BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THÙY DƯƠNG

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ
VÀ THỜI GIAN NUÔI CẤY TỚI KHẢ
NĂNG SINH ENZYM NGOẠI BÀO CỦA
Bacillus subtilis natto

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THÙY DƯƠNG

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ
VÀ THỜI GIAN NUÔI CẤY TỚI KHẢ
NĂNG SINH ENZYM NGOẠI BÀO CỦA
Bacillus subtilis natto

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Trang
DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chương 1. TỔNG QUAN
3
1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto
3
1.1.1. Phân loại khoa học
3
1.1.2. Nguồn gốc
3
1.1.3. Đặc điểm hình thái
3
1.1.4. Đặc điểm sinh lý
4
1.1.5. Đặc điểm sinh dưỡng
4
1.2. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto
4
1.2.1. Protease ngoại bào của B. subtilis natto
5
1.2.2. Nattokinase
6

sinh tổng hợp enzym ngoại bào của Bacillus subtilis natto
17
2.3. Phương pháp nghiên cứu
17
2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto
17
2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính các nhóm enzym
18
2.3.3. Phương pháp chiết tách protease bằng amoni sulfat 60% bão hòa
19
2.3.4. Phương pháp thử sơ bộ khả năng phân giải fibrin của các mẫu nghiên
cứu
19
2.3.5. Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm
21
Chương 3. KẾT QUẢ - THỰC NGHIỆM
22
3.1. Khảo sát thời điểm thu enzym ngoại bào từ môi trường nuôi cấy B.
subtilis natto
22
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy tới khả năng
sinh enzym ngoại bào của B. subtilis natto
26
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy tới khả năng
sinh enzym ngoại bào của B. subtilis natto
26
3.2.2. Kháo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc tới khả năng sinh enzym ngoại
bào của B. subtilis natto
30
3.2.3. Kết quả thử hoạt tính phân giải fibrin của các mẫu nghiên cứu

:
Fibrinolytic units (Đơn vị đánh giá khả năng phân giải
fibrin của chất nghiên cứu)
kDa
:
kilo Dalton
mBar
:
mili Bar
NCBI
:
National Center for Biotechnology Information (Trung
tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học)
pI
:
Điểm đẳng điện của protein
Điện di SDS – PAGE
:
Điện di gel polyacrylamid với sự có mặt của natri
dodecyl sulfat
TLPT
:
Trọng lượng phân tử
t – PA
:
Tissue plasminogen activator (các tác nhân hoạt hóa
plasminogen ở mô)
VSV
:
Vi sinh vật

) của dịch lên
men ở các thời điểm khác nhau
23
3.3
Đường kính vòng phân giải CMC (d
CMC
) của dịch lên men ở
các thời điểm khác nhau
23
3.4
Đường kính vòng phân giải cơ chất (

cơ chất
) của dịch lên chiết
enzym ở các thời điểm khác nhau
24
3.5
Đường kính vòng phân giải casein (d
cassein
) của dịch lên men
khi nuôi cấy B. subtilis natto ở các nhiệt độ khác nhau
27
3.6
Đường kính vòng phân giải tinh bột (d
tinh bột
) của dịch lên
men khi nuôi cấy B. subtilis natto ở các nhiệt độ khác nhau
27
3.7
Đường kính vòng phân giải CMC (d

Đường kính vòng phân giải cơ chất (

cơ chất
) của dịch chiết
enzym khi nuôi cấy B. subtilis natto ở các tốc độ lắc khác
nhau
32
3.13
Đường kính vòng phân giải fibrin (

fibrin
) của các mẫu
35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trên thế giới, các bệnh có liên quan đến huyết khối như nhồi máu cơ tim,
huyết khối tĩnh mạch sâu, thuyên tắc phổi… ngày càng tăng. Ở Mỹ, mỗi năm có
khoảng 900.000 người mắc bệnh huyết khối tĩnh mạch. Trong đó, khoảng 300.000
ca tử vong [30], chi phí điều trị của 600.000 ca còn lại là từ 5,8 tới 7,8 tỉ đô la [17].
Ở Việt Nam, theo thống kê tại thành phố Hồ Chí Minh mỗi năm có khoảng 17.500
người bị đột quỵ do tai biến mạch máu não, trong đó có 9.000 người tử vong, đa số
còn lại là sống thực vật hay mất khả năng lao động. Việc ngăn ngừa sự hình thành
huyết khối có vai trò quan trọng để phòng ngừa và điều trị các bệnh này [13].
Trước đây, để điều trị bệnh huyết khối người ta sử dụng các chất chống đông
như heparin và coumarin. Buớc sang những năm đầu thế kỉ 20, với việc phát hiện ra
các enzym tiêu fibrin đã đánh dấu bước ngoặt lớn trong điều trị bệnh huyết khối.
Các enzym làm tiêu huyết khối là những chất có thể làm tan cục máu đông do hoạt
hóa plasminogen thành plasmin là chất có thể phá vỡ, ly giải sợi huyết (fibrin).
Streptokinase, urokinase là những enzym tiêu huyết khối điển hình. Tuy nhiên,
chúng chỉ dùng đường tiêm truyền trong trường hợp điều trị cấp tính, không dùng
để phòng bệnh được, việc sử dụng những thuốc này lại làm tăng nguy có chảy máu
và các phản ứng dị ứng, mà chi phí điều trị lại cao [5], [62]. Hiện nay, các tác nhân
làm tan huyết khối có trong nấm, tảo, thực phẩm lên men đang được nghiên cứu để
3

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto
Tên khác: Bacillus subtilis subsp. natto; Bacillus subtilis var. natto
Bacillus subtilis natto là vi sinh vật thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis
được giáo sư Sawamura phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905 [48].
1.1.1. Phân loại khoa học
B. subtilis natto là một vi khuẩn nhân thật (Eurobacteria) thuộc: Giới:
Bacteria; Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillales; Họ: Bacillaceae; Chi:
Bacillus; Loài: Bacillus subtilis [52]. Phân loại dưới loài: Bacillus subtilis natto
[48], [52]
Khi mới được phát hiện, Bacillus subtilis natto được coi như là một loài vi
sinh vật mới. Từ kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B. nato và B. subtilis của
Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 [45], [49]; các khóa phân loại đã xếp B.
subtilis natto là một dòng thuộc loài B. subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác
là có khả năng lên men tạo sản phẩm Natto [39], [48].
Trong dòng B. subtilis natto còn có nhiều loại như B. subtilis natto B – 12
[53], B. subtilis natto N - 77 [47]…

bào tử vẫn có thể này mầm sau khi bảo quản ở 0
0
C [28], [48].
1.1.5. Đặc điểm sinh dưỡng
B. subtilis natto là sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn
hydrocarbon: đường đơn như glucose, fructose…; đường đôi như maltose,
saccarose…; polysaccharid như tinh bột… Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển
của vi khuẩn là acid amin và protein. VSV có thể sử dụng dễ dàng acid glutamic,
arginin… nhưng không sử dụng được threonin, methionin, tryptophan,
phenylalamin [28], [48].
Vi sinh vật cũng cần có biotin để phát triển, trong môi trường không có
biotin các tế bào sinh dưỡng không thể phát triển, bào tử cũng không nảy mầm được
[28].
1.2. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B. subtilis natto có khả năng sinh
nhiều sản phẩm trao đổi chất: γ-PGA theo Bhat năm 2013 [19]; levan (fructan) theo
5

Santos et al. năm 2013 [44], trong đó đặc biệt quan trọng là nhóm các enzym ngoại
bào: nhóm enzym γ–transpeptidase theo Noda năm 1989 [32] và Ogawa năm 1991
[56]; phytase theo M. Shimizu năm 1992 [47]; amylase theo Elif Demirkan năm
2011 [21]; cellulase theo Sun Yan năm 2011 [57] và nhóm enzym được nghiên cứu
nhiều nhất là protease [23], [36], [51], [53].
1.2.1. Protease ngoại bào của B. sutilis natto
B. subtilis natto là vi khuẩn thuộc loài Bacillus subtilis. Protease ngoại bào
của loài B. subtilis được tăng cường sản xuất và tiết ra bên ngoài tế bào vi khuẩn
vào cuối pha lũy thừa cùng với thời điểm bắt đầu hình thành bào tử. Hai protease
chính được sản xuất trong thời gian này là protease serin kiềm (subtilisin) và
protease trung tính [41].
 Đặc điểm một số protease ngoại bào của B. subtilis natto

3+
, Al
3+
. Trung tâm
hoạt động là bộ ba xúc tác: Ser, His và Asp. Cơ chất đặc hiệu: Suc – Ala –
Ala – Pro – Phe – pNA [37], [53].
Với những ứng dụng trong y học, hiện nay nattokinase là protease
được quan tâm nghiên cứu rộng rãi [23], [31] [51].
1.2.2. Nattokinase
a) Nguồn gốc
Nattokinase (kí hiệu là EC 3.4.21.62) là một enzym có hoạt tính tiêu fibrin
rất mạnh có nguồn gốc từ Natto – món ăn truyền thống của Nhật Bản [37].
b) Cấu trúc của nattokinase
Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn có 275 gốc acid amin và không có
cầu nối disulfua trong phân tử. Nattokinase có trung tâm hoạt động bao gồm nhóm
hydroxyl của Ser-221, imidazol của His-64 và nhóm carboxyl của Asp-32 [4].

Hình 1.2. Cấu trúc của nattokinase [62]
c) Cơ chế tiêu fibrin
Nattokinase tiêu fibrin trực tiếp hay gián tiếp thông qua ba con đường khác
nhau [35], [37]
7

Hình 1.3. Cơ chế tiêu fibrin của nattokinase [35], [37]
- Nattokinase trực tiếp giáng hóa fibrin trong cục máu đông, làm biến đổi
fibrin từ dạng polymer không tan thành các sản phẩm giáng hóa có trọng lượng
phân tử thấp, hòa tan. Như vậy, nattokinase có cơ chế tiêu fibrin giống với plasmin.
- Nattokinase giáng hòa fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hóa Pro-urokinase
thành urokinase, dẫn đến thúc đẩy quá trình biến đổi plasminogen thành plasmin,
làm tăng plasminogen nội sinh là enzym phân giải fibrin tự nhiên trong cơ thể.

nattokinase dưới dạng viên nang: Nattospes (300FU/g), S-Nattokinase (5.000FU/g),
Nattokinase plus FUcoidan (2.000FU/g), Nattokinase plus (3.000FU/g), Japato
(600FU/g).
1.3. Lên men sản xuất enzym từ Bacillus subtilis natto
Quy trình thu nhận chế phẩm enzym từ vi sinh vật gồm bốn giai đoạn chủ
yếu:
 Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật
 Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym
 Chiết tách và thu nhận enzym
 Kiểm tra độ sạch của chế phẩm enzym
Quá trình phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống VSV nhằm tạo ra giống vi
sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym nghiên cứu với hiệu quả cao; sử dụng các
biện pháp như: gây đột biến bằng tác nhân vật lý, hóa học, sinh học phân tử (biến
nạp, tải nạp, tiếp hợp gen) [11], [29].
1.3.1. Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym
a) Phương pháp lên men bề mặt (phương pháp rắn, phương pháp nổi: solid
state fermentation)
Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường dinh dưỡng ở thể rắn đã được
làm ẩm và vô trùng. Môi trường này thường gồm các nguyên liệu tự nhiên như cám
gạo, khô cám, cám mỳ, ngô (chiếm 90 - 95%) có bổ sung trấu nhỏ hoặc mùn cưa
9

(khoảng 5 - 10%) để làm xốp canh trường khiến oxy dễ thâm nhập. Các nguyên liệu
trên cung cấp các chất dinh dưỡng như: nitơ, carbon, vitamin, muối khoáng cho
VSV phát triển. Môi trường được làm ẩm (50 - 60%) và tiệt khuẩn (1atm, 120
0
C)
sau đó hạ nhiệt độ xuống 30 - 40
0
C để gieo vi sinh vật. Nuôi VSV ở nhiệt độ 28 -

Vi sinh vật là những cơ thể sống, chúng có nhu cầu về các chất dinh dưỡng.
Ngoài ra, sự sinh trưởng chúng còn chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố môi trường sống
như nhiệt độ, pH, lượng oxy,… Các yếu tố này có thể kích thích sinh trưởng phát
triển, tăng hoạt lực enzym, hiệu quả lên men nhưng cũng có thể ức chế hoặc tiêu
diệt các tế bào vi sinh vật.
10

a) Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ môi trường và vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết. Nhiệt độ ảnh
hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzym của VSV cũng như tính
chất của enzym được tổng hợp. Ví dụ khi nuôi Bacillus coagulans ở 35
0
C và 55
0
C
thì amylase sinh ra có khả năng chịu nhiệt khác nhau. Amylase thu nhận khi nuôi ở
35
0
C bị mất 90 – 94% hoạt tính khi giữ ở 90
0
C trong một giờ, trong khi amylase thu
nhận ở trường hợp 55
0
C chỉ mất có 12% hoạt tính [16].
Mỗi vi sinh vật đều có một nhiệt độ tối thiểu, tối thích và tối đa mà chúng có
thể chịu được. Khi nhiệt độ quá cao thì vi sinh vật sẽ chết, enzym bị biến tính, màng
tế bào bị tổn thương tới mức khó phục hồi. Tại điều kiện nhiệt độ rất thấp màng
sinh chất bị đông kết lại, enzym cũng ngừng hoạt động [7], [62].
b) Ảnh hưởng của thời gian lên men
Thời gian nuôi cấy thích hợp của mỗi loại vi sinh vật được xác định bằng

khuấy phải làm việc liên tục và lưu lượng khí sục vào mạnh hơn 60m
3
/m
3
môi
trường/giờ [16].
d) Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng
Dinh dưỡng là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng tới sự phát triển và tổng hợp
enzym của vi sinh vật. Cùng một loại VSV nhưng nếu nuôi cấy trên các môi trường
có thành phần dinh dưỡng khác nhau thì mức độ và thành phần enzym được tạo ra
cũng khác nhau. Nếu môi trường có những chất khó đồng hóa thì vi sinh vật sẽ tiết
ra những enzym tương ứng để phân hủy chúng thành những chất đồng hóa được. Vì
vậy, khi cho chất cảm ứng vào môi trường dinh dưỡng thì khả năng tổng hợp enzym
của vi sinh vật có thể tăng lên gâp nhiều lần so với bình thường. Trong công nghiệp
sản xuất enzym cần phải lựa chọn chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối
ưu của nó trong môi trường để có hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất [7], [15].
Một số nghiên cứu đã xác định maltose là nguồn hydratcarbon tốt nhất để
tổng hợp nattokinase [4], [34]. Khi bổ sung maltose vào môi trường cũng làm tăng
khả năng sinh α-amylase của B. subtilis [40].
e) Ảnh hưởng của pH
pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp
của vi sinh vật, đó là do sự tác dụng trực tiếp của ion H
+
hoặc ion OH
-
đến tính chất
keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzym [2]. Việc lựa chọn pH môi trường thu
enzym phụ thuộc vào chủng vi sinh vật và loại enzym. pH môi trường nuôi cấy B.
subtilis nhằm thu α-amylase thích hợp nhất là 6,8 – 7,5 còn để tổng hợp protease là
12

12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h [42].
Năm 2009, Ming Fei-ping et al. nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men B.
natto. Tác giả lên men vi sinh vật trong khoảng nhiệt độ từ 30
0
C – 39
0
C và ở các
tốc độ lắc là 100v/p; 150 v/p; 200v/p; 250v/p kết quả cho thấy từ 35
0
C – 39
0
C, B.
natto phát triển tốt và phát triển mạnh mẽ nhất ở điều kiện nhiệt độ 37
0
C, tốc độ lắc
200v/p [60].
Năm 2010, Mukesh D. Nimkar khảo sát nhiệt độ nuôi cấy B. subtilis WB
trong khoảng nhiệt độ (10
0
C – 50
0
C) thấy hoạt độ amylase cao nhất khi lên men vi
sinh vật ở 30
0
C [40].
Năm 2011, Zhang Anping et al. tiến hành lên men B. subtilis natto trong
khoảng nhiệt độ từ 25
0
C – 45
0

giống của Viện sinh học nhiệt đới và từ thực phẩm Natto) có khả năng tổng hợp
mạnh nattokinase. Hoạt tính enzym cao nhất sau 40h nuôi cấy (hoạt tính nattokinase
của Bacillus sp 7.2 và Bacillus sp. NP3 tương ứng là 464,4 FU/g và 472,2 FU/g)
tương đương với hoạt tính nattokinase của một số thực phẩm chức năng trên thị
trường [8].
Năm 2013, Nguyễn Quỳnh Uyển và nhóm nghiên cứu đã phân lập từ thức ăn
lên men truyền thống được hai chủng là Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus
atrophaeus có hoạt tính nattokinase. Đồng thời khảo sát nhiệt độ lên men (30
0
C và
37
0
C) và thời điểm thu enzym (24h, 48h, 72h) cho thấy ở cả hai chủng, nhiệt độ,
thời gian nuôi cấy tối ưu là 37
0
C và 24h [13].
Năm 2013, Dương Nhật Linh và cộng sự cũng đã tuyển chọn chủng vi sinh
vật sinh enzym phân giải fibrin từ đậu nành lên men và xác định hoạt tính enzym
tiêu fibrin tại các thời điểm 0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 30 giờ, 36 giờ, 42 giờ, 48
giờ, 66 giờ, 72 giờ. Kết quả cho thấy chủng B. subtilis NT68 phân lập từ Natto –
Miso (Nhật Bản) có hoạt tính tiêu fibrin mạnh nhất sau 36 giờ nuôi cấy [6].
14

1.4.2. Nghiên cứu về chiết tách và thu nhận enzym
Các nghiên cứu về quy trình chiết tách các protease ngoại bào của B. subtilis
natto trên quy mô thí nghiệm được nêu trong Bảng 1.1. Phương pháp chiết tách hay
dùng là kết tủa protease bằng amoni sulfat 60% bão hòa. Tinh chế bằng cách kết
hợp nhiều phương pháp khác nhau. Nhìn chung hiệu quả và mức tinh sạch enzym
sau chiết tách của các quy trình là rất khác nhau [48].
Bảng 1.1. Một số nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của

Tách lấy E thô: nước
Loại tạp: siêu lọc
Làm giàu protein: cô dưới
áp suất giảm.
Sắc kí kị nước Butyl – Toyopearl
Quá trình tinh chế được lặp lại nhiều
lần
Cong Wang
(2009) [53]
Tủa enzym: AS 30 – 60%
bh
Thẩm tích
Sắc kí lọc gel Sephadex G – 75
Sắc kí kị nước Phenyl Sepharose Hiệu
quả: 43,2%.
Mức tinh sạch: 56,1
Nguyễn Thị
Lập, Nguyễn
Thị Loan
(2013) [5]
Tách lấy E thô: NaCl 0,9%
Kết tủa loại tạp: AS 19%
Tủa enzym: AS 45%.
Thẩm tích
Sắc kí lọc gel Sephadex G – 75
Đinh Thu
Hương
(2013) [4]
Tủa enzym: AS 60% bh
Sắc kí lọc gel Sephadex G – 75

2
PO
4
Trung Quốc
Casein
Trung Quốc
Na – K tatrat
Trung Quốc
Tinh bột
Việt Nam
CMC
Trung Quốc

Nattospes: thành phần Nattokinase:300FU/100mg, tá dược vừa đủ cho một viên
nang; SĐK: TCCL: 9234/2009/YT – CNTC; do công ty IMC (Việt Nam) sản xuất.
 Cách pha chế một số dung dịch hóa chất:
 Dung dịch đệm phosphat pH = 7,6:
+ Pha dung dịch kali dihydrophosphat 0,2M: Hòa tan 1,36g KH
2
PO
4
trong
nước vừa đủ 50,0ml.
+ Pha dung dịch natri hydroxyd 0,2M: Hòa tan 0,4g NaOH trong 30ml nước.
Thêm nước vừa đủ 50,0ml.
+ Trộn 50,0ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2M với 42,8ml dung dịch
natri hydroxyd 0,2M. Thêm nước vừa đủ 200,0ml.
 Thuốc thử Lugol:
Hòa tan 2,0g KI trong nước. Tiếp tục hòa tan 1,0g Iod, thêm nước vừa đủ
100,0ml. Bảo quản trong lọ nút kín.

Danh sách thiết bị sử dụng được đưa ra trong Bảng 2.2
Bảng 2.2. Thiết bị được sử dụng
Tên
Nguồn gốc (Hãng)
Tên
Nguồn gốc (Hãng)
Tủ cấy vô trùng
Italia (UV Bioair)
Máy lắc
Đức (Bioshaker)
Tủ ấm, tủ sấy
Đức (Memmert)
Cân phân tích
Đức (Satorius)
Nồi hấp tiệt trùng
Nhật (ALP)
Cân kỹ thuật
Đức (Satorius)
Lò vi sóng
Hàn Quốc (Daewoo)
Máy đo pH
Đức (Presica)
Tủ lạnh
Nhật (Toshiba)
Máy UV –
VIS
Nhật (Hitachi)
Máy li tâm
Đức (Universal)
Máy khuấy từ