BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
 HOÀNG THỊ MỸ LINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA
CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY PHÈN ĐEN
Phyllanthus reticulatus Poir.
THU HÁI TẠI BẮC GIANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2015BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ MỸ LINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA
CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY PHÈN ĐEN
Phyllanthus reticulatus Poir.

Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Hoàng Thị Mỹ Linh.
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ALP : Alkaline phosphatase
ALT : Glutamat pyruvat transaminase.
AST : Glutamat oxaloacetat transaminase.
EtOAc : Ethyl acetat
HDL : Lipoprotein tỷ trọng cao (High density lipoprotein)
IC
50
: Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử (Half maximal inhibitory
concentration)
LDL : Lipoprotein tỷ trọng thấp (Low density lipoprotein)
SKLM : Sắc ký lớp mỏng
UV : Tử ngoại (Ultra violet)
VLDL : Lipoprotein tỷ trọng rất thấp (Very low density lipoprotein). DANH MỤC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
1.1
Thành phần hóa học trong các bộ phận rễ, thân cành, vỏ thân
7
3.1
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỔ THỊ
Hình
Tên hình ảnh
Trang
1.1
Công thức cấu tạo của một số flavanoid trong lá
3
1.2
Công thức cấu tạo của một số tanin
4
1.3
Công thức cấu tạo của triterpen trong lá Phèn đen
4
1.4
Công thức cấu tạo của một số sterol trong lá
5
1.5
Công thức cấu tạo của các hợp chất khác
6
2.1
Cây Phèn đen
14
2.2
Lá Phèn đen (khô)
14
3.1
Quy trình bào chế cao dược liệu nghiên cứu
19

1.2. TÁC DỤNG SINH HỌC 10
1.2.1. Tác dụng hạ glucose máu 10
1.2.2. Tác dụng bảo vệ gan 10
1.2.3. Tác dụng khác 11
1.2.4. Độc tính 12
1.3. CÔNG DỤNG TRONG Y HỌC CỔ TRUYỂN VÀ DÂN GIAN 13
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 14
2.1.1. Nguyên liệu 14
2.1.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 14
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.2.1. Bào chế cao 15
2.2.2. Nghiên cứu về hóa học 16
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học trên động vật 17
Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19
3.1. BÀO CHẾ CAO 19
3.2. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 19
3.2.1. Định tính bằng phản ứng hóa học 20
3.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 25
3.2.3. Phân lập 27
3.3. NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC 29
3.3.1. Tác dụng bảo vệ gan 29 3.3.2. Tác dụng trên glucose huyết 30
BÀN LUẬN 33
KẾT LUẬN 36
ĐỀ XUẤT 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


Ở Việt Nam, Phèn đen là loại cây mọc hoang dã ở nhiều vùng địa lý khác
nhau, điều kiện sinh thái khác nhau với sức sống mãnh liệt. Nhân dân đã sử
dụng Phèn đen để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau như: viêm nhiễm đường
tiêu hóa (ỉa chảy, lỵ, viêm ruột), viêm tiết niệu cấp, vàng da, ứ huyết tụ huyết
do chấn thương [5].
Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện nhiều tác dụng quý của
Phèn đen: hạ đường huyết [30], [39], bảo vệ gan [14], [46], giảm mỡ máu
[35], kháng khuẩn [10], [44], [45], chống viêm [27], [31], [41], … đặc biệt là
tác dụng ức chế virus viêm gan B [15].
Cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) cùng chi với cây Diệp hạ
châu đắng (Phyllanthus amarus). Các nghiên cứu cho thấy hai cây này có các
tác dụng tương tự nhau [10], [14], [15], [24], [27],[35].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu cây Phèn đen ở giai đoạn đầu, chủ yếu về
thành phần hóa học, chưa có nghiên cứu xác định giá trị trong y học. Vì thế,
chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và một số
tác dụng sinh học của cao chiết từ lá cây Phèn đen (Phyllanthus
reticulatus) thu hái tại Bắc Giang” với 2 mục tiêu:
- Nghiên cứu thành phần hóa học của cao chiết từ lá cây Phèn đen.
- Nghiên cứu một số tác dụng sinh học trên động vật thực nghiệm của cao
lá Phèn đen.
2

Isoquercitrin Quercitrin Rutin Astragalin

Kaempferol-3-rutinosid
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của một số flavanoid trong lá
1.1.1.2. Tanin
Tanin trong lá gồm 2 nhóm: tanin thủy phân được và tanin ngưng tụ.
- Tanin thủy phân được: Dịch chiết methanol có corilagin [17].
- Tanin ngưng tụ: Methyl este của acid geraniinic ((5R*,6R*)-4,6-
dimethoxycarbonyl-5-[2′ ,3′ ,4′ -trihydroxy-6′-(methoxycarbonyl) phenyl]-5,6-
dihydro- 2H-pyran-2-on) được phân lập từ dịch chiết methanol [38].

4
Corilagin
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của một số tanin
1.1.1.3. Triterpenoid
Kết quả của nghiên cứu dịch chiết dầu hỏa của lá thấy có: friedelin [10], [16];
golchidonol [16], [20]; friedelan-3β-ol [16].
Trong dịch chiết methanol có lupeol, lupeol acetat [21].

1.1.1.5. Các hợp chất khác
Trong dịch chiết lá có các hợp chất: acid ellagic [17]; acid 2,7-Di-O-
methylellagic [17]; methyl brevifolincarboxylat [17], acid 3,3',4-tri-O-methylellagic
[38], methyl gallat [17], acid gallic [48] và acid p-coumaric [36]. Acid ellagic Acid 2,7-Di-O-methylellagic Methyl brevifolincarboxylat Acid 3,3',4-tri-O-methylellagic
Methyl gallat Acid gallic Acid p-coumaric

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của các hợp chất khác 7 1.1.2. Thành phần hóa học của các bộ phận khác
Nghiên cứu trên các bộ phận khác (rễ, vỏ thân, thân) cho thấy sự có mặt của các
nhóm chất: triterpenoid, flavanoid, sterol, ankanol.
Bảng 1.1. Thành phần hóa học trong các bộ phận rễ, thân cành, vỏ thân
Nhóm chất
Tên chất
Bộ
phận

thân

[25]
[13]
[21]
Betulin
Rễ

[25]
8 Acid
betulinic
Thân
cành [18]
Glochidonol
Thân
cành
[42]

Olean-12-en-
3β,15α-diol


Kokoonol

Sterol
β-Sitosterol
Rễ

Thân
cành

[25]

[18]
10 Daucosterol
Vỏ
thân

[20]
Flavanoid
Tricin
Rễ

[21]
Alkanol
Octacosan-1-
ol
Rễ


chuột cống. Liều uông 300 mg/kg chuột cống có tác dụng giảm rõ rệt nồng độ
ALT, AST và ALP huyết thanh (p<0.05) [46].
1.2.3. Tác dụng khác
1.2.3.1. Tác dụng giảm đau
 Tác dụng giảm đau ngoại vi
Cắn chiết ethyl acetat của các bộ phận trên mặt đất tác dụng giảm đau 51.23 %
và 65.12 % tương ứng với liều khoảng 15 g và 30 g dược liệu/kg chuột cống [41].
 Tác dụng giảm đau trung ương
Cắn chiết methanol của lá Phèn đen có tác dụng giảm đau theo cơ chế thần kinh
trung ương trên chuột nhắt trắng. Liều tương đương khoảng 30 g dược liệu/kg, thời
gian phản ứng lại của chuột trong nhóm uống dịch chiết methanol khoảng 6.2-6.7
giây (60.49%); trong khi ở nhóm tiêm morphin 2 mg/kg dưới da là 5.82 giây (96.7
%) (p< 0.01) [27].
1.2.3.2. Tác dụng chống viêm
Phyllanthus reticulatus có tác dụng chống viêm trên chuột được gây phù bằng
carragenin [27], [31], [41]. Liều 300 mg/kg phân đoạn ethyl acetat, tương đương với
30 g lá/kg thể trọng có tác dụng giảm viêm 60.49 % trên chuột cống [41].
1.2.3.3. Tác dụng trên cholesterol máu
Cắn chiết nước phần trên mặt đất của Phyllanthus reticulatus đã được chứng
minh là có tác dụng hạ cholesterol máu. Tại liều 250 mg/kg và 500 mg/kg tương
đương với 1.6 g và 3.2 g dược liệu đều có tác dụng hạ tổng lượng cholesterol,
VLDL-cholesterol, triglycerid (TG), LDL-cholesterol; trong khi đó làm tăng nồng
độ HDL-cholesterol (p<0.05) [35].
1.2.3.4. Tác dụng kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa [10],
[44], [45]. Cắn chiết ethanol, cloroform, ether của lá có tác dụng chống lại vi khuẩn
gram dương (Shigella dysenteria, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa,
Shigella sonnei) và vi khuẩn gram âm (Sarcina lute, Bacillus megaterium,
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Streptococcus-β-
haemolytica). Trong đó cắn chiết ethanol có tác dụng diệt khuẩn trên nhiều chủng vi

1.2.3.9. Tác dụng chống ký sinh trùng sốt rét
Lá Phyllanthus reticulatus đã được thử in vitro có tác dụng chống ký sinh
trùng sốt rét Plasmodium falciparum với IC
50
≤ 10 microgam / ml [37].
1.2.4. Độc tính
Độc tính cấp tính của các chất chiết xuất ether, ethyl acetat, methanol được
nghiên cứu theo phương pháp mô tả bởi Ganapathy (2002). Thử nghiệm với liều
tăng dần từ 100mg /kg chuột nhắt trắng. Không phát hiện thấy có tác dụng phụ hoặc
tử vong ở chuột cho đến liều 2 g cắn methanol/kg (tương đương với 200g dược liệu)
trong thời gian 24 giờ sau khi chuột uống cắn chiết [39].

13 1.3. CÔNG DỤNG TRONG Y HỌC CỔ TRUYỂN VÀ DÂN GIAN
Bộ phận dùng của Phèn đen: rễ, lá, vỏ thân [5].
Theo y học cổ truyền, rễ Phèn đen có vị chát, tính lạnh, có tác dụng tiêu viêm,
thu liễm, chỉ tả. Lá có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, sát trùng [5].
Phèn đen được dùng làm thuốc cầm máu, làm lành vết thương, chữa đậu mùa và
tiểu tiện khó khăn, có mủ [7].
Rễ Phèn đen được dùng trị lỵ, viêm ruột, ruột kết hạch, viêm gan, viêm thận và
trẻ em cam tích. Lá thường dùng chữa sốt, lỵ, ỉa chảy, phù thũng, ứ huyết do đòn
ngã, huyết nhiệt sinh đinh nhọt; còn dùng chữa bị thuốc độc mặt xám da vàng và
rắn cắn. Vỏ thân dùng chữa lên đậu có mủ và tiểu tiện khó khăn [5].
Ở Ấn Độ, người ta dùng dịch lá làm viên với Long não và Màng tang để trị
lợi răng bị thương; dịch lá cũng đươc dùng trị ỉa chảy cho trẻ em [5].
Ở Malaysia, nhân dân dùng cành và lá phèn đen xát lên ngực để làm giảm hen,
dùng nước sắc lá trị viêm họng. Ở Phylippin, nước sắc lá hoặc vỏ thân là thuốc lợi
tiểu, hồi phục chức năng, lọc máu, làm mát, chữa đau răng, và lá giã đắp vào bụng

môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội. Mã tiêu bản: HNIP/18113/15 (Phụ
lục 3).
Xử lý mẫu: Lá được rửa sạch, phơi khô, bảo quản trong túi nilon kín nơi khô
ráo (hình 2.2)
Hình 2.2. Lá Phèn đen (khô) Hình 2.1. Cây Phèn đen
15

c. Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thuộc cả 2 giống, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm,
cung cấp bởi Ban chăn nuôi, Học Viện Quân Y 103.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Bào chế cao
- Chiết nóng (phương pháp sắc): dung môi là nước.
- Cao dược liệu thu được bằng cách cô dịch chiết nước của lá Phèn đen ở áp
suất thường.

16 2.2.2. Nghiên cứu về hóa học
2.2.2.1. Định tính bằng phản ứng hóa học
 Nguyên tắc:
Phản ứng định tính:
- Chọn phản ứng đặc trưng thường là phản ứng màu, phản ứng tạo tủa.
- Chọn thuốc thử đặc hiệu, nhạy, dễ phát hiện [2].
 Tiến hành:
Định tính xác định một số nhóm hợp chất phổ biến: alcaloid, glycosid tim,
flavanoid, coumarin, anthranoid, saponin, tanin, acid hữu cơ, acid amin, đường khử,
polysaccharid, sterol, chất béo, caroten [1], [2], [3].
- Alcaloid: Phản ứng với thuốc thử Bouchardat, Dragendorff, Mayer.
- Anthranoid: Phản ứng Borntraeger
- Glycosid tim: Phản ứng Liebermann- Budchardat, Legal, Baljet, Keller – Kiliani.
- Flavanoid: Phản ứng với dung dịch NaOH, amoniac, dd FeCl
3

Chấm sắc ký: Dịch chấm sắc ký được chuẩn bị sẵn, chấm với 1 thể tích phù hợp
(5-10 µL).
Triển khai sắc ký: Đặt bản mỏng trong bình sắc ký, đậy kín, để yên. Khi vết
dung môi cách mép trên khoảng 0.5 cm thì lấy bản mỏng ra, đánh dấu vạch dung
môi kết thúc, làm khô bản mỏng trong tủ hốt.
Phát hiện vết: Quan sát ở 2 bước sóng 254 nm và 366 nm, sau đó dùng thuốc
thử hiện màu.
2.2.2.3. Phân lập
- Sử dụng SKLM phát hiện được vết rõ, đậm và lớn nhất xác định được vị trí
chất HL65 chiếm tỷ lệ lớn trong dịch chiết.
- Dùng SKLM điều chế để phân lập chất HL65 ra khỏi dịch chiết.
- Kiểm tra chất HL65 bằng SKLM.
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học trên động vật
2.2.3.1. Tác dụng bảo vệ gan
Dùng paracetamol 220 mg/kg gây tổn thương gan ở chuột nhắt trắng (20 – 25 g)
ở cả 2 giống. Khi đủ liều gây độc, paracetamol gây rối loạn chức năng gan: tăng các
chỉ số ALT, AST, ALP và billirubin huyết tương [8].
Thuốc thử có tác dụng bảo vệ gan khi các chỉ số về chức năng gan giảm:
- Chỉ số quan sát: ALT, AST
- Đánh giá: So sánh lô thử thuốc với lô đối chứng. Các chỉ số ALT, AST giảm
với p < 0.05 thì thuốc thử được đánh giá là có tác dụng với độ tin cậy 95 %.
2.2.3.3. Tác dụng trên glucose huyết
Sử dụng mô hình gây tăng glucose huyết bằng cách tiêm tĩnh mạch đuôi chuột
nhắt trắng dung dịch alloxan [9] (pha trong nước muối sinh lý) với liều 65 mg/kg.
Chuột được uống thuốc thử.
- Chỉ số quan sát: hàm lượng glucose trong huyết tương chuột.
- Chỉ số đánh giá: So sánh hàm lượng glucose trong huyết tương lô chuột thử
thuốc với lô đối chứng. Hàm lượng glucose lô thử thuốc giảm so với lô chứng với p
< 0.05, thuốc được đánh giá là có hiệu quả giảm đường huyết với độ tin cậy 95 %.
2.2.3.4. Xử lý kết quả nghiên cứu tác dụng dược lý