BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI











NGUYỄN THỊ THU PHƯƠNG

SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR ðÁNH GIÁ SỰ ðA
DẠNG DI TRUYỀN TẬP ðOÀN NẤM MỐC Aspergillus oryzae

LUẬN VĂN THẠC SĨ


SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR ðÁNH GIÁ SỰ ðA
DẠNG DI TRUYỀN TẬP ðOÀN NẤM MỐC Aspergillus oryzae
CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ : 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
TS. ðẶNG XUÂN NGHIÊM HÀ NỘI - 2013
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này
là trung thực và không trùng lặp với các ñề tài khác.
Tôi cũng xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều
ñược ghi rõ nguồn gốc.

Học viên

thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ks. Nguyễn Ngọc Hòa,
Ks. Nguyễn Ngọc Chỉnh, Ks. Nguyễn Khắc Hải, Ks. ðỗ Hải Quỳnh ñã nhiệt
tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn ñến Ban Giám hiệu, Ban chủ nhiệm khoa Công
nghệ Sinh học, Ban Quản lý ðào tạo sau ñại học, các Thầy Cô giáo Khoa
Công nghệ Sinh học Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, ñã tạo mọi ñiều
kiện và giúp ñỡ tôi trong suốt 2 năm học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc ñến gia ñình,
bạn bè, ñồng nghiệp ñã luôn ñộng viên và khuyến khích tôi trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 12 tháng 09 năm 2013
Học viên Nguyễn Thị Thu Phương Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

iii

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

iv

MỤC LỤC

Lời cam ñoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iv

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. Vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 22
2.1.1. Vật liệu 22
2.1.2. ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 25
2.2. Phương pháp nghiên cứu 26
2.2.1. Phân lập và nhận diện nấm A. oryzae dựa trên ñặc ñiểm hình thái 26
2.2.2. Phát hiện các trình tự SSRs bằng phầm mềm tin sinh học 26
2.2.3. Thiết kế mồi bằng tiện ích của Workbench 3.2 26
2.2.4. Tách chiết DNA tổng số 27
2.2.5. Phản ứng PCR kiểm tra sự ña hình ở các locus SSR 27
2.2.6. Phân tích kết quả 27
2.2.7. Khảo sát pH tối thích của các enzyme protease ngoại bào của các isolate
A. oryzae bằng phương pháp khuyếch tán ñĩa thạch. 28
2.2.8. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt ñộ của enzyme 28
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
3.1. Kết quả phân lập chủng nấm mốc A. oryzae 29
3.2. Hệ SSR của Aspergillus oryzae và mồi nhân dòng các locus SSR tiềm
năng 32
3.3. Kết quả lựa chọn và thiết kế mồi cho các ñoạn SSR tiềm năng 37
3.4. Khảo sát sự ña hình của 19 locus SSR 40
3.4.1. Khảo sát ñánh giá mức ñộ ña hình của các locus SSR 40
3.4.2. Khảo sát mức ñộ tương ñồng di truyền của các chủng Aspergillus oryzae 42
3.5. Khảo sát ảnh hưởng của pH và ñộ bền nhiệt của enzyme protease của
nấm mốc 44
3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính của protease 44
3.5.2. Khảo sát ñộ bền nhiệt của protease 47
KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 50
1. Kết luận 50
2. ðề nghị 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

vii

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

1.2 Cấu trúc bộ gene của Aspergillus oryzae (Machida và cs., 2005). 5
3.1 Hình thái tế bào và khuẩn lạc của một số chủng nấm mốc A. oryzae 32
3.2 Thành phần hệ SSR của A. oryzae theo score 37
3.3 Kết quả sản phẩm SSR của locus AoIV1.1 trên gel agarose 2,5% 41
3.4 Kết quả sản phẩm SSR của locus AoVIII 1.2 trên gel agarose 2,5% M:
thang chuẩn DNA 100Kb 41
3.5 Sơ ñồ hình cây về mức ñộ tương ñồng di truyền dựa trên 19 trình tự
SSR của 27 isolate A. oryzae. Thang trục hoành chỉ hệ số tương ñồng
(coefficient). 43
3.6 Hoạt tính của protease ở các pH khác nhau 47
3.7 Kết quả bền nhiệt của protease ngoại bào ở một số chủng A. oryzae ở các
mức nhiệt ñộ khác nhau: a: 30
0
C, b: 45

National Center for Biotechnology
Information
NST : Nhiễm sắc thể
NXB : Nhà xuất bản
PCR : Polymerase chain reaction
PDA : Potato dextrose agar
RNA : Ribonucleic acid
RFLP : Restriction fragment length polymorphism

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

1

TÓM TẮT

Aspergillus có khả năng sản xuất các enzyme ngoại bào hữu dụng, các acid hữu
cơ và các hợp chất trao ñổi thứ cấp có tầm quan trọng trong công nghệ sinh học. Trong
số hơn 15 loài Aspegillus có bộ gene ñã ñược nghiên cứu kỹ, hữu dụng nhất với ñời
sống con người là A. oryzae, loài này ñược sử dụng trong công nghệ lên men truyền
thống từ hàng ngàn năm nay. Ngày nay, A. oryzaeñược quan tâm nhiều trong lĩnh vực
sản xuất tương bởi khả năng phân giải protein và chất lượng sản phẩm cho giá trị dinh
dưỡng cao, an toàn. Tuy nhiên chưa có nhiều các nghiên cứu chỉ ra mối liên hệ giữa sự
khác biệt về kiểu locus SSR và hệ enzyme protease ngoại bào của chúng. ðể hiểu rõ
hơn tiềm năng sinh enzyme ngoại bào của nhóm nấm mốc này một cách có hệ thống
chúng tôi ñã tiến hành: “Sử dụng chỉ thị phân tử SSR ñánh giá sự ña dạng di truyền tập
ñoàn nấm mốc Aspergillus oryzae”.
Những công việc chính trong ñề tài bao gồm phân lập các chủng nấm mốc


2

MỞ ðẦU

1. ðặt vấn ñề
Aspergillus là một chi nấm mốc ưa khí cao gồm vài trăm loài khác nhau, trong
ñó có loài chỉ sinh sản vô tính bằng bào tử. Hình thái cuống bào tử ñính (conidiophore),
cấu trúc mang các bào tử ñơn tính, là ñặc ñiểm phân loại chính của nhóm sinh vật này.
Các loài Aspergillus phổ biến rộng rãi. Chúng là một trong những nhóm thành công
trong chiếm lĩnh các ổ sinh thái tự nhiên và có vai trò kinh tế quan trọng. Chúng
thường mọc trên các thực phẩm giàu tinh bột và trên/trong các thực vật.
Các nhà công nghệ sinh học quan tâm ñến các tiềm năng ứng dụng của
giống nấm mốc này như khả năng sản xuất các enzyme ngoại bào hữu dụng, các
acid hữu cơ và các hợp chất trao ñổi thứ cấp có tầm quan trọng trong công nghệ
sinh học. Trong số hơn 15 loài Aspegillus có bộ gene ñược nghiên cứu kỹ, hữu dụng
nhất với ñời sống con người là A. oryzae, loài này ñược sử dụng trong công nghiệp
sản xuất ñồ uống có cồn và nước chấm. Chúng ñã ñược sử dụng hơn một ngàn năm
trong ngành công nghiệp lên men truyền thống ở các nước châu Á như: Nhật Bản,
Trung Quốc, Hàn Quốc, Việt Nam…v.v. ñể sản xuất rượu gạo, nước sốt hoặc nước
chấm bởi A. oryzae có khả năng tiết ra nhiều enzyme ngoại bào (Kobayashi và cs.,
2007; Machida và cs., 2008) như amylase, protease, cellulase, A. oryzae, ñặc
biệt sử dụng lên men ñể sản xuất axit kojic, sử dụng trong mỹ phẩm làm trắng da
(Bennett, 2010). Hơn nữa, A. oryzaevà sản phẩm lên men của chúng ñược sử dụng
bổ sung probiotic trong chăn nuôi thú y (KyungWoo và cs., 2006). Ngày nay, trong
công nghệ lên men truyền thống A.oryzae ñược chú trọng trong sản xuất nước tương
bởi vai trò hàng ñầu của chủng này là khả năng phân giải protein của chúng. Sản
phẩm nước chấm ñược lên men theo phương pháp truyền thống ñảm bảo an toàn
sức khỏe, giá trị dinh dưỡng cao cho người sử dụng so với con ñường thủy phân
bằng acid. Trong công nghệ sinh học, A. oryzaecó khả năng biểu hiện lượng lớn các

của hệ enzyme protease ngoại bào của các chủng A. oryzae trong ñề tài.
2.2. Yêu cầu của ñề tài
Phân lập, mô tả và so sánh ñặc ñược ñiểm hình thái của các chủng nấm mốc
A. oryzae, nghiên cứu ñược kiểu gen một số locus SSR, chọn lọc tập hợp các locus
SSR ña hình, ñánh giá ñược mối quan hệ di truyền giữa các chủng A. oryzae.
Thu ñược dịch thô enzyme ngoại bào và ñánh giá ñược ñặc ñiểm protease
của các chủng nấm mốc A. oryzae phân lập ñược.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Nấm mốc A. oryzae
1.1.1. ðặc ñiểm của A. oryzae
A. oryzae thuộc chi Aspergillus, họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp
Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới nấm (Kitamoto, 2002).
A. oryzae có khả năng tiết ra môi trường các enzyme thủy phân như cellulose,
pectinase, xylanase, hemicellulase khi sống trên môi trường có nguồn cơ chất tương
ứng cellulose, pectin, xylan, hemicellulose. Chính nhờ khả năng này mà A. oryzae
ñã ñược ứng dụng rất rộng rãi trong công nghệ sản xuất nước chấm và ñồ uống có
cồn và trong công nghiệp sản xuất enzyme (MacKenzie và cs., 2000).
Cơ thể sinh dưỡng của A. oryzae là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh,
chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang, chia sợi thành nhiều tế
bào. Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi ñứng thẳng gọi là cuống
ñính bào tử, ở ñó có cơ quan sinh sản vô tính. Phía ñầu cuống ñính bào tử phồng lên
gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là
những tế bào hình chai (thể bình). ðầu các tế bào hình chai phân chia thành những
bào tử ñính vào nhau, nên gọi là ñính bào tử. ðính bào tử của A. oryzae có màu vàng lục

sớm nhất về loài nấm này là một nhà khoa học Nhật Bản tên là Jokichi Takamine.
Nghề làm tương và làm rượu Sake với loài nấm sợi này ñã có từ rất lâu ñời. Trước
ñây bào tử nấm này từ thiên nhiên rơi vào trong xôi hay gạo và mọc lên mốc làm
tương hay làm rượu. Bây giờ nấm sợi A. oryzae ñã ñược chọn lọc ñể có các chủng
có hoạt tính rất cao ñể làm giống cho sản suất gọi là koji. Koji ñược sản xuất ra
dưới dạng bánh thì gọi là mochi-koji, còn dưới dạng hạt thì gọi là bara-koji. Quá
trình sản xuất ra koji gọi là sei - koji. Nấm này còn ñược dùng ở Nhật Bản ñể sản
xuất tương từ ñậu tương, dạng ñặc gọi là miso, dạng loãng gọi là shoyu (nước
tương) (Nguyễn Lân Dũng, 2005).
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

6

Một ñiểm ñáng chú ý là loài nấm mốc A. oryzae thuộc nhóm flavi, nhóm này
còn bao gồm 3 loài khác là: A. sojae, A. nomius, A. parasiticus (Raper và Fernnell,
1965), trong ñó A. flavus và A. parasiticus là 2 loài có khả năng sinh ra aflatoxin là
một loại ñộc tố có thể gây ung thư. Loài A. oryzae chỉ khác biệt với loài A. flavus ở
một số ñặc ñiểm mà chỉ một số chuyên gia có thể phân biệt. Qua một quá trình sử
dụng lâu dài, các chủng A. oryzae thể hiện một số ñặc ñiểm khác với loài A. flavus
như: khả năng tạo bào tử giảm, có nhiều hệ sợi nấm khí sinh hơn, không sinh ra ñộc
tố aflatoxin (chức năng của aflatoxin có thể là ñể hạn chế sự tấn công của côn
trùng), các ñặc ñiểm trên có thể là do sự thích nghi với việc nuôi cấy trên môi
trường nhân tạo như quá trình sản xuất koji (Kurtzman và cs., 1986).
1.2. Protease nấm mốc
1.2.1. Một số yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp protease
 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng trực tiếp ñến sự sinh tổng hợp
enzyme của vi sinh vật. Môi trường dinh dưỡng chứa thành phần có tác dụng ñến
hoạt ñộng sống của vi sinh vật và sinh tổng hợp enzyme. Do ñó môi trường dinh
dưỡng phải có ñầy ñủ các chất ñảm bảo ñược sinh trưởng bình thường của vi sinh

3
, HNO
2
.
Nhiều loại nấm mốc khác nhau (A. oryzae, A. awamori, A. niger) trên môi
trường có nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp proteinase – acid cao. Trên môi trường
Czapek, NaNO
3
ñược thay bằng casein thì hoạt lực proteinase của nấm mốc ñược
tăng lên 3,5 lần, còn khi thay tinh bột bằng glucose và ñược bổ sung thêm pepton
thì hoạt lực enzyme tăng gấp 6 lần. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng
tổng hợp enzyme của nấm mốc ñược nâng cao khi trong môi trường có ñồng thời cả
nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ.
Ví dụ: khi thêm HNO
3
hoặc NH
4
với lượng 0,6 – 3,8% vào môi trường có
chứa nguồn nitơ hữu cơ làm tăng khoảng 140 – 190 % proteinase – acid trong môi
trường nuôi cấy của nhiều giống thuộc Aspergillus.
Thêm vào môi trường cám mì, bột ñậu tương ñã tách chất béo, các dạng nitơ
vô cơ hoạt lực enzyme protease tăng 22 – 74 % (Trịnh cương, 1963).
Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn
ñến ngừng sinh tổng hợp protein nói chung.
Tỷ lệ C : N thích hợp sẽ tổng hợp proteinase – acid ở A. oryzae là từ 8 : 1 ñến
2 : 1. Theo Aleeva và cs (1973), tăng lượng carbon quá nồng ñộ tối thích không ảnh
hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, nếu tăng lượng nitơ trong môi
trường quá nồng ñộ thích hợp sẽ kìm hãm sinh tổng hợp protease (Trịnh cương, 1963).
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp


ñộ (
0
C)
Thời gian
nuôi (giờ)
Hoạt ñộ
enzyme
(ñv/g canh
trường)
Tấm ngô 6,5
Trấu 25,5 55 30 36 15
Bột mỳ 5,0
Mầm thóc 4,0 55 30 42 485
A. oryzae
BK 72 - 59
(NH4)2SO4 1,0
70,0 Cám
55 32 38 26,1
A. oryzae BK 74
- 33
Trấu 30,0
Cám 70
Trấu 20 55 32 38 26,1
A. oryzae G.73
Khô ñỗ tương 10

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

9


phòng/1 giờ.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

10

Thời kỳ giữa kéo dài 14 – 16 giờ, nấm mốc phát triển nhanh, hô hấp mạnh.
Các chất dinh dưỡng trong môi trường tiêu hao nhanh ñể phục vụ cho các quá trình
trao ñổi chất trong tế bào, cần thông khí mạnh. Nhiệt ñộ buồng nuôi nên giữ 28 –
29
o
C. ðộ ẩm phòng cần 100 %.
- Thời kỳ thứ ba kéo dài 10 -20 giờ, các quá trình trao ñổi chất vẫn tiếp tục
nhưng yếu dần. Lượng nhiệt tỏa ra giảm và tạo thành enzyme của tế bào vẫn tiếp
tục, giữ nhiệt ñộ buồng nuôi ở 30
o
C.
Tùy thuộc vào từng ñặc tính sinh lý của từng giống nấm mốc, thời gian nuôi
cấy có thể kết thúc vào thời ñiểm mà lượng enzyme tạo thành tối ña (Lê Ngọc
Tú, 1997).
 ðộ ẩm của môi trường
Khi nuôi cấy nấm mốc bằng phương pháp bề mặt, ñộ ẩm của môi trường là
một trong những yếu tố rất cần thiết cho sự sinh sản của nấm mốc và có ảnh hưởng
ñến hoạt ñộ enzyme. ða số vi sinh vật phát triển tốt khi ñộ ẩm không khí lớn hơn 80
% và ñộ ẩm môi trường lớn hơn 20 %. ðộ ẩm là một trong những yếu tố làm cho vi
sinh vật tiếp nhận thức ăn dễ dàng. Nhờ ñộ ẩm, các chất dinh dưỡng dễ thâm nhập
vào cơ thể, các hệ enzyme thủy phân mới hoạt ñộng ñược. Nếu ñộ ẩm quá thấp sẽ
xảy ra hiện tượng thay ñổi trạng thái của nguyên sinh chất, làm rối loạn quá trình
sinh lý bình thường của vi sinh vật dẫn ñến vi sinh vật không phát triển ñược. ðộ
ẩm thích hợp ñể thu canh trường vi sinh vật có hoạt ñộ enzyme cao 53 - 70 % tùy

sinh tổng hợp cao nhất.
Theo khẳng ñịnh của nhiều nhà nghiên cứu thì tinh bột, isomaltose, maltise,
panose và các oligosaccharide có chứa liên kết α- 1,6 – glucoside ( Tonomurs và cs,
1961) là những chất cảm ứng tốt nhất ñể tổng hợp α- amylase từ nấm mốc
(A.oryzae). Pectin là chất cảm ứng sinh tổng hợp pectinase (A. oryzae, A niger)
hemicelluloses là chất cảm ứng tổng hợp hemicellulase, v.v. (xạ khuẩn
Streptomyces fradiae) (Lương ðức Phẩm, 1983).
1.2.2. Ứng dụng của protease nấm mốc
Trong phương pháp sản xuất thực phẩm lên men, cơ sở khoa học của nó là
lợi dụng hệ enzyme của vi sinh vật phát triển trên nguyên liệu giàu ñạm nuôi chúng
ñể phân hủy protein có trong nguyên liệu thành phẩm. Nấm mốc ñược ứng dụng
rộng rãi trong quá trình sản xuất các thực phẩm lên men truyền thống như nước
chấm, tương, ñạm tương, chao, Miso, Tempeh, phomai.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

12

Nhiều chủng nấm mốc thuộc nhóm Aspergillus có khả năng tổng hợp ñồng
thời amylase, protease và một số enzyme khác như enzyme oxy hóa khử ñược sử
dụng nhiều trong công nghiệp chế biến các thực phẩm lên men ñể thủy phân tinh
bột thành ñường, thủy phân protein thành acidamin và peptide.
Những thành viên của nhóm A. flavus – oryzae, ñặc biệt là A. oryzae có tầm
quan trọng về mặt công nghiệp rất lớn. Ở Nhật A. oryzae ñược dùng ñể ñường hóa
tinh bột trong quá trình sản xuất rượu sake và các loại rượu khác, trong quá trình
sản xuất rượu shoyu, miso, A. oryzae cũng ñược dùng trong việc sản xuất hỗn hợp
enzyme xuất hiện trên thị trường dưới những tên thương mại như Takadi astase,
Polyzyme, digestin, oryzyme (Samuel Cate Prescott và cs., 1959).
Những chủng A.niger ñược dùng trong ngành công nghiệp lên men acid
citric và lên men acid gluconic.

Simple sequence repeats (SSRs), còn ñược gọi là các chuỗi lặp ñơn giản hay
các chuỗi lặp liền kề ngắn = short/simple tandem repeats (STRs) hay các ñoạn ña
hình chuỗi ñơn giản = simple sequence length polymorphisms (SSLPs) là nhóm các
chuỗi DNA ñơn giản lặp lại ngắn từ 2-6 bp và kích thước tại mỗi locus là 20–100
bp. SSRs ñược tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, ñặc biệt là ở những cơ thể sống có
bộ gen lớn và phân bố ñều trên genome.
SSRs có tính ña hình rất cao (ña hình theo chiều dài), là những alen ñồng trội
(codominant-allelen) bao gồm 2 loại: alen ñồng hợp và alen dị hợp, nó có các tính
chất cần thiết cho một marker. Tần số ñột biến từ 10
-4
- 5.10
-6
, nó tuân theo ñịnh
luật Mendel. Vị trí của SSRs trên nhiễm sắc thể có thể ñược xác ñịnh bằng PCR từ
một lượng DNA rất nhỏ. Xác ñịnh SSRs - PCR trên một loài nào ñó thì có thể áp
dụng trên những loài khác có quan hệ họ hàng (Hà Viết Cường, 2009; Nguyễn Thị
Phương Dung, 2005).
Các chuỗi lặp thường ñơn giản, bao gồm 2, 3, 4 nucleotide (gọi là di-, tri-, and
tetranucleotide repeats). Một ví dụ phổ biến của microsatellite là 1 dãy chuỗi lặp 2
dinucleotide (CA)n, trong ñó n là tổng số chuỗi lặp nằm trong phạm vi từ 10 – 100.
Ví dụ: SSRs lặp 1 nucleotide (A)11: AAAAAAAAAAA;
SSRs lặp 2 nucleotide (GT)6: GTGTGTGTGTGT;
SSRs lặp 3 nucleotide (CTG)4: CTGCTGCTGCTG; v.v.
1.3.2. Phân loại SSRs
Căn cứ vào số lượng nucleotide cấu tạo lên mỗi ñơn vị lặp, SSR ñược phân
loại thành 6 nhóm. Trong ñó, dạng lặp 3 xuất hiện ít hơn dạng lặp 2 khoảng 10 lần,
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp

14



15

cực kỳ hữu hiệu trong việc phân biệt các cá thể của 1 quần thể => ñược ưa thích
trong nghiên cứu di truyền quần thể và tội phạm (Hà Viết Cường, 2009).
1.3.4. Cơ chế tạo ñột biến của SSRs
Tốc ñộ ñột biến của SSRs cao hơn nhiều so với các vùng khác của bộ gen, nằm
trong phạm vi từ 10
-2
ñến

10
-6
/locus/thế hệ. Một số các cơ chế gây ra tốc ñộ ñột
biến cao của microsatellite là: lỗi trong quá trình tái tổ hợp, trao ñổi chéo không
ngang bằng, trượt (slippage) của DNA polymerase trong quá trình tái sinh và sửa
chữa DNA.
Lỗi trong quá trình tái tổ hợp: ñây không phải là cơ chế chủ yếu vì người ta
ñã phát hiện tốc ñộ ñột biến SSRs tương ñương nhau ở chủng vi khuẩn E. Coli có
hệ thống tái tổ hợp và chủng không có hệ thống tái tổ hợp.
Trao ñổi chéo không cân: ñây là một cơ chế quan trọng, tạo ra các ñột biến
mất ñoạn và thêm ñoạn lớn. Lý do là trong quá trình tiếp hợp, trên vùng
microsatellite của một nhiễm sắc thể hình thành 1 cấu trúc kẹp tóc (hairpin). Hậu
quả là sau khi trao ñổi chéo, một nhiễm sắc thể sẽ có một satellite dài hơn còn
nhiễm sắc thể kia sẽ có SSRs ngắn hơn.
Trượt (slippage) của DNA polymerase trong quá trình tái sinh và sửa chữa
DNA: ðây cũng là một cơ chế quan trọng. Trong quá trình tái sinh và sửa chữa
DNA, một sợi tạm thời tách khỏi sợi kia và nhanh chóng tái hợp nhưng ở một vị trí
khác dẫn tới lỗi ghép cặp bazơ. Hậu quả là 1 allele sẽ tăng số chuỗi lặp nếu lỗi xuất
hiện ở sợi thứ (sợi tương ñồng) hoặc giảm số chuỗi lặp nếu lỗi xuất hiện ở sợi chủ.