BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HUỆ
TRIỂN KHAI PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH
GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN
OXIDASE IN VITRO TRÊN ĐĨA 96
GIẾNG VÀ ÁP DỤNG VỚI MỘT SỐ
CÂY THUỐC CÓ TIỀM NĂNG KHAI
THÁC CỦA ĐỒNG BÀO PAKO – VÂN
KIỀU
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
T.S. Nguyễn Thùy Duơng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược lực
HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu của các
tập thể, các thầy cô giáo, bạn bè và những người thân của tôi.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thùy Dương,
người thầy đã hướng dẫn tận tình và quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực
hiện khóa luận.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu và các bộ môn trường
1.1.1. Định nghĩa 3
1.1.2. Mối liên quan giữa bệnh gút và sự tăng acid uric máu, vai trò của enzym
xanthin oxidase 3
1.1.3. Thuốc ức chế xanthin oxidase 5
1.2. Tổng quan về xanthin oxidase 6
1.2.1. Nguồn gốc, phân bố 6
1.2.2. Cấu trúc, cơ chế hoạt động 7
1.2.3. Động học enzym 9
1.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ enzym 9
1.3. Phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthine oxidase in vitro 11
1.3.1. Phƣơng pháp đo quang 12
1.3.2. Phƣơng pháp đo áp 13
1.3.3. Phƣơng pháp đo sử dụng HPLC với detector huỳnh quang 14
1.4. Các dƣợc liệu có tiềm năng ức chế xanthin oxidase 14
1.5. Thông tin về một số dƣợc liệu của đồng bào Pako- Vân Kiều 15
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 17
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 17
2.1.1. Dƣợc liệu nghiên cứu 17
2.1.2. Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu 18
2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 18 2.2.1. Thuốc và hóa chất 18
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ 19
2.3. Nội dung nghiên cứu 19
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 20
2.4.1. Triển khai phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro
trên đĩa Costar 96 giếng 20
2.4.2. Áp dụng đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar
IC
50
: nồng độ ức chế 50% (the half maximal inhibitory concentration)
IXP : isoxanthopterin
NSAIDs : thuốc chống viêm không steroid (non steroidial anti inflammatory drugs) DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Thông tin về một số cây thuốc của đồng bào Pako –
Vân Kiều 16
Bảng 2.1. Danh sách các cây thuốc nghiên cứu 17
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase
của allopurinol ở các nồng độ khác nhau 28
Linewweaver – Burk 22
Hình 2.3. Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế xanthin
oxidase của một mẫu thử 23
Hình 2.4. Quy trình thí nghiệm xác định cơ chế ức chế xanthin
oxidase 24
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc theo thời gian của
lượng acid uric tạo thành (biểu diễn thông qua OD)
với các dung dịch enzym ở nồng độ khác nhau 26
Hình 3.2. Đồ thị Lineweaver – Burk của xanthin oxidase 27
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase của
allopurinol theo nồng độ 29
Hinh 3.4. Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase của
quercetin theo nồng độ 30
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase của
cao toàn phần Mán đĩa theo nồng độ 36
Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn cơ chế ức chế xanthin oxidase của cao
phần mán đĩa 37 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Gút là một bệnh chuyển hóa, có liên quan trực tiếp đến chế độ ăn uống giàu
acid nucleic nhƣ thịt (đặc biệt là nội tạng), các loại đậu, một số loại hải sản và nấm
men. Bệnh xảy ra ở mọi dân tộc, mọi điều kiện địa dƣ và khí hậu, có chiều hƣớng
phát triển ở thành thị và các tầng lớp có mức sống cao [1]. Trên thế giới hiện nay, tỉ
lệ mắc gút ở ngƣời trƣởng thành là 1%, đây cũng là bệnh viêm khớp phổ biến nhất
ở nam giới [14]. Ở Việt Nam gần đây, đời sống ngƣời dân ngày càng cao lại đƣợc
quan tâm chẩn đoán nên tỉ lệ phát hiện mắc gút ngày càng lớn [12].
3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về bệnh gút
1.1.1. Định nghĩa
Gút là một bệnh rối loạn chuyển hóa liên quan đến tình trạng tăng acid máu
[1],[7],[20]. Bệnh biểu hiện bởi các cơn viêm khớp cấp tái diễn lặp đi lặp lại liên
quan đến tinh thể urat kết tinh, bệnh thận do gút, sỏi thận, sự lắng đọng của natri
urat (tophi) ở sụn, gân, màng hoạt dịch và những mô khác của cơ thể [20].
1.1.2. Mối liên quan giữa bệnh gút và tăng acid uric máu, vai trò của xanthin
oxidase
thuốc mới đƣợc ứng dụng trong điều trị gút. Một số thuốc điều trị gút cơ bản đang
đƣợc sử dụng hiện nay là thuốc chống viêm và thuốc hạ acid uric máu. Thuốc chống
viêm nhƣ colchicin hay NSAIDs thƣờng đƣợc dùng chủ yếu để điều trị các đợt cấp
của gút với tác dụng giảm đau, chống viêm [4],[11]. Gút là một bệnh mạn tính mà
5
nguyên nhân là chứng tăng acid uric máu. Sử dụng thuốc nhằm mục đích giảm nồng
độ acid máu trong cơ thể sẽ góp phần cải thiện đƣợc gút và ngăn ngừa tái phát. Có 2
con đƣờng để thực hiện đƣợc điều này, một là tăng đào thải, hai là giảm tổng hợp
acid uric. Thuốc tăng đào thải acid uric cũng đƣợc sử dụng trong lâm sàng nhƣng
chúng có tác dụng hạ acid uric máu yếu và dễ gây ra sỏi tiết niệu [2]. Trong khi đó,
cơ chế tổng hợp acid uric từ xanthin và hypoxanthin nhờ sự xúc tác của xanthin
oxidase đã khá rõ ràng. Ức chế xanthin oxidase sẽ ức chế quá trình tổng hợp acid
uric và làm giảm nồng độ acid uric máu, cải thiện tình trạng bệnh gút [3]. Hiện nay
đã có một số thuốc ức chế xanthin oxidase đƣợc sử dụng trong lâm sàng khá phổ
biến trong điều trị gút.
● Allopurinol
- Cơ chế tác dụng:
Allopurinol làm giảm nồng độ acid uric máu do ức chế cạnh tranh xanthin
oxidase. Ngoài ra, thuốc làm tăng bài xuất các tiền chất của acid uric qua nƣớc tiểu
và làm ổn định các hạt tophi [2].
- Sử dụng trong điều trị gút:
Allopurinol là thuốc đƣợc sử dụng phổ biến nhất để hạ nồng độ acid uric
máu. Thuốc đƣợc dùng trong điều trị gút mạn và các trƣờng hợp tăng acid máu [2].
Thuốc có giá trị đặc biệt ở những bệnh nhân có tình trạng tăng acid uric máu tổng
hợp, bệnh nhân có tophi, bệnh nhân không đáp ứng với các thuốc tăng đào thải acid
uric và bệnh nhân có sỏi acid uric [4],[11].
- Tác dụng không mong muốn:
- Gây kích ứng đƣờng tiêu hóa, độc với gan và dị ứng với da.
- Có thể gặp cơn gút cấp ở giai đoạn đầu điều trị [2].
Xanthin oxidase là một protein có khối lƣợng khoảng 300 kDa, gồm 2 tiểu
đơn vị. Mỗi tiểu đơn vị chứa bốn thế oxi hóa khử : một phần phụ molybden, một
FAD, 2 Fe
2
S
2
[8],[24]. Phần phụ molybden bao gồm một dẫn xuất pterin hữu cơ trị
với 2 nguyên tử lƣu huỳnh của molybdopterin, 2 nguyên tử oxi và với 1 nguyên tử
lƣu huỳnh khác [24]. (Hình 1.2)
7 A B
C
Hình 1.2.
Cấu trúc xanthin oxidase
A. Molybdopterin
B. Molybden cofactor
C. Cấu trúc không gian của xanthin oxidase
● Cơ chế hoạt động
Hoạt động xúc tác cho phản ứng tạo thành acid uric từ xanthin xảy ra ở trung
tâm molybden của xanthin oxidase. Ở trạng thái oxi hóa, trung tâm molybden của
enzym có thể đƣợc xây dựng nhƣ mô hình LMo
VI
OS(OH) với L là đại điện cho
đồng yếu tố pyranopterin chung cho các enzym molybden và vonfram đơn nhân.
Cơ chế hoạt động của enzym nhƣ sau: proton từ nhóm Mo-OH tấn công
trung tâm ái nhân tại vị trí C-8 của cơ chất, đồng thời vận chuyển hydro giải phóng
ra từ vị trí C-8 tới nhóm Mo=S tạo ra LMo
nồng độ enzym tăng đến một mức nào đó, sản phẩm tạo ra quá nhiều sẽ tác động
9
vào trung tâm dị lập thể của enzym, phản ứng bão hòa và tốc độ phản ứng sẽ không
tăng lên nữa [3]. Nồng độ enzym cũng là một yếu tố quan trọng khi xác định động
học enzym, thời gian dừng phản ứng thích hợp.
● Nhiệt độ
Nhiệt độ có tác dụng làm tăng tốc độ phản ứng enzym lên cực đại nhờ cơ
chế tăng năng lƣợng cung cấp cho các phân tử cơ chất. Mỗi khi tăng nhiệt độ lên
10ºC thì tốc độ phản ứng sẽ tăng lên 2 lần. Tuy nhiên, đến một nhiệt độ quá cao,
enzym sẽ bị biến tính do bị phá vỡ các liên kết trong cấu trúc. Mỗi enzym đều có
một nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động xúc tác, ở nhiệt độ đó phản ứng enzym
đạt tới tốc độ cao nhất [3]. Nhiệt độ cũng là một yếu tố trong quá trình bảo quản
enzym. Xanthin oxidase bảo quản ở nhiệt độ 4
º
C sẽ không bị giảm hoạt tính trong
vòng sáu tháng. Ở nhiệt độ -20ºC, enzym ổn định trong ít nhất một năm. Có tác giả
cho rằng, nhiệt độ hoạt động tối ƣu của enzym là 65ºC [33]. Tuy nhiên, theo một
nghiên cứu so sánh giữa xanthin oxidase từ sữa bò với xanthin oxidase từ sữa dê,
nhiệt độ tối ƣu cho xanthin oxidase từ sữa bò là 10ºC và từ sữa dê là 20ºC [21].
● pH
Enzym rất nhạy cảm với pH của môi trƣờng, vì vậy pH có tác dụng rất lớn
đối với tốc độ phản ứng enzym. Mỗi enzym có một giá trị pH phù hợp nhất cho
hoạt động của mình. Một sự thay đổi nhỏ so với pH tối ƣu cũng dẫn đến sự giảm
hoạt độ enzym do nó làm thay đổi sự ion hóa của các nhóm chức trong trung tâm
hoạt động của enzym [3]. Với xanthin oxidase, pH thích hợp là 4,7 [8]. Tuy nhiên,
có tác giả cho rằng pH thích hợp cho xanthin oxidase là 7,5 - 8 [33]. Cũng có
nghiên cứu khác lại cho thấy, pH thích hợp cho xanthin oxidase từ sữa bò là 7,5 và
từ sữa dê là 7,2 - 7,4 [21].
● Ion kim loại
11
1.3. Phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro
Để đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase, cần so sánh hoạt độ của enzym
trong môi trƣờng có và không có chất thử . Có khá nhiều phƣơng pháp xác định
hoạt độ enzym [19]:
- Dựa vào sự giảm của các tác nhân oxi hóa thích hợp nhƣ oxy, xanh
methylen, cytocrom.
- Dựa vào độ giảm của cơ chất hay sự tạo thành của sản phẩm nhƣ acid uric.
Tƣơng ứng với các nguyên tắc đó là các phép đo áp, đo nhiệt lƣợng, đo
huỳnh quang, đo quang, đo bức xạ hay đo tích điện [32].
1.3.1. Phương pháp đo quang
● Phương pháp đo quang dựa trên định lượng acid uric
Đƣợc áp dụng phổ biến nhất là phƣơng pháp của Noro [31], nguyên tắc dựa
trên phản ứng :
Xanthin + H
2
O + O
2
Acid uric + H
2
O
2
Hoạt độ xanthin oxidase đƣợc xác định thông qua việc định lƣợng acid uric
tạo thành đƣợc đo ở bƣớc sóng 290nm ở 25ºC. Một đơn vị enzym đƣợc định nghĩa
là tổng lƣợng enzym sản xuất ra 1 µmol acid uric trong mỗi phút ở nhiệt độ 25ºC.
2
O
2
Acid uric + O
2
allantoin + H
2
O
2
+ CO
2
H
2
O
2
+ ABTS
red
ABTS
ox
+ 2 H
2
O
Hoạt độ của xanthin oxidase đƣợc xác định thông qua việc đo độ hấp thụ của
ABTS
ox
tạo thành sau 10 phút ở bƣớc sóng 410nm [29].
1.3.2. Phương pháp đo áp
Trong phản ứng, xanthin oxidase đóng vai trò nhƣ một chất cho electron nên
có thể xác định hoạt độ enzym thông qua việc đánh giá sự khử của các chất nhận
là một bệnh mạn tính cần điều trị lâu dài. Do đó, việc nghiên cứu tìm nhằm tìm ra
thuốc điều trị gút từ dƣợc liệu thiên nhiên ngày càng đƣợc ƣu tiên vì có ít tác dụng
không mong muốn. Bên cạnh đó, hƣớng nghiên cứu dựa trên cơ chế ức chế xanthin
oxidase đang đƣợc quan tâm gần đây. Vì vậy, trên thế giới cũng nhƣ trong nƣớc,
ngày càng có nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành để tìm hiểu tác dụng ức chế xanthin
oxidase của các dƣợc liệu, từ đó tìm ra phƣơng hƣớng cho việc phát triển thuốc điều
trị gút từ dƣợc liệu. Có khá nhiều dƣợc liệu đã đƣợc nghiên cứu và thể hiện tiềm
năng ức chế xanthin oxidase.
Ở các nƣớc trên thế giới, đã có khá nhiều nghiên cứu sàng lọc các dƣợc liệu
có tác dụng ức chế xanthin oxidase. Trong một nghiên cứu sàng lọc các cây thuốc ở
14
Ấn Độ, có 14 dịch chiết thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase ở nồng độ 100
µg/mL trong 18 dịch chiết; trong đó có 10 dịch chiết ức chế hơn 50% với IC
50
bé
hơn 100 µg/mL; những cây thuốc có tiềm năng nhất tiếp tục đƣợc đánh giá tác dụng
hạ acid uric máu [34]. Một nghiên cứu khác nghiên cứu trên 95 dịch chiết các cây từ
New Caledonia và Vanuatu, 82 % trong số đó thể hiện tác dụng ức chế xanthin
oxidase; một số dịch chiết thể hiện tác dụng tốt với IC
50
thấp [17]. Một nghiên cứu
trên 122 dịch chiết methanol của dƣợc liệu ở Trung Quốc, có 69 dịch chiết thể hiện
tác dụng ức chế xanthin oxidase ở nồng độ 100 µg/mL với 29 cây ức chế hơn 50%,
58 dịch chiết thể hiện tác dụng ở nồng độ 50 µg/mL với 15 dịch chiết ức chế hơn
50%. Các cây tiềm năng nhất bao gồm Quế (IC
50
= 18 µ/mL), Cúc hoa (IC
50
= 22
cụ thể kiểm chứng thành phần hóa học và hoạt tính. Các cây thuốc này chủ yếu có
tác dụng chống viêm, giảm đau, lợi tiểu dùng trong các bệnh xƣơng khớp hay các
bệnh về đƣờng tiết niệu. Một số thông tin thu thập đƣợc từ những ngƣời dân bản xứ
về 10 cây thuốc đƣợc tổng hợp trong bảng 1.1.
Bảng 1.1.Thông tin về một số cây thuốc của đồng bào Pako – Vân Kiều
STT
Tên khoa học
Tên Việt
Nam
Kinh nghiệm dân gian
1
Leea rubra Blume ex
Spreng
Gối hạc
Đau nhức xƣơng khớp,
chống viêm
2
Archidendron clyearia
(Jack.)I. Niels
Mán đỉa
Chống viêm tốt, viêm cầu
thận, viêm gan, viêm phần
phụ
3
Erythropalum
scandens Blume
Dây
hƣơng
Lợi tiểu, chống viêm
Chữa đái buốt, đái ra sỏi và
viêm đƣờng tiết niệu
9
Phyllanthus
reticulatus Poir
Phèn đen
Chữa tiểu tiện khó, đi tiểu ra
máu
10
Caesalpinia
pulcherrima (L.) Sw
Kim
Phƣợng
Lợi tiểu, chữa sỏi thận
16
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Dược liệu nghiên cứu
Dƣợc liệu nghiên cứu bao gồm 10 cây thuốc của đồng bào dân tộc Pako -
Vân Kiều ở Quảng Trị đã và đang dùng để phòng và chữa bệnh liên quan đến tác
dụng chống viêm, chống oxy hoá và chống ung thƣ.
Các mẫu cây nghiên cứu đƣợc PGS. TS. Ninh Khắc Bản, ThS. Nguyễn Thế
Cƣờng – Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật – Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam xác định tên khoa học.
Các mẫu đƣợc thu hái bởi PGS.TS Nguyễn Thị Hoài – Khoa Dƣợc – Đại học
Y Dƣợc Huế.
Danh sách dƣợc liệu nghiên cứu đƣợc thể hiện ở bảng 2.1.
2.1.2. Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu
Leea rubra Blume ex
Spreng
Leeaceae
Gối hạc
Cành
mang lá,
rễ
2
BM 87
Archidendron
clyearia (Jack.) I.
Niels
Mimosaceae
Mán đỉa
Cành
mang lá
3
BM
130
Erythropalum
scandens Blume
Erythropalaceae
Dây
hƣơng
Phần trên
mặt đất
4
BM
135
Tóp mỡ
thẳng
Cành
mang lá
8
QT01
Stachytarpheta
jamaicensis (L.)
Vahl
Verbenaceae
Đuôi
chuột
Phần trên
mặt đất
9
QT02
Phyllanthus
reticulatus Poir
Euphorbiaceae
Phèn đen
Phần trên
mặt đất
10
QT03
Caesalpinia
pulcherrima (L.)
Sw
Fabaceae
Kim
Phƣợng
- Máy khuấy từ ( Heidolph, Đức).
- Máy ly tâm (HERMILE Z300).
- Micro pipet một đầu kênh 2-20µl, 10-100µl, 100-1000µl (Eppendorf, Đức).
- Micro pipet đa kênh 30-100µl (Eppendorf, Đức).
- Đĩa Costar 96 giếng 3596 (Corning, Mỹ).
- Các dụng cụ khác sử dụng trong thực nghiệm: đầu côn, micro tube các loại,
pipet, bình thủy tinh, cốc có mỏ, đũa thủy tinh
2.3. Nội dung nghiên cứu
Để đạt đƣợc những mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, đề tài nghiên cứu đƣợc
thiết kế với các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
● Thực hiện mục tiêu 1: Triển khai đƣợc phƣơng pháp đánh giá khả năng ức chế
xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96 giếng:
- Khảo sát động học enzym: nhằm mục đích
+ Lựa chọn hoạt độ enzym thích hợp cho khảo sát.
Copyright: Tài liệu đại học ©