MC LC

M ĐU 1
I. TÌNH HÌNH NG ĐC THC PHM TRÊN TH GII VÀ VIT NAM 2
II. MT S VI SINH VT CÓ TH GÂY NG ĐC THC PHM 6
2.1 Salmonella 6
2.2 Campylobacter 6
2.3 Clostridium perfringens 7
2.4 Clostridium 7
2.5 Staphylococcus 8
2.6 Vibrio spp 9
2.7 Escherichia coli 10
2.8 Shigella 10
2.9 Listeria monocytogenes 11
2.10 Các virus gây bệnh trong thực phẩm 12
2.11 Coliforms 13
2.12 Nm men và nm mc 13
III. CÁC PHNG PHÁP ĐNH LNG VI SINH VT 15
3.1 Đnh lng vi sinh vt bằng phng pháp đm trc tip 15
3.1.1 Đm bằng buồng đm hồng cu 15
3.1.2 Kỹ thut đm Breed 17
3.1.3 Đm bằng kính hin vi huỳnh quang 18
3.2 Các kỹ thut đnh lng vi sinh vt trong mu bằng phng pháp nuôi cy 19
3.2.1 Phng pháp đm khun lc 20
3.2.2 Phng pháp c đoán s lng vi sinh bằng kỹ thut MPN (Most Probable
Number): 28
3.2.3 Phng pháp lai khun lc 29
3.3 Phng pháp đo đ đc 31
IV. ÁP DNG ĐI VI MT S VI SINH VT GÂY BNH TRONG THC PHM 32
4.1 Đnh lng Fecal Coliform và E. Coli bằng phng pháp đm đĩa 32
4.2 Đnh lng Vibrio Parahaemolyticus 33

có mt s loi gây nhim thc phm nhng không làm thay đổi màu, mùi, v
hay hình dng bên ngoài ca thc phm. Vì vy rt khó nhn bit bằng cm
quan. Do đó, vic xác đnh và đnh lng các vi sinh vt gây bnh nhim trong
thc phm là điu rt cn thit.

http://www.ebook.edu.vn
2
I. TÌNH HÌNH NG ĐC THC PHM TRÊN
TH GII VÀ VIT NAM
 các nc phát trin có ti 10% dân s b ng đc thc phm và mắc
bnh truyn qua thc phm mi năm; vi các nc kém phát trin tỷ l này cao
hn nhiu. Nhiu nc có quy đnh báo cáo nhng ch đt 1% s ca b ng đc
thc phm. Ng đc thc phm  Mỹ chim 5% dân s/năm (>10 triu ng-
i/năm), trung bình 175 ca/100.000 dân, mi năm cht 5.000 ngi;  Anh: 190
ca/100.000 dân;  Nht: 20-40 ca/100.000 dân;  Úc là 4,2 triu ca/năm.

3
Thi gian báo cáo trung bình ca v ng đc là 9.74 ngày. Vi v ng đc
thc phm ≥30 ngi là 8.53 ngày (0-31 ngày), vi v ng đc <30 ngi là
10,20 ngày (1-37 ngày).
Ly mu xét nghim nguyên nhân v ng đc đt tỷ l rt thp: Mu thc
phm là 47,3%, mu bnh phm là 23,9 %; dng c, bao gói đt t l thp 1,5 %
các v ng đc.

Bảng 1: S lng các v ng đc thc phm toàn quc từ năm 2000 – 2008
Kt qu điu tra
Năm
V ng đc (vụ) S mắc (người) Cht (người)
2000 213 4233 59
2001 245 3901 63
2002
218 4.984 71
2003
238 6.428 37
2004
145 3.584 41
2005
144 4.304 53
2006
165 7.135 57
2007

247
7.329
55
2008

Đc t
t
nhiên
Nguyên
nhân
khác
2006 2 41 0 2 0 0 0 0
2007 8 137 0 7 0 1 0 0
2008 8 354 0 8 0 0 0 0
Cộng 18 620 0 17 0 1 0 0

http://www.ebook.edu.vn
4
Bảng 3: Nguyên nhân trong các v ng đc thc phm trong năm 2007
Kt qu điu tra
TT Nguyên nhân ng đc
Số lượng Tỷ lệ (%)
1
Salmonella
3 1.5
2
Streptoccocus
2 1.0
3
E.coli
4 2.0
4
Staphylococcus aurerus
7 3.4
5

Salmonella Trc năm 1983 các nhà khoa học chia Salmonella ra làm 3
loài da theo phn ng sinh hóa mà chúng tham gia : S.typhi, S.choleraesuis,S.
enteridis.
Salmonella là trc khun garm (-), hiu khí và k khí tùy ý, có kh năng di
đng không to bào tử, lên men glucose và manitol sinh acid nhng không lên
men sacarose và lactose, không sinh indole, không phân gii urê không có kh
năng tách nhóm amin từ tryptophane, hu ht các chng đu sinh H2S. pH ti
u cho chúng phát trin nằm trong vùng trung tính, tuy nhiên đôi khi phát trin
trong vùng pH từ 4 ÷ 9, không có kh năng phát trin  nồng đ mui cao.
Vi khun Salmonella tồn ti trong c th nhiu loài đng vt và có th gây
bnh cho ngI. Vi khun Salmonella có th gây bnh truyn nhim cho đng
vt nh phó thng hàn bò, phó thng hàn ln, bnh sy thai cừu và nga,
bnh bch lỵ gà, bnh viêm rut bò,… Nhng bnh k trên do Salmonella gây
ra ngi ta gọi là bnh truyn nhim nguyên phát, ngoài ra có th phá hin
đc Salmonella trong cht bài tit ca đng vt.
S lng Salmonella đ đ gây ng đc là khi chúng hin din c triu t
bào trong mt gam thc phm. Các triu chng do Salmonella gây ra thng là
tiêu chy, ói mửa, buồn nôn. Thi gian  bnh cho đn khi các triu chng biu
hin thng sau 12-36 gi k từ khi tiêu th thc phm b nhim. Triu chng
thng kéo dài ít nht từ 2-7 ngày. Không phi tt c mọi ngi khi tiêu th
th
c phm b nhim Salmonella điu có biu hin bnh, ngc li mt s ngi
không có triu chng lâm sàng khi tiêu th phi thc phm nhim vi sinh vt
này khi đó chúng đc bài tit ra ngoài. Các loi thc phm có nguy c b
nhim Salmonella nh tht gia cm, sn phm tht, trng và các sn phm ca
trng, thy sn. Nguồn nhim vi sinh vt vào các loi thc phm thng có
nguồn gc từ đng rut ca ngi và các loài đng vt, chúng có th đc
nhim gián tip hay trc tip. Salmonella gây nên bnh st thng hàn thuc
các serotype Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B, C. các dòng này
thng không gây bnh cho các loài đng vt.

mm và nhân lên. Khi đun nu thc ăn  nhit đ thp và thi gian ngắn có th
làm cho các dòng kháng nhit tồn ti vì th chúng s gây tái nhim sau khi bo
qun. Các nguồn thc phm có th gây ng đc vi các vi sinh vt này thng
là tht gia cm, nht là các loi gia cm ln đông lnh sâu, tht trong các hm
cha. C. perfringens cũng đc tìm thy trong đt, trong phân ngi và trong
các loi thc phm khác. Các triu chng do vi sinh vt này gây ra thng là
đau thắt vùng bng, tiêu chy. Thi gian  bnh từ 12-24 gi. Các triu chng
lâm sàng gây nên do đc t ca chúng.
2.4 Clostridium
Clostridium là các vi khun garm (+), hình que, k khí sinh bào tử , không
di đng, có th thy gii saccaride và protein trong các hot đng thu nhn
năng lng to ra các sn phm nh acid acetic, butiric, ru, to ra các mùi
khó chu trong sn phm. Clostridium phát trin mnh  nhit đ 55
o
C, nhit đ
ti u là 43 ÷ 47
o
C. Nhit đ 15 ÷ 20
o
C làm chm hoặc làm ngng s phát trin
ca vi khun này. Không phát trin  pH hn 5,0 hoặc trên 9,0, b c ch bi
5% NaCl. Clostridium hin din trong đt, mt s loài trong nhóm này gây
bnh cho ngi và đng vt, mt s loài khác gây h hng thc phm, khử
sunphit thành sunphur to ra màu đem và gây mùi khó chu.
http://www.ebook.edu.vn
8
Clostridium botulinum là vi sinh vt sinh đc t gây bnh ng đc tht cho
ngi (botulism). Bnh biu hin rt nghiêm trọng  ngi. Bnh gây ra do đc
t đc hình thành bi C.botulinum nhim trong thc phm. Triu chng lâm
sàng ca bnh là ói mửa, buồn nôn, sau đó có nhng biu hin ri lon thành

o
C chúng vn sng trong 30 phút), có kh năng sng  nồng đ
mui 9 ÷ 10%. Staphylococcus phát trin  pH rt rng (pH = 4,0 ÷ 9,8).
Khong pH ti u ca chúng là 6 ÷ 7 và aw ti u khong 0,83 ÷ 0,86.
Staphylococcus có kh năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose,
sucrose. Staphylococcus đc phân b khắp ni nhng ch yu đc phân lp
từ da và màng nhy ca ngi và đng vt máu nóng. Staphylococcus có th
nhim vào trong thc phm qua con đng tip xúc vi ngi thao tác trong
quá trình ch bin thc phm. S hin din vi mt đ cao ca Staphylococcus
trong thc phm ch th điu kin v sinh và kim soát nhit đ kém ca quá
trình ch bin.
Staphylococcus aureus là VSV có kh năng sn sinh mt s loi đc t
đng rut bn nhit, không b phân huỷ khi đun  100
o
C trong khong 30
http://www.ebook.edu.vn
9
phút. Khi vi sinh vt này xâm nhim vào trong thc phm, chúng tit đc t
vào trong sn phm và gây đc. Khi con ngi tiêu th loi thc phm có cha
đc t này, sau 4-6 gi  bnh s bc phát các triu chng lâm sàng nh tiêu
chy, nôn ma, các triu chng này kéo dài từ 6-8 gi. Các loi thc phm có
cha hàm lng mui cao thng có nguy c nhim vi sinh vt này nh
jambon, kem tổng hp, nc soup… vì các loi thc phm này ít khi đc xử
lý  nhit đ cao hn 40
o
C. Các loi thuỷ sn hay thc phm đóng hp cũng
thng hay b nhim loài vi sinh vt này. Các nguồn lây nhim vào thc phm
ch yêu từ các khâu ch bin trong nhà bp. Trong t nhiên các vi sinh vt này
thng tình thy trên da, mũi, tóc hay lông ca các loài đng vt máu nóng.
2.6 Vibrio spp

10
bnh có th xut hin trong khong 2-96 gi sau khi tiêu th thc phm b
nhim, thi gian này ph thuc vào liu lng xâm nhim và th trng ca từng
bnh nhân, loi thc phm tiêu th và hàm lng acid trong d dày. Các biu
hin bnh lý khi vi sinh vt này xâm nhim và đau thắt vùng bng, viêm nhim
đng rut và tiêu chy nhẹ.
Các loài Vibrio khác khi xâm nhim vào trong thc phm cũng có th gây
nên các bnh đng rut và có biu hin bnh lý tng t nh hai loài trên. Dĩ
nhiên tuỳ từng loài và liu lng mà có nhng biu hin bnh nặng nhẹ khác
nhau. Ch riêng loài V. vulnificus không gây các triu chng bnh đng rut
mà chúng gây nhim trùng máu cho ngi.
2.7 Escherichia coli
E.coli thuc họ Enterbacteriaceae, catalose (+), oxidase (-), gram (-), trc
khun ngắn, không to bào tử, chu đc nhit, không b hy khi đun nóng
100oC trong 2 gi. E.coli có th kháng cồn, không b hy khi tip xúc vi cồn
50%, b hy bi focmol 5%, có kh năng phát trin  nhit đ từ 30 ÷ 50
o
C,
nhit đ phát trin ti u ca chúng là 37
o
C, phát trin  pH ti u là 4,4 và aw
ti u là 0,95.
E. coli là vi sinh vt hiu khí phổ bin trong đng tiêu hoá ca ngi và
các loài đng vt máu nóng. Hu ht các dòng E. coli tồn ti mt cách t nhiên
và không gây hi trong đng tiêu hoá, ngc li chúng còn đóng vai trò quan
trọng trong vic ổn đnh sinh lý đng tiêu hoá. Tuy nhiên có ít nht 4 dòng
sau đây có th gây bnh cho ngi và mt s loài đng vt:
Enterobathogenic E. coli (EPEC)
Enterotocigenic E. coli (ETEC)
Enteroinvasive E. coli (EIEC)

S lây nhim vi khun Shigella ch yu đng ming. Nc là mt môi
trng truyn bnh quan trọng, đặc bit  nhng ni kém v sinh. Tuy nhiên
các loi thc phm cũng là nguyên nhân gây nên các bnh do Shigella. Vi sinh
vt này nhim vào thc phm qua nguyên liu hay quá trình ch bin. Ðôi khi
nhim bnh do v sinh cá nhân kém.
2.9 Listeria monocytogenes
Trong nhng năm gn đây L. monocytogenes nổi lên nh mt mt tác
nhân gây bnh nguy him. Đi tng gây bnh ca vi sinh vt này là trẻ em,
ph n mang thai hay nhng ngi già. Đi vi nhng vi sinh vt gây bnh g
đc thc phm khác, chúng bc phát bnh khi con ngi hp thu đ liu lng,
sau thi gian  bnh các triu chng lâm sàng biu hin. Ngc li L.
monocytogenes hin din vi mt s lng nh trong thc phm, khi đc đa
vào c th, chúng tồn ti và ch c hi. Khi có điu kin thun li, chúng nhân
lên xâm nhim vào các mô sâu và gây bnh. Các bnh do vi sinh vt này gây
nên bắt đu từ đng tiêu hoá nh tiêu chy, st nhẹ. Sau đó chúng xâm nhim
vào các đi thc bào gây nên bnh nhim trùng máu, tác đng lên h thn kinh
trung ng, tim mắt, và có th xâm nhp vào bào thai gây nên sy thai, đẻ non
hay nhim trùng thai nhi.
L. monocytogenes thuc loi vi sinh vt a lnh, chúng có th phát trin 
nhit đ từ 2-44
o
C. Chúng thng đc phân lp từ các loi thc phm nh
phomat sa, tht cá rau qu và thm chí phân lp đc từ trong nc mặt.
Trong tt c các công đon ch bin thc phm, sa hay rau qu đu có kh
năng xâm nhim vi sinh vt vt này. Đặt bit trong công đon bo qun các sn
phm  nhit đ thp, vi sinh vt này có c hi phát trin thành s lng ln.
Các sn phm thanh trùng Pasteur và đc bo qun  nhit đ thp trong các
t lnh có nguy c nhim vi sinh vt này rt cao.

http://www.ebook.edu.vn

Liu lng gây bnh ca virus có th thp hn rt nhiu so vi vi khun khi
con ngi tiêu th thc phm b nhim. Liu lng gây nhim ti thiu ca mt
s loài vurus đng rut tng đng vi s lng hin din trong thc phm
mà các phòng thí nghin có th phát hin đc bằng phng pháp nuôi cy.
C th ngi và các loài đng vt là nguồn cha các virus đng rut. Virus
đc tìm thy vi s lng ln trong phân ca nhng ngi b nhim và tồn ti
trong nhiu ngày đn nhiu tun. S nhim phân vào trong thc phm bằng con
đng gián tip hay trc tip là con đng xâm nhim virus vào thc phm.
S sng sót ca virus trong môi trng hay trong thc phm ph thuc
vào yu t nh nhit đ, nồng đ mui, cng đ bc x mặt tri hay s hin
din ca các thành phn hu c khác. Virus đng rut cũng có kh năng tồn
http://www.ebook.edu.vn
13
ti nhiu tháng trong nc bin  nhit đ < 10
o
C thm chí có th lâu hn. Vì
th đây cũng là nhân t ch th ô nhim phân. Tt c các virus đng rut đu
kháng vi acid, các enzym thy gii, hay mui mt có trong đng tiêu hoá.
Mt s virus có th kháng nhit nh Hepatits type A, mt s khác có th kháng
vi các cht ty u nh phenolic, ethanol …. Ozon và chlorine là nhng tác
nhân có th làm bt hot mt vài loi virus đng rut.
Đ ngăn ngừa các bnh do virus từ thc phm, các loi thc ăn phi đc
nu chín,khử virus trc khi tiêu th, các loi nhuyn th ăn lọc phi đc khai
thác tronng nhng vùng nc không nhim virus hay đc nuôi trong các vùng
nc sch trc khi tiêu th.
2.11 Coliforms
Coliforms là nhng trc khun hình gy, gram âm (-), không sinh bào tử,
hiu khí hoặc kỵ khí tùy ý. Chúng có kh năng phát trin  nhit đ rt rng từ
-2
o

dng. Chúng ch có kh năng nhn các cht dinh dng  dng hòa tan. Trong
quá trình trao đổi cht xy ra  t bào chúng li có kh năng chuyn hóa các
cht hòa tan thành các cht không hòa tan nh lignocellulose,…. Ngoài ra,
chúng còn có th to ra các cht đc, các cht đc ca chúng đc gọi chung là
http://www.ebook.edu.vn
14
đc t vi nm (mycotoxins). Tiêu biu có Aspegillus flavus, Aspegillus
parasiticus, Aspegiluus moninus, Penicillium italicum, Penicillium digitatum,
Penicillium roquefortii, Penicillium cammenbertii. Trong thc phm nm mc
và nm men hin din có th tăng trng làm thay đổi màu ca thc phm, làm
phát sinh muồi hay v l, làm h hng hay thay đổi c cu ca thc phm, mt
s có th to đc t gây ng đc thc phm.

http://www.ebook.edu.vn
15

, th tích này tng đng
vi 0,00005ml. Thêm vài giọt formalin vào trong nhng lọ cha mu, trn đu.
Pha loãng mu cn đm sao cho trong mi ô nh ca buồng đm có khoãng 5 -
10 t bào vi sinh vt. Đ đt đc đ pha loãng nh vy cn phi c lng
đc s lng vi sinh vt trong mu, đồng thi phi thử vài ln trong quá trình
pha loãng. Mu phi đc pha loãng bằng dung dch pha loãng cha 0,1%
pepton và 0,1% laurylsulphat và 0,01% methyl blue. Tt c các dung dch pha
loãng đu phi cn lọc trc khi sử dng.

http://www.ebook.edu.vn 16
http://www.ebook.edu.vn
17
Đặt mt giọt mu đc pha loãng vào trong đĩa đm trên buồng đm, đy
bằng kính đy vt. Tt c các buồng đm và kính đy vt phi đc lau tht
sch. Th tích mu cha trong buồng đm là khong không gian gia đĩa đm
và kính đy vt, không đ mu tràng ra bên ngoài rãnh ca đĩa. Sau khi đt
mu, đ yên khong 5 phút đ ổn đnh v trí ca các t bào trong buồng đm.
Đm ngu nhiên khong 50-100 ô nh. Tính trung bình s lng vi khun trong
tt c các ô đã đm. Sau đó nhân vi 20 000 và vi đ pha loãng mu trc khi
đm đ có đc s lng t bào trong 1ml. Lặp li hai ln hay nhiu hn đ ly
giá tr s đm trung bình. Đi vi các vi sinh vt t thành từng cm, không th
phân bit từng t bào thì mi cm đc xem là mt vi khun.
Vi nhng kinh nghim ca mi cá nhân v đ pha loãng, thao tác kỹ
thut thành tho có th nhn đc các s đm chính xác. Tuy vt kt qu có
chính xác hay không còn ph thuc vào s sch s ca buồng đm, kính đy
vt nhằm đm bo không có vi khun khác không phi từ mu hin din trong
buồng đm và trong kính đy vt.
3.1.2 Kỹ thut đm Breed
Kỹ thut này r
t hu ích trong vic xác đnh tổng s vi sinh vt bằng

18
AODC. Hai tác gi trên cũng chng minh rằng khi nhum vi DAFI có th bo
qun trong ti đn 24 tun mà cng đ phát quan không thay đổi. Trong khi
đó AODC cng đ và s lng phát quang b gim khi bo qun trong vòng 1
tun  cng điu kin.
3.1.3 Đm bằng kính hin vi huỳnh quang
Mt kỹ thut khác da trên nguyên tắc nhum màu đặc hiu DNA đc
gọi là Hoechst 33258 cũng đc sử dng đ nhum và đm s lng vi sinh vt
trên kính hin vi huỳnh quang. Phng pháp này nh sau: Bisbenzumide kt
hp vi vùng DNA giàu adenine và thyamine sau khi gắn phc hp này s phát
huỳng quang. Hoechst 33258 đc sử dng nhiu trong vic đnh lng vi sinh
vt trên b mặt. Đặt bit trên b mặt có gắn các acridine orange. Mt s thun
li khác khi sử dng phng pháp nhum màu bisbenzimide cho phép đm s
lng vi sinh vt trong các dng dch cht ty rửa, trong mui dùng cho các
phòng thí nhim hay trong các ch phm sinh học khác mà không có s hin
din ca DNA. Phng pháp đm s lng vi sinh vt bằng phng pháp phát
huỳnh quang đc ng dng rng rãi trong vic phân tích các mu môi trng
nh nc đt ….
Sử dng du nhúng phát quang thp là mt phát minh quan trọng trong
vic hn ch s phát huỳnh quang ca các màng lọc. Màng carbonate
Nuclepore là mt màng cellulose cao cp dùng trong vic đm trc tip vi
khun bi vì chúng có kích thc lổ đồng nht và b mặt màng phẳng, chúng
có th gi li tt c các vi sinh vt trên b mặt ca chúng. Màng Nuclepore có
th nhum vi thuc nhum Irgalan đen hay các loi thuc nhum phù hp
khác đ to nên mt nn màu đen tng phn vi màu phát quang ca vi sinh
vt vì th vic đm đc thc hin d dàng. Khi sử dng thuc nhum là
acridine cam vi khun và các vi sinh vt khác phát quang màu xanh hay màu
cam. Màu phát quang xanh hay cam là ph thuc vào tình trng sinh lý ca
từng vi sinh vt. Nhng kh năng phân bit t bào đang sng hay t bào đã cht
bi mu phát quang đôi khi đa đn s nhm ln. Sử dng ADPI nhum DNA

huỳng quang cn phi đm nhiu ln và nhiu v trí khác nhau trên mu.
Thêm vào đó nu đm nhiu t bào đang phân chia có th cho phép c
đoán tc đ phát trin ca vi sinh vt trong mu. Tn sut ca t bào đang phân
chia đc nhìn thy có mi liên h vi ch s đo khác ca tc đ phát trin vi
sinh vt nh tc đ tổng hp RNA đc đo bi s phòng thích ca adenine đc
đánh du. Tng xut ca t bào đang phân chia đc tính bằng thi gian gia lúc
bắt đu s thắt ca t bào đn khi t bào phân chia là mt hằng s. Con s này
không phi là bt bin. Tht khó khăn đ nhn ra s phân chia t bào khi sử dng
kính hin vi quang học mà không sử dng kính hin vi phát huỳnh quang.
3.2 Các kỹ thut đnh lng vi sinh vt trong mu bằng phng pháp
nuôi cấy
Có hai cách đ xác đnh s l
ng vi khun bằng phng pháp nuôi cy:
phng pháp đm khun lc và phng pháp c đoán s lng vi khun
(MPN – Most probable number). Tt c các phng pháp đnh lng vi khun
http://www.ebook.edu.vn
20
trong mu bằng phng pháp nuôi cy đu yêu cu các t bào phi đc tách
ri nhau, qua quá trình nuôi cy các t bào này phát trin thành các dòng riêng
bit. Tt các qui trình đnh lng bằng phng pháp nuôi cy nhằm chọn lọc
mt hay nhiu nhóm vi khun nht đnh nào đó, mc đ chọn lọc ph thuc và
từng qui trình qui trình c th. Đ xác đnh tổng s vi sinh vt trong mu phi
chọn qui trình gim ti thiu kh năng chọn lọc. Nhng dù mc đ chọn lọc 
mc ti thiu cũng ch đnh lng đc s lng vi sinh vt có th nuôi cy.
Còn mt s lng ln vi sinh vt khác không th phát trin đc trong quá
trình nuôi cy thì không th đnh lng đc bằng phng pháp này. Có các
phng pháp đnh lng nuôi cy nh sau nh sau:
3.2.1 Phng pháp đm khun lc
Phng pháp đm khun lc trên đĩa đc sử dng rng rãi đ đnh lng
vi sinh vt, đặc bit là vi khun, nhng pháp này có nhng khuyt đim và đã

quá nhiu khun lc xut hin thì không th cho s lng đm chính xác bi vì
chúng có th chồng lp lên nhau. Nhng đĩa có quá ít khun lc cũng phi b đi
vì theo nguyên tắc ca xác sut.
Nhng vn đ chính yu cn xem xét trong qui trình đm khun lc là
thành phn môi trng, điu kin và thi gian nuôi . Môi trng đ đnh
lng các vi sinh vt d dng không th c đnh nit phi cha các nguồn
nit, carbon, phosphate d sử dng và các cation, anion cn thit nh sắt,
mangie, calci, natri, clo và sulphate. Thành phn ca các hàm lng không nht
đnh, chúng đặt thù cho từng loi môi trng và từng loi mu nht đnh đ có
th nhn đc s lng vi sinh vt mc tiêu cao nht. Nh vy môi trng nuôi
c
y phi có các thành phn dinh dng phù hp vi từng yêu cu ca loài vi
sinh vt, bao gồm c các nhân t cn thit khác cho s phát trin ca mt h vi
sinh vt nht đnh. Mc đích chung ca môi trng là hàm lng dinh dng
phi cao hn các thành phn có trong các mu đang phân tích. Hàm lng dinh
dng trong các loi môi trng đm tổng s vi sinh vt phi đ cao, và đc
tính ca môi trng đi vi sinh vt  mc thp nht.
Đ nâng cao hiu qu ca qui trình đnh lng vi sinh vt bằng phng
pháp đm khun lc, các điu kin cn phi điu chnh sao cho ch có các thành
viên vi sinh vt cn phát hin theo đnh nghĩa đc đm. Các môi trng đm
đĩa đc chọn lọc hay phân bit vi các thành viên vi sinh vt khác. Qui trình
đm đĩa chọn lọc đc thit k cho thích hp vi s phát trin ca vi sinh vt
mong mun. S phát trin ca các nhóm vi sinh vt khác đc loi b bi các
thành phn ca môi trng hay điu kin nuôi . Môi trng phân bit là môi
trng không loi b các nhóm vi sinh vt không mong mun mà ngc li cho
phép chúng phát trin cũng trên môi trng đó nhng có th bit phân bit các
nhóm vi sinh vt mong mun vi các nhóm khác bằng các đặc đim nhn dng.
Môi trng cũng có th đc thit lp đ chọn lọc các loài nm mc. Mặt
dù kỹ thut đm khun lc không phi là phng pháp đc chọn cho vic xác
đnh s lng nm mc trong các mu thc phm và trong môi trng. Bi vì

tác nhân c ch các vi khun gram dng. Môi trng này có th phân bit các
vi khun có th sử dng lactose bi s hình thành các khun lc có th phân
bit bằng màu sắc. Trên môi trng EMB, vi khun thuc nhóm coliforms là
nhóm gram âm to nên nhng khun lc có màu tím ánh kim. Đnh lng s
lng coliform bằng cách đm s lng khun lc có các đặc đim này. Cách
này thng xuyên đc s dng trong vic phân bit các vi sinh vt ch th
trong nc và trong thc phm.
Vi kỹ thut đn khun lc, các mu cn phân tích phi đc pha loãng
thành chui pha loãng liên tip và đc xác đnh mt vài nồng đ pha loãng
nht đnh đ cy vào các môi trng đã chọn phù hp vi các đi tng cn
xác đnh. Mổi khun lc đc hình thành đc gán cho mt đn v hình thành
khun lc (cfu-colony forming units). Kỹ thut thng qua các bc nh sau:
Dung dch pha loãng: mt s dung dch dùng đ pha loãng có th làm cht
t bào nh: nc mui, nc ct. Các dung dch pha loãng không đc dùng
ngay khi ly ra từ t lnh có th gây sc và làm cho vi sinh vt không th phát
trin đc. Dung dch pepton water là dung đch pha loãng đc sử dng nhiu
nht và đc xem là dung dch pha loãng cho tt c các loi mu. Nu trong
mu còn có mt ít các cht khử trùng thì phi thêm vào dung dch pha loãng tác
nhân gim thiu kh năng khử trùng ca chúng, ví d: nu trong mu còn d
lng ca các hp cht amonium (NH4-) thì có th thêm vào đó Tween 80 hay
lecithin. Ngc li nu trong mu có cha các hp cht chlorin hay iodin thì
cn thêm vào đó các mui nh sodium thiosulphate.
http://www.ebook.edu.vn
23
Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu
Bm chính xác 9ml dung dch pha loãng vào trong ng nghim có nắp
đy. Nu sử dng các ng nghim có nắp không đóng chặc đc thì phi khử
trùng ng nghim, sau đó bm dung dch pha loãng vào, các thao tác này phi
đc thc hin mt cách vô trùng. Phân phi dung dch pha loãng vào các ng
sau khi khử trùng còn có ý nghĩa đm bo th tích dung dch pha loãng không

cân 10 g mu vào trong các bao dp mu hay các máy xay vô trùng, thêm 90ml
http://www.ebook.edu.vn
24
dung dch pha loãng và đồng nht mu, phi đm bo sao cho vi khun phân
tán đu vào trong dung dch. Sau khi mu và dung dch pha loãng đc đồng
nht ta đc dung dch pha loãng 1/10. Các đ pha loãng sau đc tin hành
tng t nh phn pha loãng mu lng. Trong 1ml các dung dch pha loãng
cha hàm lng mu nh sau:

ng s 1 2 3 4
T l pha
loãng
1/10 1/100 1/1000 1/10000
Th tích mu
ban đu (g)
0,1 0,01 0,001 0,0001
Đ pha loãng 10
-1
10
-2
10
-3
10
-4Cấy mẫu bằng phương pháp đổ đĩa
Các môi trng agar đc đun chy trong các chai hay trong các ng
nghim có th tích phù hp. Đc làm mát trong các b điu nhit  45
o