MỤC LỤC
Danh mục hình ảnh 5
Lời mở đầu 6
CHƯƠNG 1: CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THƯỜNG ĐƯỢC KIỂM
SOÁT TRONG THỰC PHẨM
1.1. Samonella 7
1.2. Campylobacter 7
1.3. Clostridium perfringens 8
1.4. Clostridium botulinum 9
1.5. Staphylococcus aureus 10
1.6. Vibrio spp 11
1.7. Escherichia coli 12
1.8. Shigella spp 13
1.9. Coliforms 14
1.10. Listeria monocytogenes 15
1.11. Bacillus cereus 16
1.12. Aspergillus 17
1.13. Virus 18
CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT
TRUYỀN THỐNG
2.1. Samonella 20
2.1.1. Tổng quan 20
2.1.2. Nguyên tắc 20
2.1.3. Môi trường và hóa chất 21
2.1.4. Quy trình phân tích đánh định tính Salmonella trong thực phẩm 22
1
2.2. Vibrio 27
2.2.1. Tổng quan 27
2.2.2. Nguyên tắc 28
2.2.3. Môi trường và hóa chất 28
2.2.4. Quy trình phân tích 29

2.7.4. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 55
2.8. Tổng nấm men nấm mốc 57
2.8.1. Tổng quan 57
2.8.2. Nguyên tắc 58
2.8.3. Môi trường và hóa chất 58
2.8.4. Quy trình phân tích định tính 59
2.8.5. Quy trình phân tích định lượng 59
CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT
KHÔNG TRUYỀN THỐNG
3.1. Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh 61
3.2. Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 63
3.3. Phương pháp lai phân tử (Hybridization) 65
3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 66
3.5. Một số phương pháp thử nhanh khác 70
3.5.1. Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ 70
3
3.5.2. Kỹ thuật màng lọc phát huỳnh quang trực tiếp (Direct Epifluorscent
Technique – DEFT) và màng lọc lưới kỵ nước (Hydrophobic Grid
Membrane) 71
3.5.3. Kỹ thuật màng petri (Petrifilm) 71
3.5.4. Kỹ thuật Redigel 72
3.5.5. Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng (conductance/impedance) 72
3.5.6. Kỹ thuật đo vi lượng calorie (Microcalorimetry) 73
3.5.7. Kỹ thuật đo mức phóng xạ (Radiometry) 73
KẾT LUẬN 75
TÀI LIỆU THAM KHẢO 76
4
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Samonella.
Hình 1.2 Campylobacter.

2. Mục đích nghiên cứu
Nội dung báo cáo là giới thiệu về đặc trưng và phương pháp xác định một số
vi sinh vật gây ngộ độc thường xuất hiện trong thực phẩm. Qua đó giúp cho mọi
người biết được có những mối nguy nào trong việc sử dụng thực phẩm và
phương pháp để kiểm nghiệm những thực phẩm nghi ngờ có nhiễm vi sinh vật.
3. Kết cấu của khóa luận tốt nghiệp
Khóa luận gồm 3 chương:
Chương 1: Các chỉ tiêu vi sinh vật thường được kiểm soát trong thực phẩm.
Chương 2: Các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật truyền thống.
Chương 3: Các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật không truyền thống.
6
CHƯƠNG 1: CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THƯỜNG ĐƯỢC KIỂM
SOÁT TRONG THỰC PHẨM
1.1. Salmonella
Salmonella có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện đến mức cả triệu
tế bào trong một gram thực phẩm. Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường
là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị
nhiễm cho đến khi các triệu chứng được biểu hiện là 12 – 36 giờ. Triệu chứng
ngộ độc thường kéo dài từ 2 – 7 ngày. Không phải tất cả mọi người khi tiêu thụ
thực phẩm bị nhiễm Samonella đều bị ngộ độc. Các loại thực phẩm có nguy cơ
bị nhiễm Samonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các sản phẩm từ
trứng, thủy sản. Nguồn gây nhiễm các loại thực phẩm này thường là phân người
và động vật, được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp. Đặc biệt nguy hiểm cho người là
các loài Samonella typhi, S.paratyphi A, B, C gây sốt thương hàn.
7
8
Hình 1.1 Samonella
1.2. Campylobacter
9
Campylobacter gây bệnh viêm nhiễm đường ruột, hiện diện khắp nơi, đặc

các gia súc và các loài thủy sản. Vi sinh vật này sinh độc tố botulin gây ngộ độc
thịt làm thực phẩm cho người. Triệu chứng lâm sàng khi ngộ độc là ói mửa,
buồn nôn, sau đó có những biểu hiện rối loạn thần kinh như choáng váng, rối
loạn thị giác, rối loạn các cơ ở cổ và miệng, đau ở vùng ngực, khó thở và tê liệt,
có thể dẫn đến tử vong. Các triệu chứng trên biểu hiện 12 – 36 giờ sau khi tiêu
thụ thực phẩm nhiễm độc tố và kéo dài 2 – 6 ngày tùy theo mức độ nhiễm độc và
11
tình trạng sức khỏe của từng bệnh nhân. Các loại thực phẩm như thịt, rau quả
không được bảo quản đúng quy định, thực phẩm nhiễm đất, phân động vật được
chế biến không đủ nhiệt độ trước khi dùng, các sản phẩm đóng hộp không đúng
quy cách có nguy cơ gây ngộ độc bởi vi sinh vật này rất cao. Điều kiện thích hợp
cho sự tăng trưởng và tạo độc tố của vi sinh vật này là điều kiện kỵ khí, pH trung
tính, không có các vi sinh khác cạnh tranh. Độc tố botulin do C.botulinum dòng
E thường có nguồn gốc từ cá và các sản phẩm thủy sản. Dòng vi sinh vật này
thường phân lập được từ các mẫu bùn đáy tại các cửa sông.
Hình 1.4 Clostridium botulinum
1.5. Staphylococcus aureus
Trong tự nhiên Staphylococcus aureus thường được tìm thấy trên da, mũi,
tóc hay long của các loài động vật máu nóng. Staphylococcus aureus sản sinh
một số loại độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị phân hủy ở 100
o
C
trong 30 phút. Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố này, sau 4 – 6 giờ
người bị ngộ độc có các triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8 giờ. Các
loại thực phẩm có chứa nhiều muối như jambon, kem tổng hợp, nước súp (ít khi
được xử lý ở nhiệt độ cao hơn 40
o
C) và các loại thủy sản, thực phẩm đóng hộp
12
thường hay nhiễm các loài vi sinh vật này. Con đường lây nhiễm chủ yếu thông

nhẹ).
Một loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng khác là V.parahaemolyticus
tạo độc tố hemolysin bền nhiệt có phản ứng kháng nguyên Kanagawa. Tuy
nhiên, những năm gần đây người ta phát hiện ra rằng nhiều dòng
V.parahaemolyticus có phản ứng Kanagawa âm tính cũng có thể gây bệnh. Triệu
chứng ngộ độc là đau thắt vùng bụng, viêm nhiễm đường ruột và tiêu chảy nhẹ
xuất hiện 2 – 96 giờ sau khi ăn phải thực phẩm bị nhiễm. Thời gian ủ bệnh phụ
thuộc vào mật độ tế bào vi khuẩn đã xâm nhiễm và thể trạng của từng bệnh nhân.
Loài vi khuẩn này hiện diện và tăng trưởng trong môi trường có hàm lượng muối
cao, thường phân lập được từ các sản phẩm thủy sản, trong các vùng nước ấm
ven biển.
Các loài Vibrio khác khi xâm nhiễm vào trong thực phẩm cũng có thể gây
nên các bệnh đường ruột và có biểu hiện bệnh lý tương tự như hai loài trên.
Riêng loài V.vulnificus không gây các triệu chứng bệnh đường ruột mà gây
nhiễm trùng máu cho người.

Hình 1.6 Vibrio cholerae Hình 1.7 V.vulnificus Hình 1.8 V.parahaemolyticus
14
1.7. Escherichia coli
E.coli là vi sinh vật hiếu khí tùy ý hiện diện trong đường ruột của người và
các loài động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E.coli không gây hại và đóng vai
trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường ruột. Tuy nhiên có 4 dòng có thể
gây bệnh cho người và một số loài động vật là Enteropathogenic E.coli (EPEC),
Enterotoxigenic E.coli (ETEC), Enteroinvasive E.coli (EIEC) và
Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC)/Verocytoxin E.coli (VTEC) hay E.coli
O157: H7. Các loài E.coli hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm phân
hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. Gần đây
người ta còn chứng minh được rằng E.coli cũng hiện diện ở những vùng nước
ấm, không bị ô nhiễm chất hữu cơ. Do sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên nên
E.coli dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn các

nhóm nhỏ là Coliform và Coliform phân có nguồn gốc từ phân của các loài động
vật. Trên thực tế kiểm nghiệm Coliform phân được quan tâm nhiều hơn
Coliform. Coliform phân có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu nóng
bao gồm các giống Escherichia, Klebsiella và Enterobacter. Khi Coliform phân
hiện diện ở số lượng lớn trong mẫu thì mẫu có khả năng bị nhiễm nước nhiễm
phân và có khả năng chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong phân. Trong
các thành viên của nhóm Coliform phân thì E.coli là loài được sự quan tâm nhiều
nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm.
Hình 1.11 Coliforms
1.10. Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes trở thành tác nhân gây bệnh nguy hiểm ở trẻ em,
phụ nữ mang thai hay người già trong những năm gần đây. Mặc dù
L.monocytogenes chỉ hiện diện với số lượng nhỏ trong thực phẩm, nhưng khi
17
được đưa vào cơ thể, chúng tồn tại, khi có điều kiện thuận lợi sẽ tăng trưởng
nhanh xâm nhiễm vào các mô sâu hơn và gây bệnh. Triệu chứng bệnh thường
bắt đầu là tiêu chảy, sốt nhẹ, sau đó là nhiễm trùng máu, tổn thương hệ thần kinh
trung ương, tim, mắt, gây nên sẩy thai, đẻ non hay nhiễm trùng thai nhi ở phụ nữ
mang thai. L.monocytogenes ưa lạnh, tăng trưởng ở nhiệt độ từ 2 – 44
o
C, thường
được phân lập từ phô mai, sữa, thịt cá, rau quả và trong nước. Loài này có thể
nhiễm vào thực phẩm ở mọi công đoạn trong quy trình chế biến thực phẩm, sữa
hay rau quả. Đặc biệt, trong thời gian bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ thấp, loài
này có cơ hội tăng trưởng thành số lượng lớn. Các sản phẩm được thanh trùng
bằng phương pháp Pastuer và được bảo quản
trong các tủ lạnh có nguy cơ nhiễm vi sinh vật
này rất cao.
Hình 1.12 Listeria monocytogenes
1.11. Bacillus cereus

trên các loại ngũ cốc, nông sản (gạo, lúa, miến, đậu phộng, bắp, lúa mì…) không
được phơi sấy tốt, đặc biệt là ở các nước nhiệt đới với điều kiện độ ẩm và nhiệt
độ không khí cao. Từ các nguyên liệu này, nấm mốc và độc tố có thể nhiễm vào
thực phẩm gây độc cho người. Ở các chủng có khả năng sinh độc tố, sau khi tăng
trưởng 1 – 3 ngày độc tố được tạo ra và tiết vào cơ chất. Bốn loại aflatoxin được
19
tạo ra bởi A.flavus và A.parasiticus là aflatoxin B
1
, B
2
phát huỳnh quang màu
xanh (blue) và G
1
, G
2
phát huỳnh quang màu lục (green). Khi ăn cỏ hoặc thức ăn
chứa aflatoxin B
1
hoặc B
2
, bò sữa có thể chuyển hóa chúng thành các độc tố
aflatoxin M
1
, M
2
hiện diện trong sữa bò. Do aflatoxin là chất gây ung thư mạnh
nên được kiểm tra nghiêm ngặt. Hầu hết các nước đều có tiêu chuẩn quốc gia về
hàm lượng tối đa cho phép sự hiện diện của độc tố này trong nông sản, thực
phẩm, thường là 10ppb (một phần tỷ).
Hình 1.14 Aspergillus flavus Hình 1.15 A.parasiticus

nhiễm virus hay được nuôi trong các vùng nước sạch trước khi tiêu thụ.
21
Hình 1.16 Virus
CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT
TRUYỀN THỐNG
2.1. Samonella
2.1.1. Tổng quan
Là trực khuẩn Gram âm,hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, có
tiên mao, lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men
saccharose và lactose, không sinh indole, không phân giải ure, không có khả
năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H
2
S.Cho đến
nay đã xác định được 2339 serotype (kiểu huyết thanh) thuộc giống Salmonella.
Các serotype này được chia theo hệ thống của Kaffmann – White dựa trên công
thức kháng nguyên O (kháng nguyên somatic) và kháng nguyên tiên mao H
(flagella).
2.1.2. Nguyên tắc
Salmonella có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng một quy trình
gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định Salmonella
thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện
chung với một số lượng lớn các loại vi khuẩn khác thuộc họ Enterobateriaceae
có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella.
- Bước tăng sinh: tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn
quy trình tăng sinh phù hợp. Thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường tăng
sinh là 1:9, tuy nhiên tùy trường hợp cụ thể tỉ lệ này có thể thay đổi.
22
- Bước tăng sinh chọn lọc: các môi trường tăng sinh chọn lọc thường dùng
để phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm là Rappaport Vassiliadis
(RV), Selenite Cystein Broth, Tetrathionate Mueler Kauffmann Broth (TT). Các

- Thạch Hektoen Entric Agar (HE).
- Thạch Bismuth Sulphite Agar (BS).
- Thạch Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS).
- Thạch Triple Sugar Iron (TSI).
- Canh Ure.
- Canh Lysine Decarboxylase.
- Canh Ornithine Decarboxylase.
- Canh Mannitol (Phenol Red Broth Base).
- Canh Sucrose (Phenol Red Broth Base).
- Canh Sorbitol (Phenol Red Broth Base).
- Canh Tryptone.
- Thuốc thử Kovac’s.
- Kháng huyết thanh Salmonella đa giá.
2.1.4. Quy trình phân tích đánh định tính Salmonella trong thực phẩm
2.1.4.1. Tăng sinh
Đối với các loại mẫu thông thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vô
trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong
24
15 hoặc 30 giây. Ủ ở 37 1
o
C trong 18 – 24 giờ. Đối với một số loại thực phẩm
có chứa các chất có thể gây độc hoặc ức chế sự tăng trưởng của Salmonella cần
thực hiện quy trình tăng sinh đặc biệt như sau:
- Đối với mẫu gia cầm tươi sống: đặt gia cầm vào một bao nhựa lớn, thêm
1 lít môi trường tăng sinh BPW. Lắc bằng máy lắc khoảng 30 giây để môi trường
thấm được vào trong toàn bộ mẫu.
- Đối với sữa khô: cho 25g mẫu vào trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml
môi trường BPW, để yên 60 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó lắc cho đến khi sữa
tan hoàn toàn.
- Đối với các gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị: đồng nhất