MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục đích nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2
5. Phương pháp nghiên cứu 3
6. Điểm mới của đề tài 3
NỘI DUNG 4
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter 4
1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Gluconacetobacter 5
1.3. Bacterial cellulose (BC) 5
1.3.1. Cấu trúc 5
1.3.2. Một số tính chất của màng BC 6
1.3.3. Quá trình tổng hợp BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter 6
1.3.4. Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter 8
1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo màng BC 9
1.4.1. Nguồn cacbon 9
1.4.2. Nguồn nitơ 9
1.4.3. Nguồn dinh dưỡng khoáng 10
1.4.4. Các chất kích thích sinh trưởng 10
1.4.5. Điều kiện nuôi cấy 11
1.4.5.1. Độ pH 11
1.4.5.2. Nhiệt độ 11
1.4.5.3. Độ thông khí 11
1.4.5.4. Thời gian nuôi cấy 11
1.4.5.5. Ảnh hưởng giữa bề mặt và thể tích dịch nuôi cấy (tỷ lệ S/V) 12
1.5. Ứng dụng của màng BC 12
2.2.2.4. Xác định khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton 24
2.2.2.5. Xác định khả năng tổng hợp cellulose 24
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh
dưỡng khoáng đến khả năng tạo màng BC của chủng
Gluconacetobacter 25
2.2.3.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường 25
2.2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ 25
2.2.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng
khoáng 25
2.2.4. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng BC 26
2.2.5. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 26
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh màng Bacterial
cellulose trên một số nguồn nguyên liệu 27
3.1.1. Phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng sinh màng BC 27
3.1.1.1. Làm giàu mẫu nguyên liệu 28
3.1.1.2. Phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng sinh màng
BC 28
3.1.2. Nghiên cứu khả năng tạo màng BC của một số chủng
Gluconacetobacter 31
3.1.3. Tuyển chọn chủng có khả năng tạo màng BC dai, mỏng 34
3.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng tới khả năng tạo màng BC từ
chủng G. xylinus BHN
2
36
3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose tới khả năng lên men tạo màng
BC từ chủng G. xylinus 36
3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH
4
)
3.2.7.2. So sánh khả năng tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên
môi trường nước dừa và môi trường nước gạo thay thế nước
dừa 52
3.3. Khảo sát định hƣớng ứng dụng cho sản phẩm màng BC 53
3.3.1. Khảo sát khả năng bảo quản thực phẩm và thay thế túi ni lông 53
3.3.2. Ứng dụng bảo quản thực phẩm và thay thế túi ni lông 54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57
1. Kết luận 58
2. Kiến nghị 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO 60
DANH MỤC HÌNH, BẢNG, BIỂU ĐỒ
Hình 1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter 4
Hình 1.2. Quá trình tổng hợp cellulose trong tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter 7
Hình 1.3. Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter 8
Hình 1.4. Màng sinh học dễ bong, không gây đau rát trong điều trị bỏng 19
Hình 3.1. Qui trình phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter 27
Hình 3.2. Một số mẫu màng BC thu được sau khi làm giàu nguyên liệu 28
Hình 3.3. Vòng phân giải CaCO
thế nước dừa 52
Hình 3.19.A. Cà chua bọc bằng màng BC 56
Hình 3.19.B. Cà chua hỏng sau 7 ngày 56
Hình 3.20.A. Cà chua bọc túi nilông hỏng sau 12 ngày 56
Hình 3.20.B. Cà chua bọc hỏng màng BC hỏng sau 23 ngày 56
Hình 3.21.A. Roi hỏng sau 4 ngày 56
Hình 3.21.B. Roi hỏng sau 12 ngày 56
Hình 3.22.A. Bảo quản dưa chuột 57
Hình 3.22.B. Dưa chuột hỏng sau 5 ngày 57
Hình 3.23.A. Cam hỏng sau 12 ngày 57
Hình 3.23.B. Cà rốt hỏng sau 5 ngày 57
Bảng 1.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC 9
Bảng 1.2. Ứng dụng cellulose vi khuẩn trong nhiều lĩnh vực khác nhau 14
Bảng 3.1. Một số đặc tính của màng BC 34
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến màng BC 36
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH
4
)
2
SO
4
đến khối lượng tươi của màng
BC 38
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH
2
PO
4
đến khối lượng tươi của màng BC.40
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO
2
PO
4
và khối lượng màng BC 41
Biểu đồ 3.4. Mối tương quan giữa hàm lượng MgSO
4
.7H
2
O
và khối lượng màng
BC 42
Biểu đồ 3.5. Khối lượng màng BC qua các thời gian nuôi cấy 44
Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa tới khối lượng màng BC 48
1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong quá trình phát triển của lịch sử nhân loại, con người không
ngừng tìm kiếm, nghiên cứu những nguồn nguyên liệu mới. Ngày nay, nhờ có
sự phát triển mạnh mẽ như vũ bão của khoa học công nghệ mà việc nghiên
cứu, tìm kiếm trở nên dễ dàng hơn. Các nhà khoa học đã phát hiện ra rất
nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau và ứng dụng chúng trong thực tiễn cuộc
sống. Một trong những nguồn nguyên liệu đã và đang được quan tâm gần đây
đó là cellulose vi khuẩn hay Bacterial cellulose (BC).
BC được cấu tạo bởi những chuỗi polymer 1,4 glucopyranose mạch
thẳng được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn
khả năng sinh màng BC. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng,
sự đa dạng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng BC.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh màng Bacterial
cellulose trên một số nguồn nguyên liệu
3.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng
BC của vi khuẩn G. xylinus BHN
2
3.3. Khảo sát định hướng ứng dụng cho sản phẩm màng BC
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
4.1. Đối tượng nghiên cứu: các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
4.2. Phạm vi nghiên cứu: khả năng lên men tạo màng của các chủng
Gluconacetobacter, ứng dụng trong thực tiễn
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
5.1. Phương pháp vi sinh
3
5.2. Phương pháp hóa sinh
5.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng
khoáng đến khả năng tạo màng BC của chủng Gluconacetobacter
5.4. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng BC
5.5. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
6. Điểm mới của đề tài
Đề tài tập trung thực hiện từ nuôi cấy, tuyển chọn, tìm môi trường dinh
dưỡng nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn G. xylinus BHN
2,
đồng thời
định hướng ứng dụng cho chủng nghiên cứu.
kéo dài, đôi khi lại có dạng phân nhánh). Tế bào thường được tìm thấy nhiều
trong dịch hoa quả, giấm, dịch rượu, trong đất…[17].
Hình 1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter
Khuẩn lạc của Gluconacetobacter có kích thước nhỏ (đường kính
khuẩn lạc đạt 1 - 2mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc
5
lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc
nhẵn.
1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Gluconacetobacter
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25 - 35
0
C, pH = 4 –
6. Vì Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp nên người ta thường
bổ sung thêm axit acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn
lạ [8].
Các đặc điểm sinh hóa dùng định danh của Gluconacetobacter bao
gồm: oxy hóa ethanol thành axit acetic, CO
2
, H
2
O; phản ứng catalase dương
tính; không tăng trưởng trên môi trường Hoyer; chuyển hóa glucose thành
axit; chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton; không sinh sắc tố nâu; tổng
hợp cellulose [3].
1.3. Bacterial cellulose (BC)
1.3.1. Cấu trúc
BC có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (PC –
plant cellulose). Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme β-1,4
2
, B
12
… và các
chất kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của
mình bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một
phần để cơ thể sinh trưởng và phát triển, một phần để tổng hợp cellulose và
thải ra môi trường thành các sợi tơ nhỏ phát triển ngày càng dài hướng từ đáy
lên bề mặt trong môi trường nuôi cấy [22]. Thiaman (1962) đã giải thích cách
tạo thành cellulose như sau: các tế bào G. xylinus khi sống trong môi trường
lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ đường
glucose, kết hợp đường với axit béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào.
Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng
với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose.
7
Hình 1.2. Quá trình tổng hợp cellulose trong tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter
Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được
điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều
loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hòa ( hình 1.3).
Theo Alaban C.A và cộng sự (1967) các enzyme tham gia vào quá trình
sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn gồm [15]:
dàng hơn so với khi ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose.
9
1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo màng BC
1.4.1. Nguồn cacbon
Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử
enzyme, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Chính vì vậy, những hợp
chất hữu cơ có chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống của vi sinh
vật. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC được thể
hiện ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC
Nguồn cacbon
Monosaccharide
Năng suất
tổng hợp
cellulose
Nguồn cacbon
Disaccharide
Năng suất
tổng hợp
cellulose
D-Glucose
D-Fructose
D-Galactose
D-Xylose
D-Arabinos
D-Sorbose
100
92
15
2
SO
4
, NH
4
NO
3
, nguồn nitơ hữu cơ là peptone, cao thịt, cao
nấm men [31].
10
1.4.3. Nguồn dinh dưỡng khoáng
Phospho bao giờ cũng chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố
khoáng của tế bào vi sinh vật. Phospho có mặt ở trong hầu hết các thành phần
của tế bào. Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng phospho, người ta sử dụng các loại
phospho vô cơ như KH
2
PO
4
, K
2
HPO
4
, KNO
3
…[31]. Việc bổ sung phosphat
(nhất là phosphat kali) vào các môi trường dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra
tính đệm của môi trường [31].
Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng có vai trò ảnh hưởng đến
sinh trưởng của vi khuẩn Gluconacetobacter và quá trình hình thành màng
khoảng 25 - 30
0
C. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ
đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm [19].
1.4.5.3. Độ thông khí
Vi khuẩn Gluconacetobacter là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc [19]. Do đó,
điều kiện tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong
thực tế độ thông khí quyết định đến năng suất tổng hợp BC.
1.4.5.4. Thời gian nuôi cấy
Trong môi trường dinh dưỡng lỏng, sau 24 giờ nuôi cấy sẽ xuất hiện
một lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên. Sau 36 –
48 giờ, hình thành một lớp trong và ngày càng dày.
Theo Thesis Holmes (2004) [37], hàm lượng glucose trong môi trường
giảm nhất sau 150 giờ nuôi cấy. Sau khi glucose trong môi trường hết thì vi
khuẩn bắt đầu sử dụng axit gluconic và 5 – keto axit gluconic trong quá trình
trao đổi chất. Tác giả cho rằng sau 6 ngày độ kết tinh của màng đạt đến trạng
thái tốt nhất.
12
1.4.5.5. Ảnh hưởng giữa bề mặt và thể tích dịch nuôi cấy (tỷ lệ S/V)
Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự khả năng hình thành
màng tốt nhất ở tỷ lệ S/V = 0,8 với chiều cao môi trường trong dụng cụ lên
men h =1,25 cm [10].
1.5. Ứng dụng của màng BC
Màng BC của chúng đã thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học
trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: trong công nghệ môi
trường, các nhà khoa học đã dùng màng BC làm màng phân tách để xử lý
nước, làm chất mang đặc biệt cho pin và tế bào năng lượng Brown. E. (2007)
[21], Jonas và Farad (1998) [29] đã dùng màng như một chất đặc biệt để biến
đổi độ nhớt, làm các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học.
dùng trong trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998),
Czaija và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da
cho phụ nữ [26], [29].
1.5.3. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác
Màng BC (cellulose vi khuẩn) được sử dụng thay thế cho cellulose thực
vật trong sản xuất cellulose có độ tinh khiết cao, góp phần giảm bớt nguồn
nguyên liệu từ thực vật (Sherif. 2008) [35]. Những nghiên cứu tìm nguồn thay
thế bằng cellulose vi khuẩn, Barbara et al., (2008) [20] tạo ra giấy từ cellulose
vi khuẩn với sự vượt trội về độ dẻo dai, bền, chắc. Sản xuất giấy điện tử từ
cellulose vi khuẩn (Jay shah, Brown. M. R. 2005) [28]
Cellulose vi khuẩn hiện được mong đợi là vật liệu hóa sinh mới với
những ứng dụng thú vị và đang tiếp tục nghiên cứu, phát triển sản xuất hàng
loạt. Các lĩnh vực ứng dụng cellulose vi khuẩn được trình bày trong bảng 1.2
14
Bảng 1.2. Ứng dụng cellulose vi khuẩn trong nhiều lĩnh vực khác nhau
Lĩnh vực
Sản phẩm
Thực phẩm
Thực phẩm tráng miệng (Nata de coco, kem, kẹo, snack, khoai tây
chiên ít calorie)
Thực phẩm giảm cân
Thịt nhân tạo
Bao bọc thịt và xúc xích
Giảm huyết thanh cholesterol
Thuốc rượu Kombucha hay trà Manchurian
Y tế
Màng trị thương, màng trị phỏng
Tác nhân vận chuyển thuốc
Công nghiệp
giấy
Giấy lưu trữ hồ sơ
Giấy làm tiền tệ
Giấy điện tử
Máy móc tự
động và máy
bay
Thân xe hơi
Yếu tố cấu trúc cho máy bay
Màng bao tàu vũ trụ
Phòng thí
nghiệm
Giá thể nuôi cấy mô tế bào thực vật
Lĩnh vực khác
Màng composite
15
1.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng BC hiện nay
1.6.1. Trên thế giới
Vi khuẩn Gluconacetobacter và màng BC của chúng đã thu hút được
sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều
lĩnh vực: trong công nghệ môi trường, trong công nghiệp giấy, trong công
nghiệp thực phẩm…[19]. Các nghiên cứu hiện nay về màng BC trên thế giới
đã tập trung vào vấn đề sản xuất và ứng dụng các sản phẩm từ màng BC vào
các lĩnh vực khác nhau.
Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn G. xylinus và những ứng dụng của
nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown, 1999, [22],
[23], [24] dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước,
dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown,
cấu trúc giữa màng BC với collagen [26]. Năm 2007, Neelobon và cộng sự
[31] đã nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng hình
thành màng trong điều kiện cụ thể là nuôi tĩnh, nuôi lắc và nuôi trong
bioreactor; Sirlene M. Costa và cộng sự nghiên cứu đặc tính vật lý của màng,
cấu trúc sợi cellulose của màng trong các điều kiện nuôi cấy, ứng dụng trong
sản xuất giấy [25]; Wojciech K. và cộng sự nghiên cứu đặc tính, cấu trúc
màng cellulose ứng dụng làm da nhân tạo [39]. Năm 2008, Barbara Surma-
S‟lusarska và cộng sự [20] đã đưa ra phương pháp chế tạo màng và nghiên
cứu đặc điểm màng, ảnh hưởng của nguồn cacbon, đường glucose, manitol và
xylose đến quá trình tạo màng, cấu trúc sợi cellulose của màng và ứng dụng
trong sản xuất giấy. Hầu hết các tác giả nước ngoài nghiên cứu theo hướng
sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn, ứng dụng của màng BC trong y học, công
nghiệp giấy, trong chế biến thực phẩm.
Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là
dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Czaja và cs (2006), sử dụng màng
17
BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt. Các tác giả
Jonas và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo,
làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [26], [29].
1.6.2. Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về Gluconacetobacter
và
màng BC còn khá mới mẻ. Các công trình nghiên cứu mới chỉ quan tâm tới
quá trình tạo màng, đặc tính và cấu trúc của màng. Về ứng dụng thực tiễn,
mới chỉ được ứng dụng trong chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng, và
được ứng dụng trong sản xuất thạch dừa [3], [6], [7], [10], [14]. Hiện nay việc
nghiên cứu tìm môi trường tối ưu cho quá trình tạo màng của vi khuẩn
Gluconacetobacter chưa được thực hiện. Hầu như có rất ít các nghiên cứu
Việc nghiên cứu và ứng dụng sản phẩm màng BC từ chủng G. xylinus
ngày càng được nhiều tác giả quan tâm. Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn
Thanh, Trưởng bộ môn Vi Sinh – Ký Sinh, trường Đại học Y Dược học
Tp.HCM đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học dầu mù u bằng
phương pháp lên men. Màng BC có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và
trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học, có thể thay thế da
tạm thời. Với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn
gốc thiên nhiên không gây đau rát và không chứa các yếu tố gây kích ứng da
[6], chính vì vậy dùng màng sinh học để ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng
vết thương bỏng, tạo điều kiện che phủ sớm vết thương, qua đó, rút ngắn thời
gian điều trị và giảm thiểu sẹo xấu trên vùng bỏng sâu.
Gần đây, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung đã thu
nhận màng BC từ vi khuẩn G. xylinus, ứng dụng màng BC trong điều trị
bỏng. Công tác điều trị bỏng hiện đang sử dụng phương pháp cấy ghép, phẫu
thuật, hoặc dùng một số màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch,
màng chitossan, sử dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều
trị bỏng [11]. Theo tác giả Huỳnh Thị Ngọc Lan, màng trị bỏng sinh học BC
với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên
nhiên. Vì thế, nó không chứa các yếu tố nguy cơ như không có độc tố trực
Copyright: Tài liệu đại học ©