BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH VĂN NINH TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT
3-ARYL-5-ARYLIDENHYDANTOIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

PGS. TS. Nguyễn Quang Đạt
HÀ NỘI, NĂM 2013
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS.Vũ Trần Anh,
PGS.TS Nguyễn Quang Đạt, là người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện
thuận lợi và động viên tôi hoàn thành luận văn này. Tôi chân thành cảm ơn PGS.TS.
Đinh Thị Thanh Hải, ThS. Hoàng Thu Trang và toàn thể các thầy cô giáo, kỹ thuật
viên của Bộ môn Hóa hữu cơ đã động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian nghiên cứu tại Bộ
môn.
Tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của: Ths Đặng Vũ Lương (Phòng NMR-
Viện hóa học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Ths. Phạm Thị Nguyệt Hằng
(Khoa Dược lý-Sinh hóa, Viện Dược liệu Việt Nam), TS. Nguyễn Thị Sơn (Bộ môn Hóa
vật liệu, khoa Hóa, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội),
PGS.TS. Lê Mai Hương (Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam) và các thầy cô giáo trong trường, các phòng ban, thư viện -
Trường Đại học Dược Hà Nội.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng do hạn chế về thời gian, kiến thức cũng như tài
liệu tham khảo nên luận văn của tôi không thể tránh khỏi những sai sót, khiếm khuyết
trong nội dung và hình thức, tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô để luận
văn được hoàn thiện hơn.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua.
Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Học Viên
Trịnh Văn Ninh
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT


Phản ứng đóng vòng của các α-dicarbonyl với ure hoặc dẫn xuất của
ure
9

Phản ứng Bucherer-Bergs
10

Phản ứng của các cyanoacetamid với kiềm hypohalid
10

Phản ứng tổng hợp dẫn chất 5-arylidenhydantoin
10
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
14
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI
14
2.2. THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM
14
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
15
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
15
2.4.1. Phương pháp tổng hợp các 3-aryl-5-arylidenhydantoin
15
2.4.2. Phương pháp xác định cấu trúc
15
2.4.3. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư
16

4.2. Về xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được
42
4.2.1. Về phổ hồng ngoại (IR)
42
4.2.2. Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (
1
H-NMR)
44
4.2.3. Về xác định đồng phân hình học của các 3-aryl-5-
arylidenhydantoin tạo thành dựa trên phổ
1
H-NMR
45
4.2.4. Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân
13
C (
13
C-NMR)
46
4.2.5. Phổ khối lượng (MS)
53
4.3. Về tác dụng gây độc tế bào ung thư
53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
55
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
A549 : Tế bào ung thư phổi ở người

3.3: Số liệu phổ
1
H – NMR của các chất 3-aryl-5-arylidenhydantoin
(I-XII)
35
3.4: Số liệu phổ
13
C – NMR của các chất 3-aryl-5-arylidenhydantoin
(I-XII)
36
3.5: Kết quả thử tác dụng của các chất tổng hợp được ở nồng độ 100
µg/ml trên một số dòng tế bào ung thư người (theo phương pháp
MTT)
38
3.6: Kết quả xác định giá trị IC
50
(µg/ml) của một số chất tổng hợp
được trên dòng tế bào HCT116 (theo phương pháp MTT)
38
3.7: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư tuyến
tiền liệt PC3 của các chất tổng hợp được (theo phương pháp SRB)
39
4.1: Các tương tác
1
H-
13
C của chất I
51
4.2: Các tương tác
1

(thuốc kháng khuẩn), dantrium (thuốc giãn cơ vân), nilutamid (thuốc điều trị ung thư
tuyến tiền liệt di căn).
Trong những năm qua, các nhà nghiên cứu trên thế giới và trong nước tiếp tục nghiên
cứu tổng hợp và sàng lọc hoạt tính sinh học của các dẫn chất hydantoin, đã tìm thấy
nhiều dẫn chất 5-arylidenhydantoin thiên nhiên và tổng hợp có hoạt tính kháng khuẩn,
kháng nấm và tác dụng chống ung thư rất đáng quan tâm thư [1], [4], [5], [11], [18],
[25], [29], [38].
Để góp phần nghiên cứu, tìm kiếm các dẫn chất 5-arylidenhydantoin có tiềm năng về
hoạt tính chống ung thư, chúng tôi thực hiện luận văn với các mục tiêu sau:
 Tổng hợp một số dẫn chất 3-aryl-5-arylidenhydantoin.
 Thử sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư của các chất
tổng hợp được.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÁC DẪN CHẤT HYDANTOIN
Hydantoin (imidazolidin-2,4-dion) là hợp chất hữu cơ được A.Bayer phát hiện năm
1861 [40] bằng phản ứng hydro phân (hydrogenolysis) allantoin (chất được phát hiện
trong túi dịch niệu (the allantoin fluid) của bò cái), đó là nguồn gốc của tên hydantoin.
Sau đó, năm 1864, A.Bayer [40] tổng hợp được hydantoin với nguyên liệu đầu là
bromoacetylure. Tuy nhiên cấu trúc vòng của hydantoin chỉ được xác định bởi Strecker
vào năm 1873 [42]. Cho đến nay, nhiều dẫn chất của hydantoin đã được tổng hợp và một
số chất đã được sử dụng làm thuốc.
Bản thân hydantoin không thể hiện tác dụng sinh học, tuy nhiên nhiều công trình
nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học cho thấy các dẫn chất của hydantoin có tác
dụng khá phong phú và đa dạng như động chống động kinh, kháng khuẩn, chống ung thư
[1], [2], [3], [6], [9], [11], [23], [36],… Các dẫn xuất thế ở vị trí N
1
, N
3
, đặc biệt thế 2
lần ở vị trí C

4
Chất này được tổng hợp năm 1992, được ứng dụng trong điều trị năm 1996 [3], [6],
[21]. Nilutamid được chỉ định trong điều trị ung thư tuyến tiền liệt có di căn, dùng phối
hợp với phẫu thuật cắt bỏ tinh hoàn.
Một số hợp chất thiên nhiên có cấu trúc 5- arylidenhydantoin được phân lập và tìm
thấy có hoạt tính ức chế tế bào ung thư như các chất aplysinopsin (5) và spongiacidin (6)
từ bọt biển [15], [18].
5 6
Nhiều dẫn chất 5-arylidenhydantoin đã được tổng hợp và thử nghiệm hoạt tính kháng
tế bào ung thư trên thế giới. Tại Việt Nam, năm 2003 các tác giả Đinh Thị Thanh Hải,
Nguyễn Quang Đạt, Lê Mai Hương [4] cũng đã nghiên cứu hoạt tính kháng hai dòng tế
bào ung thư ở người (tế bào ung thư biểu mô (KB) và tế bào ung thư màng tử cung (FL)
của dãy chất 5-(5’-nitro-2’-furfuryliden)hydantoin).
Kết quả là tìm được hai chất là 5-(5’-nitro-2’-furfuryliden)imidazolidin-2,4-dion (7)
và 3-piperidinomethyl-5-(5’-nitro-2’-furfuryliden)imidazolidin-2,4-dion (8) có hoạt tính
ức chế tế bào ung thư rất mạnh (giá trị IC
50
là 0,2-1,04 (µg/ml) đối với dòng tế bào FL và
0,6-1,15 (µg/ml) đối với dòng tế bào KB).
7 8
Năm 2006, C.Carmi và cộng sự [11] đã nghiên cứu tổng hợp một số dẫn chất 1-
phenyl-5-benzylidenhydantoin và thử hoạt tính ức chế EGFR (receptor của yếu tố tăng
trưởng biểu mô) và chống tăng sinh của tế bào ung thư biểu mô ở người A431. Kết quả
nghiên cứu của tác giả Carmi cho thấy một số chất tổng hợp được có tác dụng ức chế quá
trình phosphoryl hóa của EGFR, có tác dụng ức chế sự phát triển và tăng sinh của tế bào
ung thư biểu mô A431 khi thử ở nồng độ 20µM. Chất có tác dụng mạnh nhất là (E)-5-p-
hydroxybenzyliden-1-phenethylhydantoin (9) với IC
50
= 27µM trên in vitro.
Năm 2009, V.Zualiani và C.Carmi tiếp tục hướng nghiên cứu các dẫn chất 5-

trong đó có 9 dẫn xuất của 5-arylidenhydantoin và 34 dẫn chất base Mannich của các dẫn
xuất 5-arylidenhydantoin. Tác giả đã thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của 43 chất tổng
hợp được đối với 2 dòng tế bào ung thư người là tế bào ung thư gan Hep-G2 và tế bào
ung thư phổi LU. Kết quả cho thấy trong số 43 chất tổng hợp được có 4 dẫn chất 5-
arylidenhydantoin và 9 dẫn chất base Mannich của chúng có hoạt tính ức chế tế bào ung
thư gan người Hep-G2 (IC
50
=0,38÷5μg/ml). Các dẫn chất base Mannich đều có đặc điểm
cấu tạo chung là chứa nhóm hút điện tử (-Cl, -NO
2
) trong hợp phần aryliden.

14 (a-d)
R=H, 2’-OH; 4’-OH, 4’-N(CH
3
)
2
;
4’-F; 2’-Cl; 4’-Cl; 3’-NO
2
; 4’-NO
2
.
Năm 2012, tác giả Đỗ Thị Thu Hằng [5] đã tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào
ung thư của 15 dẫn chất 5-halogenoarylidenhydantoin và base Mannich. Kết quả cho
thấy 11 chất có hoạt tính ức chế tế bào ung thư HCT116 với IC
50
= 10,17-19,23 μg/ml.
 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP HYDANTOIN VÀ DẪN CHẤT
Hiện nay nhiều dẫn chất của hydantoin ngoài việc được ứng dụng làm thuốc còn

Phản ứng Bucherer-Bergs tổng hợp các dẫn chất hydantoin thế ở C-5 từ hợp chất
carbonyl với KCN hoặc từ cyanohydrin tương ứng và amoni carbonat [9], [34].
Sơ đồ phản ứng:
1.1.1.5. Phản ứng của các cyanoacetamid với kiềm hypohalid [8], [19].
Sơ đồ phản ứng:
Sản phẩm của phản ứng là các sản phẩm thế hai lần ở vị trí C-5

Phản ứng tổng hợp dẫn chất 5-arylidenhydantoin
Hydantoin (imidazolidin-2,4-dion) có công thức cấu tạo như sau:
Từ cấu trúc phân tử hydantoin cho thấy nhân hydantoin có nhóm methylen hoạt động
(C-5) có khả năng ngưng tụ với các aldehyd thơm để tạo ra dẫn chất 5-
arylidenhydantoin.
Sơ đồ phản ứng:
R = phenyl, phenyl thế, furyl, pyryl, quinolyl
Năm 1911, Wheeler và Hoffman là những người đầu tiên nhận thấy hydantoin có thể
ngưng tụ với các aldehyd thơm tạo thành dẫn chất có nối đôi gắn ở C-5 của hydantoin
[35]. Phản ứng được thực hiện trong acid acetic băng, với natri acetat khan, anhydrid
acetic. Các aldehyd thơm đã được sử dụng là benzaldehyd, 2-hydroxybenzaldehyd,
furfural, vanillin,…
Phương pháp của Wheeler và Hoffman được sử dụng để tổng hợp nhiều dẫn chất thế
ở C-5 của hydantoin [29], [35] và của dẫn chất thế ở N-3 của hydantoin [12], [39]
Năm 1993, Marton. J. [22] sử dụng xúc tác có tính base mạnh là ethanolamin để tiến
hành phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với hydantoin trong dung môi là hỗn hợp nước :
ethanol (1:1), phản ứng được tiến hành ở nhiệt độ hồi lưu trong 4 giờ. Tác giả sử dụng
một số aldehyd thơm (p-clorobenzaldehyd, p-nitrobenzaldehyd, p-
hydroxybenzaldehyd,…), hiệu suất phản ứng 44-89%. Năm 2004, tác giả Thenmozhiyal
và cộng sự [31] đã sử dụng xúc tác này trong điều chế các phenylmethylenhydantoin và
điều chế được 54 dẫn chất.
Sơ đồ phản ứng:


carbonyl của aldehyd tạo sản phẩm cộng hợp (IV):
(III) (II) (IV)
Ion alcolat (IV) tạo thành lại lấy một proton của BH, trả lại xúc tác B
ˉ
:
(IV) (V)
 Giai đoạn ngưng tụ loại nước:
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI
Các hóa chất, dung môi dùng trong quá trình thực nghiệm là loại dùng trong tổng
hợp được nhập từ công ty Merck, Sigma-Aldrich, Trung Quốc. Các hóa chất này được
sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm. Bao gồm:
 Các benzaldehyd:
 Benzaldehyd - 3- Clorobenzaldehyd
 4- Clorobenzaldehyd - 2,6- Diclorobenzaldehyd
 2- Bromobenzaldehyd - 3- Bromobenzaldehyd
 4- Bromobenzaldehyd - 4- Nitrobenzaldehyd
- 2- Hydroxybenzaldehyd - 4- Hydroxybenzaldehyd
 3- Nitrobenzaldehyd - 4- Fluorobenzaldehyd
 4-nitrophenylisocyanat
 Glycin
 1,4-dioxan
 Các hóa chất và dung môi khác: DMF, aceton, acid acetic băng, cloroform,
ethylacetat, methanol, natri acetat, ethanol tuyệt đối, HCl, KOH, nước cất.
 THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM
 Dụng cụ thủy tinh (bình cầu 3 cổ dung tích 100ml, sinh hàn, phễu nhỏ giọt, ống
đong, cốc thủy tinh các loại, bình lọc hút, phễu Buchner…)
 Cân kỹ thuật điện tử Shimadzu (Nhật).
 Bơm hút chân không DIVAC.1.21 (Mỹ).

H-NMR,
13
C-NMR, HSQC, HMBC, MS) được sử dụng
để khẳng định cấu trúc của các sản phẩm tổng hợp được. Các số liệu phổ của các chất
tổng hợp được đối chiếu với tài liệu.
 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư của các chất tổng hợp được theo 2 phương
pháp:
 Phương pháp MTT [24], [37]
 Phương pháp SRB [15], [20], [27]
Nguyên tắc:
Đây là phương pháp thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót của tế bào. Tế
bào ung thư được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng.
 Phương pháp MTT: Hợp chất MTT 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5
diphenyltetrazolium bromid, có màu vàng được thêm vào mỗi giếng và tế bào được ủ ở
37
o
C, 5% CO
2
. Màu vàng này bị biến đổi thành formazan tím trong ty thể của những tế
bào sống. Khả năng hấp thụ của dung dịch có màu này có thể được định lượng bằng máy
quang phổ kế ở bước sóng 540 – 600 nm. Sự biến đổi màu chỉ xảy ra khi enzym
reductase trong ty thể là hoạt động, và do đó sự chuyển đổi có thể liên quan trực tiếp đến
số lượng tế bào sống sót. Chúng tôi sử dụng phương pháp này để nghiên cứu độc tính
của các chất tổng hợp được đối với 4 dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư phổi
A549, tế bào ung thư gan Hep-G2, tế bào ung thư biểu mô vú MCF7 và tế bào ung thư
đại tràng HCT116.
 Phương pháp SRB: Hợp chất Sulphorhodamin B (SRB) biến đổi thành
aminoxanthin có màu hồng, được các acid amin cần thiết trong tế bào sống hấp thu.
Càng nhiều tế bào sống, sự hấp thu càng nhiều. Các tế bào sống, sau đó được cố định.