal, ankaloid, phenol, nhiều chất
kháng sinh…) Đối với nguồn thức ăn phức tạp như: Xylan, tinh bột, xenllulo,
kitin… Trước hết A.oryzae phải sinh ra các enzyme để phân hủy các hợp chất
này thành các hợp chất đơn phân tử sau đó mới đồng hóa được chúng.
15
b. Nguồn nitơ
Các loài A.oryzae khác nhau có nhu cầu khác nhau đối với nguồn thức
ăn nitơ. A.oryzae thường có khả năng sử dụng cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ.
c. Các nguyên tố khoáng
Bằng các phương pháp phân tích quang phổ, người ta đã xác định được
tất cả các chất khoáng có trong tế bào nấm mốc. Về các nguyên tố đại lượng,
có thể kể đến: S, P, K, Ca, Mg, Fe, chúng thường chiếm từ vài phần nghìn đến
vài phần trăm trọng lượng khô. Các nguyên tố vi lượng có: Mn, Mo, Zn, Cu,
Co, Ni, B. Hàm lượng các nguyên tố khoáng trong tế bào nấm mốc thay đổi
tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường, thời gian nuôi cấy.
Đặc điểm của giống A.oryzae là giàu các enzyme thủy phân nội bào và
ngoại bào (amylase, protease, pectinase,…) ta rất hay gặp chúng ở các kho
nguyên liệu, trong các thùng chứa bột, gạo… Đã hết nhưng không được rửa
sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lõi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có
khi thành lớp mốc, có màu sắc vàng, đen… Màu do bào tử già có màu sắc.
Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận
lợi sẽ mọc thành mốc.
2.5.Qúa trình Lên men của chủng A.oryzae
Lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học được tiến hành do hoạt
giới hiện này có khoảng trên 1,000 loại đậu với nhiều đặc điểm khác nhau từ
hạt đậu có kích thước nhỏ nhất như hạt đậu Hà lan (pea) cho tới lớn nhất
giống trái anh đào (cherry), hạt đậu có nhiều màu sắc như đỏ, vàng, xanh, nâu
và màu đen.
Đậu đen có tên khoa học là Vigna cylindrical Skeels hay Vigna
unguiculata walp.subsp.cylindrica (L) Verdc. Có hai loại đậu đen: Loại vỏ
đen ruột trắng và loại vỏ đen ruột xanh thường gọi là đậu đen xanh lòng (loại
Copyright: Tài liệu đại học ©