ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HUYỀN
Tên đề tài:
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THUỘC NHÓM AUXIN
ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO PHÔI HÓA PHỤC VỤ CHUYỂN GEN
CỦA MỘT SỐ GIỐNG SẮN (Manihot esculenta Crantz)KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Lớp : K42 CNSH
Khoa : CNSH - CNTP
Khoá học : 2010 – 2014
Giảng viên hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Anh Vũ
Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam
2. Th.S. Lương Thị Thu Hường
Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
Thái Nguyên, năm 2014
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
Viện Di truyền Nông nghiệp), TS. Nguyễn Anh Vũ người đã tận tình chỉ bảo và tạo
điều kiện giúp tôi hoàn thành quá trình thực tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn KS. Lê Ngọc Quỳnh cùng toàn thể cán bộ và
nhân viên phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật đã
hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, lời tri ân tới ThS. Lương Thị
Thu Hường đã tận chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong thời gian qua.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè,
những người luôn dành cho tôi những tình cảm tốt đẹp nhất, luôn hỗ trợ, giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không tránh khỏi những
sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp kiến của thầy cô và các bạn để đề tài
của tôi được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2014Sinh viên Nguyễn Thị Huyền
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của thế giới từ năm 2000-2011 13
Bảng 2.2. Diện tích, sản lượng và năng suất trồng sắn của Việt Nam qua các năm
2000-2013 14
Bảng 2.3. Các quốc gia phát triển nhiên liệu sinh học với quy mô lớn 16
Hình 3.3. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của NAA tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa 27
Hình 4.1. Ảnh hưởng của NAA tới khả năng tạo mô sẹo 33
Hình 4.2. Ảnh hưởng của 2,4D tới khả năng tạo mô sẹo 34
Hình 4.3. Ảnh hưởng của picloram tới khả năng tạo mô sẹo 36
Hình 4.4. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của các auxin ở công thức tối ưu tới khả năng
tạo mô sẹo 37
Hình 4.5. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của các auxin ở công thức tối ưu tới khả năng
tạo mô sẹo phôi hóa 40
Hình 4.6. Giống TMS60444 sau 2 lần cấy chuyển trong môi trường MMS 41
Hình 4.7. Giống KM98 – 7 sau 2 lần cấy chuyển trong môi trường 41
Hình 4.8. Giống sắn sau 4 lần cấy chuyển trong môi trường MMS 42
DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT2,4D
:
Axit 2,4 dicloro-phenoxiaxetic(2,4D)
2.1.2. Đặc điểm thực vật học 11
2.1.3. Đặc điểm một số giống sắn nghiên cứu 12
2.1.4. Thành phần dinh dưỡng và giá trị sử dụng 12
2.1.4. Tình hình sản xuất và tiêu thụ 13
2.1.5. Nhu cầu sắn cho nhiên liệu sinh học 16
2.2. Auxin và vai trò của auxin trong quá trình tạo mô sẹo 18
2.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen sắn 19
2.3.1. Trên thế giới 19
2.3.2. Tại Việt Nam 23
Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 24
3.2. Môi trường nuôi cấy 24
3.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 24
3.4. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 25
3.5. Nội dung nghiên cứu 25
3.6. Phương pháp nghiên cứu 25
3.6.1. Nội dung 1: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới
khả năng tạo mô sẹo 27
3.6.2. Nội dung 2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới
khả năng tạo mô sẹo phôi hóa 29
Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32
4.1. Kết quả ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới khả năng tạo mô sẹo 32
4.2. Kết quả ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới khả năng tạo mô sẹo
phôi hóa 37
4.2.3. Kết quả ảnh hưởng của picroram tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa 39
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43
5.1. Kết luận 43
5.2. Kiến nghị 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO 45
I. Tài liệu tiếng Việt 45
để duy trì mô hoặc để cảm ứng mô sẹo có khả năng sinh phôi. Tuy nhiên các chất
khác nhau (2,4-D, NAA, picloram…) và được sử dụng ở những nồng độ khác nhau
thì hiệu quả tạo mô sẹo không giống nhau trên các giống sắn. Chúng có thể kích thích
cũng có thể ức chế quá trình tạo mô sẹo [16]. Trong một nghiên cứu tạo mô sẹo của
E. Sofiari và cộng sự, 2,4D cho kết quả cao hơn so với NAA trên giống
TMS90853[16]. Ông cho rằng nên sử dụng 2,4D để tạo mô sẹo trong quá trình nuôi
cấy. Trong khi đó Jiu Liu và cộng sự lại sử dụng piclroram cho quá trình tạo mô sẹo
và mô sẹo phôi hóa và cho kết quả khá tốt trên giông TMS 60444 [24]. Các giống sắn
ở Việt Nam rất đa dạng và có nhiều giống tốt nhưng quá trình nghiên cứu về sắn liên
quan tới tạo mô sẹo hay chuyển gen còn rất nhiều khó khăn, hạn chế [1].
Do vậy vấn đề đặt ra hiện nay là cần tìm ra loại auxin cho hiệu quả tạo mô
sẹo, mô sẹo phôi hóa cao nhất phục vụ chuyển gen trên các giống sắn Việt Nam.
Xuất phát từ thực tiễn trên tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của
một số chất thuộc nhóm auxin đến khả năng tạo mô sẹo phôi hóa phục vụ
chuyển gen của một số giống sắn (Manihot esculenta Crantz)”.
1.2. Mục đích và mục tiêu nghiên cứu
1.2.1. Mục đích
- Khảo sát ảnh hưởng của NAA, 2,4D và picloram đến khả năng tạo mô sẹo
của giống sắn KM98 – 7 và giống TMS60444.
1.2.2. Yêu cầu
- Xác định ảnh hưởng của NAA, 2,4D và picloram đến sự hình thành mô
sẹo ở giống sắn KM98 – 7 và TMS60444
- Xác định ảnh hưởng của NAA, 2,4D và picloram đến sự hình thành mô
sẹo phôi hóa ở giống sắn KM98 – 7 và TMS60444
1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
- Thành công của nghiên cứu tạo tiền đề cho việc chuyển các gen phù hợp
cần thiết với mục đích khác nhau vào cây sắn Việt Nam.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Xây dựng được quy trình tạo mô sẹo phôi hoá phục vụ chuyển gen hiệu quả
phân cành, ngọn thân. Quả sắn có kích thước từ 1-1,5 cm, một quả thường có 3 hạt.
hạt sắn nặng từ 95-136 mg, màu nâu đen. Nhiệt độ thích hợp cho hạt sắn nảy mầm
là từ 25- 30
o
C [19]. Sắn dễ trồng, hợp nhiều loại đất, vốn đầu tư thấp, hợp khả năng
kinh tế với nhiều hộ gia đình nông dân nghèo, thiếu lao động tận dụng đất để lấy
ngắn nuôi dài. Sắn đạt năng suất cao và lợi nhuận khá nếu biết dùng giống tốt và
trồng đúng quy trình canh tác sắn bền vững [3].
Bên cạnh đó, sắn cũng có một số nhược điểm như trồng sắn làm kiệt đất, củ
sắn nghèo đạm và vitamin, có độc tố HCN trong sắn củ tươi, chế biến sắn gây ô
nhiễm môi trường [3].
2.1.3. Đặc điểm một số giống sắn nghiên cứu
Giống KM98 – 7
Giống KM98 – 7 được cung cấp bởi trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Cây Có
Củ - Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
Giống này là con lai chọn lọc của tổ hợp lai SM 1717 có mẹ là CM321-188,
(polycross) có nguồn gốc từ CIAT/Colombia. Giống đã được Bộ Nông nghiệp và
phát triển nông thôn cho phép đặc cách công nhận giống ngày 02 tháng 10 năm
2008, số 216/QĐ-TT-CLT.
Giống KM98-7 sinh trưởng ở Miền Bắc của Việt Nam từ 7 – 10 tháng, thân
nâu đỏ, cuống lá nhỏ, chia thùy sâu. Cuống lá và phiến lá màu xanh, ruột củ trắng,
vỏ củ màu nâu. Năng xuất đạt 25 – 45 tấn/ha. Giống được nhiều nông dân miền Bắc
chấp nhận và nhân nhanh trong sản xuất. Tính đến năm 2008 đã có trên 500 ha được
phát triển trong sản xuất.
Giống TMS 60444
TMS 60444 là giống sắn mô hình được nhập từ CIAT. Các nghiên cứu trên
thế giới đã cho thấy đây là giống sắn có khả năng tạo mô sẹo phôi hóa chất lượng
nhất và đã được chuyển gen thành công. Vì vậy, chúng tôi sử dụng giống sắn này
làm giống mô hình để đánh giá chất lượng mô sẹo của các giống Việt Nam được
nghiên cứu.
170,1
184,58
2003
17,72
107,8
191,12
2004
18,31
110
201,41
2005
18,42
111,7
205,
89
2006
2010
18,46
124,3
229,54
2011
19,64
128,4
252,2
(FAO, 2013) [18]
Diện tích, năng suất và sản lượng sắn trên thế giới có chiều hướng gia tăng từ
năm 2000 đến nay. Năm có sản lượng sắn cao nhất là năm 2011, đạt 252,2 triệu tấn
tăng 42,8% (FAO, 2013) [18]. Nguyên nhân của sự gia tăng này là do ngành chế biến
công nghiệp nhiên liệu sinh học ethanol sử dụng sắn làm nguyên liệu đầu vào tại các
quốc gia Đông Nam Á. Tại Thái Lan, Việt Nam và Indonesia, sắn trở thành một loại
cây công nghiệp hàng năm quan trọng và được thu mua để chế biến thành các sản
phẩm xuất khẩu [21].
2.1.4.2. Việt Nam
Ở Việt Nam, sắn là cây lương thực quan trọng đứng hàng thứ ba sau lúa và
nấấc có 560000ha, vấi tấng sấn lấấng đất gấn 9,4 triấu tấn (2013). Trong tấng sấn
lấấng thu đấấc, 30% sấn lấấng phấc vấ nhu cấu tiêu dùng trong nấấc làm lấấng
thấc, chấ biấn thấc ăn chăn nuôi, công nghiấp dấấc phấm, làm nguyên liấu sấn
xuất xăng sinh hấc, cấn công nghiấp 70% đấấc xuất khấu dấấi dấng tinh bất hoấc
sấn lát khô. Năm 2013, cấ nấấc có 6 nhà máy sấn xuất nhiêu liấu sinh hấc sấ dấng
nguyên liấu là sấn lát khô đi vào hoất đấng, gấn 100 nhà máy chấ biấn tinh bất sấn
và hàng trăm cấ sấ chấ biấn thấ công (Tấng cấc thấng kê, 2013) [9].
Hình 2.1. Biảu đả sản lảảng trảng sản cảa Viảt Nam tả năm 2000 - 2013
(Tổng cổc thổng kê, 2013) [9]
Nhìn vào hình 2.1 có thấ thấy: sấn lấấng sấn có xu hấấng tăng dấn và ấn
đấnh giai đoấn tấ năm 2000 đấn 2008, giấm mấnh trong 2 năm sau đó. Tấ năm
2011 sấn lấấng tăng mấnh trấ lấi và dấn ấn đấnh mấc dù có giấm nhấng không
đáng kấ.
Sấn là mất hàng xuất khấu hấn tấ USD mấi năm, năm 2013 xuất khấu sấn
và sấn phấm thu vấ 1,1 tấ USD vấi 3,1 triấu tấn. Trong đó sấn xuất khấu 1,5 triấu
tấn, trấ giá 385,5 triấu USD, giấm 32,9% vấ lấấng và giấm 31,2% vấ trấ giá so vấi
năm 2012. Viất Nam xuất khấu sấn và sấn phấm chấ biấn tấ sấn sang 5 thấ trấấng
chính trên thấ giấi, trong đó Trung Quấc vấn là thấ trấấng xuất khấu chính, vấi 2,6
triấu tấn. Ngoài ra, Viất Nam còn xuất khấu sấn và sấn phấm sang thấ trấấng khác
nhấ Hàn Quấc, Philippin, Đài Loan, Malaixia, Nhất Bấn vấi lấấng xuất đất lấn lấất
237,6 nghìn tấn, 62,8 nghìn tấn, 41,3 nghìn tấn, 28,8 nghìn tấn và 8,9 nghìn tấn
(Tấng cấc thấng kê, 2013) [9]. Có đấấc nhấng kất quấ này là do nhiấu yấu tấ,
nhấng quan trấng hấn cấ là trong sấn xuất ngấấi trấng sấn đã chấn giấng mấi và áp
dấng các biấn pháp kấ thuất. Tuy nhiên, trong sấn xuất sấn hiấn nay cũng còn gấp
nhiấu khó khăn nhấ: diấn tích sấn bấ thu hấp do cấnh tranh bấi các cây trấng khác;
năng suất sấn còn thấp hấn so vấi tiấm năng cấa cây sấn (45 – 50 tấn/ha) [4].
Như vậy, nếu như diện tích sắn của Việt Nam khó có khả năng gia tăng trong những
năm tới do sự cạnh tranh của các loại cây khác cũng như do quy hoạch sử dụng đất thì
chúng ta vẫn còn triển vọng tăng trưởng sản lượng nhờ gia tăng năng suất nếu được
5
Pháp 0,9
(Rogers Appan DJ, 1973) [28]
Ở Việt Nam, cây sắn đã và đang là cây trồng được ưu tiên nghiên cứu phát triển
trong tầm nhìn chiến lược đến năm 2020 của Bộ Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn.
Nghiên cứu và phát triển cây sắn theo hướng sử dụng đất nghèo dinh dưỡng, đất khó
khăn là hướng hỗ trợ chính cho việc thực hiện “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến
năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025” đã được Thủ tướng Chính phủ phê duyệt tại quyết
định số 177/2007/ QĐ-TT ngày 20 tháng 11 năm 2007 [8].
Theo đề án phát triển, đến năm 2015, Việt Nam cần 4,2 triệu tấn sắn lát để
sản xuất ra 750 triệu lít ethanol. Tám nhà máy nhiên liệu sinh học đã được cấp phép
với nhu cầu tiêu thụ mỗi năm khoảng 1,2 triệu tấn sắn lát. PetroVietnam đã triển
khai công tác đầu tư xây dựng 3 nhà máy sản xuất cồn sinh học đặt tại 3 miền Bắc,
Trung, Nam với công suất mỗi nhà máy là 100.000 m³ cồn/năm tương đương
khoảng 230 nghìn tấn sắn lát khô/năm hoặc 575 nghìn tấn củ tươi/năm. Ngoài ra,
nhà máy ethanol Đại Tân, huyện Đại Lộc, Quảng Nam do Công ty Cổ phần Đồng
Xanh đầu tư với công suất của nhà máy là 125.000 tấn ethanol/năm, nhà máy cần
300.000 tấn sắn khô mỗi năm [21] (Bảng 2.4).
Bảng 2.4. Tám nhà máy sản xuảt Ethanol và rảảu
tả sản cảa Viảt Nam năm 2010
STT
Tên nhà máy
Công suất
(triệu lít /năm)
1 Ethanol Đại Tân 125
2 Ethanol Dung Quất 100
3 Ethanol Bình Phước 100
4 Ethanol Tam Nông 100
5 Ethanol Tùng Lâm 70
6
Auxin là một loại hormon kích thích sinh trưởng, có tác dụng sinh lý đến quá
trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện
tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo quả
không hạt
Auxin được tổng hợp sử dụng trong nuôi cấy mô nhưng nó dễ bị biến tính
trong môi trường nuôi cấy và nhanh chóng thoái biến ở trong mô. Tuy nhiên những
đặc tính này có thể trở nên hữu dụng bởi vì trong cây, (cùng với cytokinin) sau khi
cảm ứng hình thành mô sẹo sẽ kích thích sự tạo chồi hoặc phôi khi hàm lượng của
nó trong mô giảm dần. Chính vì vậy auxin dùng trong nuôi cấy mô là dạng auxin
tổng hợp, không phải auxin tự nhiên, nên độ bền cao hơn. Auxin thường được sử
dung phối hợp với các chất điều hoà sinh trưởng khác để kích thích sự phát sinh
hình thái trực tiếp (sự tạo rễ của cành giâm in vitro) và trong nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng và chồi. Tuy nhiên, tuỳ theo mục đích thí nghiệm mà người ta có thể sử
dụng các hợp chất giống auxin khác được tổng hợp và nó có những hoạt động hơi
khác với auxin như: NAA, 2,4D, picloram…
2.2.1. NAA (Naphtylaxetic axit)
Công thức hóa học: C
12
H
9
O
2
Na; phân tử khối: 186,21 g/mol.
NAA là chất kích thích sinh trưởng được tổng hợp bằng con đường hóa học,
thuộc nhóm chất auxin nên nó có đầy đủ các tính chất và tác dụng sinh lý của nhóm
chất này. Đặc biệt là khả năng cảm ứng, tạo mô sẹo.
2.2.2. 2,4-D (axit 2,4,5-dichlorophenoxyacetic)
Công thức hóa học: C
8
H
Bản chất của cây trồng chuyển gen là sự biến đổi vật chất di truyền, tiếp
nhận thêm những gen mới, kết quả là xuất hiện những tính trạng mới dưới sự tác
động của môi trường. Thông qua phương pháp chuyển gen cho phép nhà chọn
giống tích hợp được các gen có lợi vào một loài, một sản phẩm cây trồng nhất định,
đây là phương thức tạo ra các tính trạng ưu việt mới cho cây trồng trên cơ sở kết
hợp với phương pháp chọn tạo truyền thống [34].
Chuyển gen sắn đã và đang được nghiên cứu rộng rãi trên toàn thế giới. Việc
đưa các gen quan tâm vào cây sắn đã và đang tạo ra những cây sắn mang đặc điểm
nông học quan tâm như khả năng kháng bệnh virut, kháng côn trùng, cải thiện
thành phần dinh dưỡng, biến đổi và tăng chuyển hóa tổng hợp tinh bột, giảm hàm
lượng cyanogenic trong củ sắn [30].
Trên thế giới các công trình nghiên cứu về chuyển gen sắn được tiến hành từ
những năm cuối thế kỉ 20 [28]. Năm 1996, những quy trình chuyển gen sắn đầu tiên
đã được báo cáo độc lập cùng một lúc bởi hai nhóm nghiên cứu khác nhau. Li và
cộng sự đã chuyển gen vào lá mầm sắn sau đó tạo chồi, từ chồi đã được chuyển gen
tái sinh thành cây hoàn chỉnh [22]. Trong quy trình chuyển gen của Schöpke,
chuyển gen dựa trên việc thực hiện một quy trình để tạo ra các cụm tế bào được gọi
là mô sẹo phôi hóa, gen mục tiêu sẽ được chuyển vào mô sẹo phôi hóa, sau đó tái
sinh chúng thành cây hoàn chỉnh từ phôi trưởng thành [31]. Đây là một mốc quan
trọng đánh dấu trong quá trình chọn tạo giống sắn bằng phương pháp phân tử. Sau
nhiều năm phát triển, công nghệ chuyển gen đã từng bước trưởng thành và tiến bộ
đáng kể , đã xác nhận được gen chức năng và giống chuyển gen.
Trong chuyển gen, chuyển gen sắn thường chuyển gen trung gian nhờ vi
khuẩn agrobacterium hoặc dùng súng bắn gen. Các mẫu thường sử dụng để chuyển
gen là lá mầm soma hoặc mô sẹo phôi hóa [24].
2.3.1.1. Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens được sử dụng như một vector tự nhiên để mang
các gen ngoại lai vào mô tế bào thực vật [6]. Khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn
đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất
sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u (trường hợp A. tumefaciens). Khả năng chuyển
cho enzym ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) giúp tăng cường hoạt động
tổng hợp tinh bột ở sắn. Cây chuyển gen thể hiện gen glgC có AGPase hoạt động
cao hơn 70% so với cây đối chứng khi khảo nghiệm trong điều kiện tối ưu cho các
giống sắn khi không có vi khuẩn AGPase hoạt động [35].
Hiện nay, nhiều kỹ thuật chuyển gen khác nhau vào tế bào nhưng chuyển gen
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens có nhiều ưu điểm như hiệu quả chuyển gen cao,
yêu cầu trang thiết bị đơn giản, số lượng bản sao thấp và ổn định ở thế hệ con cháu. Do
đó, đây là phương pháp sử dụng rộng rãi nhất cho kỹ thuật di truyền sắn [24].
2.3.1.2. Chuyển gen thông qua nguồn nguyên liệu mô sẹo phôi hóa
Chuyển gen vào phôi soma gặp nhiều trở ngại và khó khăn đặc biệt là tần số
cây con tái sinh thấp [11], tỉ lệ tạo thể khảm cao [31]. Chuyển gen thông qua mô sẹo
phôi hóa sẽ khắc phục được tình trạng này, hạn chế được thời gian công sức mà
hiệu quả chuyển gen lại cao hơn [39].
Năm 1998, Gonzalez và cộng sự đã thành công trong việc chuyển gen vào
mô sẹo phôi hóa giống TMS 60444 [20], đánh dấu một bước tiến mới cho việc áp
dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học trên đối tượng cây sắn. Sau gần 5 năm phát
triển kể từ khi phương pháp chuyển gen từ mô sẹo phôi hóa vào giống TMS60444
được giới thiệu, phương pháp chuyển gen qua Agrobacterium từ mô sẹo phôi hóa đã
được tiến hành thành công ở một số phòng thí nghiệm [24].
Phương pháp chuyển gen sắn từ mô sẹo phôi hóa ngày càng phổ biến, từ năm
2005 đã được sử dụng thường xuyên trong phòng thí nghiệm tạo sắn chuyển gen
kháng virus khảm [11, 38]. Năm 2009, quy trình chuyển gen vào cây sắn từ mô sẹo
phôi hóa và tái sinh thành cây hoàn chỉnh của Bull và cộng sự đã cho thấy cụ thể
các giai đoạn khác nhau trong quy trình, họ cũng đưa ra một số cải tiến góp phần
hoàn thiện quy trình chuyển gen hiện nay [29].
Chuyển gen vào sắn nhờ vi khuẩn A. tumefaciens từ mô sẹo phôi hóa, việc
chuyển gen trở lên dễ dàng do mô sẹo phôi hóa có thể tăng sinh tạo ra số lượng
lớn trong thời gian ngắn. Đặc biệt chuyển gen từ những tế bào đang phân chia
nên khi biến nạp vi khuẩn sẽ dễ dàng xâm nhập vào tế bào thực vật nên hiệu quả
chuyển gen sẽ cao hơn và khả năng tái sinh tạo cây hoàn chỉnh cũng cao hơn mô
3.2. Môi trường nuôi cấy
Bảng 3.1. Các môi trảảng sả dảng trong quá trình nghiên cảu
STT
Môi trường
Hormone
bổ sung
Mục đích
1 MS -
Tạo và nhân vật liệu khởi đầu
2
CAM
BAP 10mg/L
3 CIM
Bổ sung auxin với
hàm hượng nhất định
Tạo mô sẹo
4 DKW Tạo mô sẹo
5 MMS Tạo và nhân mô sẹo phôi hóa
3.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
Dụng cụ
- Đĩa petri vô trùng, 90 mm
- Pipet 25mL, vô trùng
- Ống Eppendorf (1.5 mL)
- Parafilm, cling film
- Đầu lọc xi-lanh vô trùng (0.22 µm)
- Đầu côn vô trùng 1 ml
Copyright: Tài liệu đại học ©