VIỆN KHOA HỌC VẬT LIỆU

NGUYỄN THỊ PHƢƠNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU
MỚI TRONG CẤY GHÉP VÀ TÁI TẠO
XƯƠNG TRÊN CƠ SỞ HYDROGEL
COMPOSIT SINH HỌC GỒM BIPHASIC
CALCIUM PHOSPHATE VÀ POLYMER
SINH HỌC (GELATIN, CHITOSAN) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH KHOA HỌC VẬT LIỆU
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH-2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN KHOA HỌC VẬT LIỆU

NGUYỄN THỊ PHƢƠNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU
MỚI TRONG CẤY GHÉP VÀ TÁI TẠO
XƯƠNG TRÊN CƠ SỞ HYDROGEL

104.04-2011.49.
Sau cùng, tôi xin cảm ơn và thực sự không thể quên được sự giúp đỡ
tận tình của các thầy cô, bạn bè, anh em xa gần và sự động viên, tạo điều kiện
của những người thân trong gia đình trong suốt quá trình tôi hoàn thành luận
án này.

Tp. HCM, tháng 01 năm 2015

Tác giả

Nguyễn Thị Phƣơng ii
LỜI CAM ĐOAN
Công trình được thực hiện tại phòng Hóa dược − Viện Khoa học Vật
liệu ứng dụng − Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tại Thành phố
Hồ Chí Minh.
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và được sự
hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Nguyễn Cửu Khoa và TS. Trần Ngọc
Quyển. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực, được
hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên
cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác.

Tác giả luận án
1.3.2.Biphasic calcium phosphate 27
1.3.3.Polymer sinh học và các phản ứng biến tính, polyethyleneglycol
hóa polymer sinh học (gelatin và chitosan) 32
1.3.4.Ứng dụng của hydrogel composit trong cấy ghép và tái tạo
xƣơng 37
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 42
2.1. HÓA CHẤT 42
2.2. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 43
2.3. PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 44
2.3.1. Tổng hợp BCP 44
2.3.2. Tổng hợp hydrogel composit TA-Gelatin/BCP 45
2.3.3. Tổng hợp hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP 46
2.3.4. Tổng hợp hydrogel composit HPA-Chitosan/BCP 48
2.3.5. Tổng hợp hydrogel composit TA-Te-Chitosan /BCP 50
2.3.6. Tổng hợp hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP 52
2.3.7. Tổng hợp hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP 55

iv
2.4. CÁC KHẢO SÁT CÁC TÍNH CHẤT CỦA HYDROGEL VÀ
HYDROGEL COMPOSIT 58
2.4.1. Khảo sát thời gian tạo gel của hydrogel và hydrogel composit 58
2.4.2. Khảo sát hình thái của hydrogel và hydrogel composit 58
2.4.3. Khảo sát khối lƣợng suy giảm của hydrogel và hydrogel
composit 58
2.4.4.Đánh giá tính tƣơng hợp sinh học của hydrogel và hydrogel
composit 58
2.4.5. Khảo sát khả năng tạo khoáng của hydrogel và hydrogel
composit 59
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 62
3.1 TỔNG HỢP BCP 62

composit HPA-Chitosan/BCP 93
3.4.4. Khảo sát khối lƣợng suy giảm sinh học của hydrogel HPA-
Chitosan và hydrogel composit HPA-Chitosan/BCP 93
3.5. HYROGEL COMPOSIT TA-Te-Chitosan 95
3.5.1. Tổng hợp TA-Te-Chitosan 95
3.5.2. Tổng hợp hydrogel TA-Te-Chitosan và hydrogel composit TA-
Te-Chitosan/BCP 100
3.5.3. Khảo sát hình thái hydrogel TA-Te-Chitosan và hydrogel
composit TA-Te-Chitosan/BCP 101
3.5.4. Khảo sát khối lƣợng suy giảm sinh học của hydrogel TA-Te-
Chitosan và hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP 102
3.5.5. Đánh giá tính tƣơng hợp sinh học của hydrogel TA-Te-Chitosan
và hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP 104

vi
3.5.6. Khảo sát khả năng tạo khoáng của hydrogel TA-Te-Chitosan và
hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP 106
3.6. HYROGEL COMPOSIT TA-PEG-CHITOSAN/BCP 108
3.6.1. Tổng hợp TA-PEG-Chitosan 108
3.6.2. Tổng hợp hydrogel TA-PEG-Chitosan và hydrogel composit
TA-PEG-Chitosan/BCP 111
3.6.3. Khảo sát hình thái hydrogel TA-PEG-Chitosan và hydrogel
composit TA-PEG-Chitosan/BCP 113
3.6.4. Khảo sát khối lƣợng suy giảm sinh học của hydrogel TA-PEG-
Chitosan và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP 113
3.6.5. Đánh giá tính tƣơng hợp sinh học của hydrogel TA-PEG-
Chitosan và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP 114
3.6.6. Khảo sát khả năng tạo khoáng của hydrogel TA-PEG-Chitosan và
hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP 117
3.7. HYROGEL COMPOSIT TA-PEG-CHITOSAN OXI HÓA/BCP 119

(a) pH=7, (b) pH=9 và (c) pH=11 P9
Phụ lục 10: Giản đồ XRD của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,61 tại các pH:
(a) pH=7, (b) pH=9 và (c) pH=11 P10
Phụ lục 11: Phổ FTIR của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,57: (a) pH=7, (b)
pH=9 và (c) pH=11 P11
Phụ lục 12: Phổ FTIR của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,61: (a) pH=7, (b)
pH=9 và (c) pH=11 P12
Phụ lục 13: Xây dựng đƣờng chuẩn của độ hấp thu A và nồng độ Tyramin P13
Phụ lục 14: Phổ FTIR của gelatin P14
Phụ lục 15: Phổ FTIR của TA-PEG-gelatin P14

viii
Phụ lục 16: Giản đồ XRD (a) hydrogel TA-PEG-gelatin và hydrogel composit
TA-PEG-gelatin/BCP trƣớc khi ngâm dung dịch SBF, (b) hydrogel composit
TA-PEG-gelatin/10%BCP sau khi ngâm dung dịch SBF P15
Phụ lục 17: Xây dựng đƣờng chuẩn của độ hấp thu A và nồng độ HPA P16

ix
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
1. Danh mục các ký hiệu
W
0

Khối lƣợng mẫu ban đầu
Wt
Khối lƣợng mẫu tại thời gian t
A
Độ hấp thu
C
Nồng độ dung dịch

HRP
Horseradish peroxidase
UV-Vis
Phổ tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible Spectrum)
PLA
Polylactic axit

x
PLGA
poly(lactic-co-glycolic) axit
PPO
Poly propylene oxid
PEO
Poly ethylene oxid
PEG
Poly (ethyleneglycol)
DMF
Dimethyl formamide
THF
Tetrahydrofurane
NPC
p-nitrophenyl chloroformate
EDC
1-3 Dimethylamino -5- ethyl carbodiimide
1
H-NMR
Proton Nuclear Magnetic Resonance
Da
Dalton
M

gia tạo liên kết ngang 17
Hình 1.8: Phản ứng tạo gel bằng enzyme horseradish peroxidase (HRP) 17
Hình 1.9: Tƣơng tác kỵ nƣớc 18
Hình 1.10: Tƣơng tác ion 19
Hình 1.11: Sự trƣơng nở của hydrogel 20
Hình 1.12: Các giai đoạn của quá trình lành xƣơng 25
Hình 1.13: Phản ứng oxi hóa cellulose: (a) oxi hóa alcohol bậc một; (b) oxi
hóa cắt diol 34
Hình 1.14: Phản ứng oxi hóa chitosan 35
Hình 1.15: Ảnh minh họa sự tƣơng tác giữa hydrogel trên cơ sở chitosan oxi
hóa với collagen trong mô 36
Hình 2.1: Các bƣớc tổng hợp TA-PEG-Gelatin 46
Hình 2.2: Các bƣớc tổng hợp Tyramin-Tetronic-Chitosan 50
Hình 2.3: Các bƣớc tổng hợp TA-PEG-Chitosan 49
Hình 2.4: Các bƣớc tổng hợp TA-PEG-Chitosan oxi hóa 55

xii
Hình 3.1: Giản đồ XRD của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,53 tại các pH: (a)
pH=7, (b) pH=9 và (c) pH=11 62
Hình 3.2: Phổ FTIR của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,53: (a) pH=7, (b)
pH=9 và (c) pH=11 65
Hình 3.3: Hình ảnh SEM của HAp tổng hợp bằng phƣơng pháp kết tủa kết
hợp sóng siêu âm với tỉ lệ mol ca/P=1,61 tại pH=9 66
Hình 3.4: Hình ảnh SEM của HAp tổng hợp theo phƣơng pháp kết tủa không
sử dụng sóng siêu âm với tỉ lệ mol Ca/P= 1,67 tại pH=8 (h-1) và
pH=9 (i-1) 67
Hình 3.5: Hình ảnh SEM của HAp và β-TCP tại các điều kiện phản ứng khác
nhau 67
Hình 3.6: Sơ đồ tổng hợp TA-Gelatin 68
Hình 3.7: Phổ


xiii
Hình 3.16: Sơ đồ tổng hợp TA-PEG-Gelatin 78
Hình 3.17: Phổ
1
H NMR TAPEGgelatin 78
Hình 3.18: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Gelatin và
hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP theo lƣợng H
2
O
2
/TA-
PEG-Gelatin tại lƣợng HRP/TA-PEG-Gelatin là 0,00025% và
nồng độ TA-PEG-Gelatin 10%

80
Hình 3.19: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Gelatin và
hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP theo lƣợng HRP/TA-
PEG-Gelatin tại lƣợng H
2
O
2
/TA-PEG-Gelatin là 0,0125% và
nồng độ TA-PEG-Gelatin 10% 81
Hình 3.20: Hình ảnh SEM của TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-
PEG-Gelatin/BCP với các lƣợng BCP khác nhau 82
Hình 3.21: Đồ thị % khối lƣợng suy giảm của hydrogel TA-PEG-Gelatin và
hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP theo thời gian 83
Hình 3.22: Đồ thị khảo sát độc tính tế bào của hydrogel TA-PEG-Gelatin và
hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP 84

Chitosan 5% 92
Hình 3.30: Hình ảnh SEM của hydrogel HPA-Chitosan và hydrogel composit
HPA-Chitosan/BCP với các lƣợng BCP khác nhau 93
Hình 3.31: Đồ thị thời gian suy giảm của hydrogel HPA-Chitosan và hydrogel
composit HPA-Chitosan/BCP 94
Hình 3.32: Sơ đồ tổng hợp Tetronic  NPC 95
Hình 3.33: Phổ
1
H NMR của TetronicNPC 95
Hình 3.34: Sơ đồ tổng hợp TA  Tetronic  NPC 96
Hình 3.35: Phổ
1
H NMR của TyraminTetronicNPC 97
Hình 3.36: Sơ đồ tổng hợp TA  Tetronic  Chitosan 98
Hình 3.37: Phổ
1
H NMR của TyramintetronicChitosan 98
Hình 3.38: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-Te-Chitosan và hydrogel
composit TA-Te-Chitosan/BCP theo lƣợng H
2
O
2
/TA-Te-Chitosan
tại lƣợng HRP/TA-Te-Chitosan là 0,0025% và nồng độ TA- Te-
Chitosan 10%

101
Hình 3.39: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-Te-Chitosan và hydrogel
composit TA-Te-Chitosan/BCP theo lƣợng HRP/TA-Te-Chitosan
tại lƣợng H

PEG-Chitosan tại lƣợng HRP/TA-PEG-Chitosan là 0,005% và
nồng độ TA-PEG-Chitosan 10%

111
Hình 3.49: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Chitosan và
hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP theo lƣợng HRP/TA-
PEG-Chitosan tại lƣợng H
2
O
2
/TA-PEG-Chitosan là 0,08% và
nồng độ TA-PEG-Chitosan 10% 112
Hình 3.50: Hình ảnh SEM của hydrogel TA-PEG-Chitosan và hydrogel
composit TA-PEG-Chitosan/BCP với các lƣợng BCP khác nhau . 113
Hình 3.51: Đồ thị % khối lƣợng suy giảm của hydrogel TA-PEG-Chitosan và
hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP theo thời gian 114
Hình 3.52: Đồ thị khảo sát độc tính tế bào của hydrogel TA-PEG-Chitosan và
hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP 115

xvi
Hình 3.53: Sự bám dính và phát triển của tế bào xƣơng MG-63 trên hydrogel
TA-PEG-Chitosan và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP
sau thời gian 5 ngày 116
Hình 3.54: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel TA-PEG-Chitosan sau 2 tuần
ngâm trong dung dịch SBF 117
Hình 3.55: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel composit TA-PEG-
Chitosan/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 118
Hình 3.56: Sơ đồ phản ứng oxi hóa chitosan 119
Hình 3.57: Sơ đồ tổng hợp PEG ghép chitosan oxi hóa 120
Hình 3.58: Phổ

Hình 3.64: Sự bám dính và phát triển của tế bào xƣơng MG-63 trên hydrogel
TA-PEG-Chitosan oxi hóa và hydrogel composit TA-PEG-
Chitosan oxi hóa/BCP sau thời gian 5 ngày 127
Hình 3.65: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa
sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 128
Hình 3.66: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel composit TA-PEG-Chitosan
oxi hóa/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 129

xviii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Danh mục hóa chất 42
Bảng 2.2 Các chất để pha 1000mL SBF có pH=7,4 61
Bảng 3.1: Tổng hợp các thông số và phần trăm khối lƣợng của β-TCP và HAp
theo tỉ lệ mol Ca/P 64
Bảng 3.2: Tính toán lƣợng tyramin có trong TA-Gelatin 69
Bảng 3.3: Tính toán lƣợng tyramin có trong TA-PEG-Gelatin 79
Bảng 3.4: Thành phần % khối lƣợng các nguyên tố trong phân tích EDS của
hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch
SBF 87
Bảng 3.5: Tính toán lƣợng HPA có trong HPA-Chitosan 90
Bảng 3.6: Tính toán lƣợng tyramin có trong TA-Te-Chitosan 99
Bảng 3.7: Thành phần % khối lƣợng các nguyên tố trong phân tích EDS của
hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch
SBF 107
Bảng 3.8: Tính toán lƣợng tyramin có trong TA-PEG-Chitosan 110
Bảng 3.9: Thành phần % khối lƣợng các nguyên tố trong phân tích EDS của
hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch
SBF 118
Bảng 3.10: Tính toán lƣợng tyramin có trong TA-PEG-Chitosan oxi hóa 121
Bảng 3.11: Thành phần % khối lƣợng các nguyên tố trong phân tích EDS của

nhằm giảm khối lƣợng suy giảm, hƣớng tới ứng dụng các vật liệu hydrogel
composit này trong cấy ghép và tái tạo xƣơng.

2
Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu tổng hợp vật liệu
mới trong cấy ghép và tái tạo xƣơng trên cơ sở hydrogel composit sinh
học gồm biphasic calcium phosphate và polymer sinh học (gelatin,
chitosan)”.
Mục tiêu của luận án:
Nghiên cứu tổng hợp vật liệu mới trên cơ sở hydrogel composit sinh
học gồm biphasic calcium phosphate và polymer sinh học (gelatin, chitosan)
nhằm mục đích tạo ra vật liệu có khả năng tƣơng hợp sinh học, kích thích sự
phát triển xƣơng, có thời gian suy giảm phù hợp với thời gian xƣơng phát
triển để có thể ứng dụng trong lĩnh vực cấy ghép và tái tạo xƣơng.
Nội dung nghiên cứu luận án bao gồm:
- Nghiên cứu tổng hợp nano BCP bằng phƣơng pháp kết tủa kết hợp
sóng siêu âm ứng dụng trong vật liệu sinh y.
- Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin
gelatin (TA-Gelatin) và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP.
- Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin
polyethyleneglycol gelatin (TA-PEG-Gelatin) và hydrogel composit TA-
PEG-Gelatin/BCP.
- Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel
hydroxyphenyl acetic chitosan (HPA-Chitosan) và hydrogel composit HPA-
Chitosan /BCP.
- Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin
tetronic chitosan (TA-TE-Chitosan) và hydrogel composit TA-TE-
Chitosan/BCP.
- Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin
polyethyleneglycol chitosan (TA-PEG-Chitosan) và hydrogel composit TA-


4
Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VẬT LIỆU DÙNG CẤY GHÉP VÀ TÁI TẠO
XƢƠNG
1.1.1. Thành phần, cấu tạo của xƣơng
Xƣơng của động vật có chức năng cơ học và chức năng cân bằng nội
môi (biological homeostasis). Xƣơng đảm nhận các vai trò trong việc tạo hình
cơ thể, tạo các khoang chứa cơ quan nội tạng, hỗ trợ quá trình vận động, là
nơi sản sinh các tế bào máu, lƣu trữ và cung cấp các ion khoáng.
Xƣơng là vật liệu dạng composit có thành phần bao gồm chất nền hữu
cơ (organic matrix), các khoáng chất, tế bào và nƣớc [1]. Sự tích hợp của các
khoáng chất trong chất nền hữu cơ làm cho xƣơng có tính chất cơ học cao do
kết hợp giữa các tính chất giòn của khoáng chất và tính đàn hồi của chất nền
hữu cơ [2].

Hình 1.1: Cấu tạo của xƣơng ( />skeleton-of-a-human-body-laboratory-exercise)
Xƣơng tƣơng đối cứng đƣợc tạo bởi hydroxyapatite Ca
5
(PO
4
)
3
OH.
Xƣơng có sức nén tƣơng đối cao nhƣng sức căng kém, khá giòn và có độ co
giãn phụ thuộc vào thành phần sinh học. Xƣơng có thành phần, cấu trúc mắt

5
lƣới và từng vùng khác nhau của xƣơng có độ đặc khác nhau. Cơ thể ngƣời có
206 xƣơng và đƣợc chia làm 3 phần: xƣơng đầu, xƣơng mình và xƣơng chi.