BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
LÊ THỊ THANH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHÁT HIỆN
NGUỒN QTLs/GEN CHỊU HẠN TRONG TẬP ðOÀN
CÁC GIỐNG LÚA
LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.80 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHAN HỮU TÔN
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành ñến PGS.TS. Phan Hữu
Tôn, Bộ môn Công nghệ sinh học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình
giúp ñỡ, hướng dẫn tôi trong việc ñịnh hướng ñề tài cũng như trong suốt quá trình
thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám ñốc và tập thể cán bộ công nhân
viên trong Bộ môn Công nghệ sinh học, các thành viên trong nhóm lúa hạn
thuộc bộ môn Chọn giống lúa cho vùng khó khăn, trung tâm nghiên cứu và phát
triển lúa thuần, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Liên Hồng, Gia Lộc,
Hải Dương ñã giúp ñỡ, tạo moi ñiều kiện về vật chất và thời gian ñể tôi hoàn
I MỞ ðẦU 1
1.1 ðặt vấn ñề 1
1.2 Mục ñích 2
1.3 Yêu cầu 2
1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 2
1.4.1 Ý nghĩa khoa học của ñề tài 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn của ñề tài 2
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 ðại cương về cây lúa 3
2.2 Tính chịu hạn 4
2.2.1 Tác hại của hạn 4
2.2.2 Cơ chế chịu hạn 5
2.3 Một số phương pháp chọn tạo giống thực vật ñược sử dụng 21
2.3.1 Chọn giống theo phương pháp truyền thống 21
2.3.2 Chọn giống bằng Công nghệ sinh học 22
2.3.3 Những phương pháp tiến hành MAS 32
2.3.4 Những thành tựu và triển vọng MAS 34
2.4 Những kết luận rút ra từ nghiên cứu tổng quan 44
3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45
3.1 Vật liệu nghiên cứu 45
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii
3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 45
3.1.2 ðịa ñiểm nghiên cứu 45
3.1.3 Thời gian nghiên cứu 45
3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 45
3.2.1 Nội dung nghiên cứu 45
83
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii
4.6.1 Kiểm tra ñộ nguyên vẹn và tinh sạch DNA của các dòng, giống lúa
nghiên cứu
83
4.6.2 Tính chịu hạn của các dòng, giống ñược phát hiện với các chỉ thị
RM250, RM270, RM221 và RM167
84
5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 88
5.1 Kết luận 88
5.2 ðề nghị 88
TÀI LIỆU THAM KHẢO 90
PHỤ LỤC 98
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
4.6 Chiều cao cây cuối cùng và khả năng ñẻ nhánh của các dòng, giống
lúa ở hai ñiều kiện môi trường
68
4.7 ðặc ñiểm lá ñòng của các dòng, giống lúa thí nghiệm ở hai ñiều kiện
môi trường
71
4.8 Chiều dài bông, chiều dài cổ bông và khối lượng 1000 hạt ở hai ñiều
kiện môi trường 74
4.9 Thời gian sinh trưởng của các dòng, giống lúa tham gia thí nghiệm ở
cả hai môi trường
76
4.10 Khả năng chống chịu sâu bệnh hại chính và ñiều kiện bất thuận của
các dòng, giống lúa tại Gia Lộc, Hải Dương, vụ mùa 2012 78
4.11 Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng, giống lúa
thí nghiệm ở hai ñiều kiện môi trường tại Gia Lộc, Hải Dương, vụ
mùa 2012
82
4.12 ðộ tinh sạch DNA chiết tách 83
4.13 Bảng Score kiểu hình và kiểu gen về tính chịu hạn của 21 giống
nghiên cứu
86
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi
DANH MỤC HÌNH
STT Tên hình Trang
tạo các giống lúa chịu hạn có khả năng sử dụng nước hiệu quả, sinh trưởng tốt trong
ñiều kiện khắc nghiệt và cho năng suất ổn ñịnh là vấn ñề cần thiết Mặt khác, tạo ra
những giống lúa mang gen chịu hạn cũng là việc làm cần thiết cho cả những vùng
trồng lúa có ñủ ñiều kiện thủy lợi bởi vì tình trạng thiếu nước có thể xảy ra ở hầu
hết các vùng trồng lúa, theo thống kê có tới 90% diện tích trồng lúa trên thế giới
chịu ảnh hưởng của khô hạn trong vài giai ñoạn sinh trưởng.
Cùng với việc phát triển của công nghệ sinh học, chọn giống nhờ chỉ thị
phân tử (MAS- Marker Assisted Selection) là phương pháp chọn giống ñang ñược
áp dụng nhiều và là một hướng nghiên cứu ñầy triển vọng hiện nay. Trong chọn lọc
nhờ chỉ thị phân tử, các gen ñích ñược phát hiện dựa vào chỉ thị chứ không phải dựa
vào sự biểu hiện kiểu hình của gen ñó. Do ñó, việc chọn lọc dựa vào các chỉ thị liên
kết chặt chẽ với nhóm gen sẽ giúp cho nhà chọn giống thu ñược những kết quả
chính xác về dự ñoán tiềm năng sản lượng cũng như sức sống của thế hệ con cháu.
Những thành công trong việc xác ñịnh các QTL liên quan ñến tính chịu hạn là bước
ñầu quan trọng cho việc ứng dụng chỉ thị phân tử vào chọn giống cây trồng chịu hạn.
[49][68]
Nhờ những nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật bản ñồ gen, nhiều nhà khoa học ñã
xác ñịnh ñược vị trí và vai trò của một số vùng gen liên quan ñến khả năng chịu hạn.
Các ñặc tính như bộ rễ khoẻ, ăn sâu, khả năng ñiều chỉnh áp suất thẩm thấu, khả
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 2
năng duy trì thế nước ở lá trong ñiều kiện khô hạn… ñều quyết ñịnh ñến khả năng
chịu hạn của cây trồng.
Do ñó ñể tạo nguồn vật liệu ban ñầu cho chương trình chọn tạo giống lúa
chịu hạn chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân
tử phát hiện nguồn QTLs/gen chịu hạn trong tập ñoàn các giống lúa.”
1.2 Mục ñích
2.1. ðại cương về cây lúa
Chi lúa Oryza thuộc họ Graminae, họ phụ Oryzoideae và tộc Oryzae. Chi
Oryza gồm có 28 loài và loài phụ, phân bố chủ yếu ở vùng xích ñạo. Nó bao gồm cả
hai loại hình: lâu năm và hàng năm, cao từ 0,3 ñến 2,0 m. Trên cơ sở phân tích sự
tiến hóa của loài về hình dạng cây lúa, có thể chia thành ba nhóm loài khác nhau:
Padia (nguyên thủy): Cây có thân rạ nhỏ, mọc ở ñất dễ thoát nước trong các rừng
ẩm nhiệt ñới ðông Nam Á, thích nghi trong bóng mát; Angustifolia (hơi tiến hóa):
Cây có kích thước nhỏ, thích nghi với ñất ngập nước, phát triển ở vùng nhiệt ñới
Châu Phi và Euoryza (tiến hóa): Cây có thân rạ trung bình hoặc to, ưa sáng và thích
nghi với ñiều kiện ngập nước. [6].
Hiện nay, trên thế giới có hai loài lúa trồng chủ yếu. Loài lúa trồng Oryza
Sativa ñược thuần hóa ở Châu Á, nên ñược gọi là lúa trồng Châu Á. Loài lúa trồng
Oryza Glaberrima ñược thuần hóa ở Châu Phi, nên ñược gọi là lúa trồng Châu Phi.
Chúng có ñặc tính chung là có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội (2n = 24), thủy sinh, ưa
sáng.[2] Tuy nhiên, hai loài lúa trồng này có những ñặc ñiểm khác nhau về hình thái.
Lúa trồng Châu phi có mặt lá và vỏ trấu không ráp, không có lông tơ, lá láng trơn,
thìa lìa lá rất ngắn, hình ñỉnh tròn hoặc tháp cụt. Trong khi ñó lúa trồng Châu Á có
mặt lá và vỏ trấu ráp, có lông tơ. Lá còn có lông tơ cứng, ở hai rìa hai bên. Thìa lìa
của lá dài, ngọn thìa lìa chẻ ñôi và hai ñầu chẻ ñều nhọn.
Loài lúa trồng Châu Á O.Sativa là cây thân thảo sinh sống hàng năm, có thời
gian sinh trưởng thay ñổi tùy theo giống lúa, vụ trồng, nơi trồng, các ñiều kiện sinh
thái, từ 75 ñến 120 ngày. Cây mọc thẳng ñứng hay mọc nghiêng rồi bò dài (lúa nổi),
sống ở cạn, ñất cao hay nước ngập chân hoặc một phần thân hay trong nước sâu tới
2 - 4m. Thân cao 70-150 cm, một số giống lúa nổi có thân cao 2 - 3 m, hay 5 - 6 m
(lúa nổi ở Bawngladesd). ðốt thân nhẵn và cách nhau bởi những lóng dài, ngắn
khác nhau. Phiến lá thẳng ñều, ñầu lá nhọn, bề mặt phiến lá và mép lá ñều ráp. Hoa
lúa là hoa lưỡng tính, cây lúa trồng là cây tự thụ phấn. Hoa có 6 nhị ñực, mảnh, bao
phấn dài. Bầu hoa có vòm, nhị ngắn và hai ñầu nhị có lông tơ. Loài O.Sativa L.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
mầm, quá trình thụ tinh không xảy ra và hạt bị lép. Nếu hạn muộn hơn vào giai
ñoạn cuối làm ảnh hưởng ñến sự tạo và vận chuyển dinh dưỡng về hạt cũng gây nên
hiện tượng hạt bị lép, ảnh hưởng ñến năng suất và sản lượng.
Có thể nói trong các loại cây trồng thì cây lúa là loại cây kém chịu hạn nhất,
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 5
ñặc biệt là vào các giai ñoạn phân hóa ñòng, ôm ñòng, trỗ và phơi màu. Nhiều
nghiên cứu cho thấy, khi tỷ lệ nước trong ñất chỉ bằng 50% lượng nước tối ña vào
giai ñoạn ñẻ nhánh thì có thể làm giảm 1/5 năng suất, vào giai ñoạn phân hóa ñòng
và trỗ có thể làm giảm 1/3 năng suất và vào giai ñoạn cây lúa phơi màu có thể làm
giảm 2/3 năng suất, thậm chí làm mất mùa hoàn toàn. Như vậy hạn hán làm ảnh
hưởng mạnh mẽ lên sự sinh trưởng của cây lúa, là nguyên nhân chính gây nên sự
mất tính ổng ñịnh năng suất.
Theo thống kê sơ bộ của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, hiện nay
trên thế giới có khoảng 45% diện tích ñất trồng bị hạn hán. Tại Việt Nam, trong 7,3
- 7,5 triệu ha ñất trồng thì có tới 1,5 - 1,8 triệu ha thiếu nước, năm 1988 - 1990 sản
lượng lúa của vùng ñồng bằng sông Hồng bị giảm 20 - 28% so với mức trung bình
chủ yếu do hạn hán. Ngoài diện tích này ra, hạn hán do thời tiết xảy ra hàng năm
cũng làm giảm ñáng kể năng suất lúa. ðiển hình cho hạn hán cho hạn hán ở nước ta
phải kể ñến hai năm 1993 và 1998. Trong năm 1993, hạn gay gắt xảy ra ở Trung Bộ
và Nam Bộ làm giảm năng suất xuống còn 1/2. Hạn hán xảy ra vào giai ñoạn lúa ôm
ñòng trong hai năm 1998 và 1999 làm giảm 4/5 năng suất lúa ở các tỉnh khu Bốn
[26]. Năm 2002 diện tích gieo trồng lúa hàng năm ở nước ta biến thiên từ 7,3 – 7,5
triệu ha trong ñó 1,5 -1,8 ñang bị thiếu nước và 1,5 – 2,0 triệu ha cần phải ñầu tư ñể
chống úng khi gặp mưa to và mưa tập trung. Năm 2004, hạn hán ñã làm 167 000 ha
ñất canh tác của các tỉnh khu vực Nam Trung Bộ và Tây Nguyên bị thiếu nước,
trong ñó khoảng 100.000 ha lúa, hoa màu và cây công nghiệp bị mất trắng, thiệt hại
mô trong ñiều kiện thiếu nước.
Cơ chế tránh hạn là một hình thức cải thiện sự thu hút nước, dự trữ nước
trong tế bào thực vật và làm giảm lượng nước mất ñi, kết quả là ñưa ñến việc tránh
ñược hạn. Cơ chế này thể hiện ở việc duy trì sức trương thông qua việc làm tăng
lượng rễ sâu, hệ thống rễ tốt, tăng sự dẫn nước và giảm sự mất nước qua biểu bì
(ñóng khí khổng), giảm hấp thụ bức xạ bằng cách nghiêng hoặc tạo cuốn ở lá, làm
giảm bay hơi nước trên bề mặt. Sự tăng cường cung cấp nước nhờ bộ rễ ăn sâu, rễ
to khỏe, số lượng nhiều và mạch dẫn có kích thước lớn. Thực vật sống sót sau hạn
bởi việc cân bằng giữa việc duy trì sức trương và giảm sự mất nước.
Rễ sâu là ñặc ñiểm mấu chốt cho việc cải thiện khả năng chịu hạn ở lúa trong
môi trường khô hạn vì chúng góp phần thu hút nước từ những tầng ñất sâu trong
suốt quá trình hạn. ðể duy trì lượng nước hút lên cần có hệ thống rễ phát triển sâu
hơn khi mật ñộ rễ thấp chiếm ưu thế hoặc nhờ tăng mật ñỗ rễ. Trong số những ảnh
hưởng của môi trường, ảnh hưởng của chế ñộ nước lên sự phát triển rễ sâu của lúa
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 7
sinh trưởng trong ống ñất ñã ñược hiểu rất rõ. ðặc ñiểm của các loài chịu hạn là
chúng có tỷ lệ rễ trên tổng sinh khối của thân lớn và có rễ phát triển sâu. Nhiều kết
quả nghiên cứu ñã khẳng ñịnh cây có bộ rễ phát triển là khả năng ñặc biệt ñể chống
lại sự mất nước. Trong ñó, số lượng rễ, ñộ sâu, ñộ dài… là những ñặc ñiểm quan
trọng trong sự duy trì thế nước của lá trong ñiều kiện khó khăn về. Hình thái rễ và
kiểu rễ ảnh hưởng trực tiếp ñến lượng nước cung cấp cho cây. ðối với các loại ngũ
cốc như lúa, lúa miến và ngô thì tăng ñộ rộng, ñộ sâu và sự phân nhánh của hệ rễ ñã
làm giảm sự tác ñộng của sự thiếu nước lên cây. Sự phát triển rễ sâu ảnh hưởng rất
lớn bởi ñiều kiện ñất. Sự khác nhau về kiểu gen cũng ñược quan sát không những
cho sự phát triển hệ thống rễ dưới ñiều kiện ñủ nước (ñặc ñiểm rễ cơ bản) mà còn
cho sự sinh trưởng của rễ chịu trách nhiệm trong các chế ñộ nước khác nhau (ñặc
Cơ chế chịu hạn là phản ứng của cây ñối với sự thiếu nước trong mô thông
qua việc duy trì sức trương bằng ñiều chỉnh áp suất thẩm thấu (bằng việc tạo ra các
chất tan trong tế bào), tăng ñộ mềm dẻo và giảm kích thước tế bào.
Qua ñiều chỉnh áp suất thẩm thấu cây trồng có thể duy trì áp suất trương
(một quá trình làm tăng sự tích lũy chất tan trong tế bào). Trong ñó, duy trì sức
trương khi thế nước của cây giảm là quan trọng ñối với tế bào sống, ñối với sự sinh
trưởng và nhiều quá trình sinh lý, sinh hóa liên quan. Tốc ñộ thoát hơi nước là yếu
tố quan trọng ñối với sự tích lũy chất tan và duy trì áp suất trương ở thế nước trong
lá trung bình. Song nhiều nghiên cứu về sự phản ứng của cây trồng ñã ñánh giá thấp
khả năng suy trì sức căng qua việc tích lũy chất tan vì tốc ñộ tác ñộng của sự thiếu
hụt nước lớn hơn nhiều quá trình tích lũy chất tan có thể ñiều tiết. Tuy nhiên, vấn ñề
ñặt ra ñối với quá trình tích lũy chất tan là vai trò thực sự của ñọ dài thời gian khôi
phục lại cũng như sự khắc nghiệt cảu sự thiếu nước. Phản ứng của cây ñối với sự
thiếu nước trong mô quyết ñịnh mức ñộ kháng hạn của nó.
Tính mềm dẻo của mô ở cây kháng hạn có ñược là khi thế nước và lượng
nước trong mô giảm có khả năng làm tăng tính co giãn của tế bào và làm giảm kích
thước tế bào, tăng ñộ nhớt của chất nguyên sinh tế bào làm cho nguyên sinh chất
chịu ñược sự mất nước cao.
d/ Các chất ñiều chỉnh áp suất thẩm thấu
Có thể nói, những nghiên cứu về việc ñiều chỉnh áp suất thẩm thấu ở lúa
còn nhiều hạn chế. Nhiều tác giả nhận thấy rằng ñiều chỉnh áp suất thẩm thấu ở
lúa diễn ra ở mức trung bình so với những loài ngũ cốc khác như lúa miến, lúa
mỳ, lúa mạch. ðiều chỉnh thẩm thấu có ảnh hưởng lên sự cuộn lá lúa, có thể làm
chậm lại sự cuộn lá và sự chết của lá. Những giống có khả năng ñiều chỉnh áp
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 9
suất thẩm thấu cao có thể duy trì sự trương khi thế nước trong lá thấp. Quá trình
10
của tế bào trong phản ứng với sự thiếu nước. Sự phosphoryl hóa các protein màng
ñã làm tăng khả năng vận chuyển nước của kênh dẫn truyền, do ñó làm giảm mức
ñộ phosphoryl hóa khi thiếu nước sẽ làm chậm sự mất nước từ tế bào.
Khả năng chịu mất nước dựa trên sự thay ñổi tinh vi trong sinh hóa tế bào
dẫn ñến sự xuất hiện và tích lũy các chất hòa tan, protein, amino acid ñặc hiệu. Hiện
tượng này thường diễn ra rất nhanh khi bị mất nước. Sự tích lũy các chất này không
làm ảnh hưởng ñến chức năng các hệ enzyme trong tế bào. Các chất ñó bao gồm
một số nhóm sau: ion K
+
, protein (LEA, Osmotine), amino acid (Proline, Estoine),
các chất ñường (sucrose fructant, manitol, pinitol), các enzyme phân hủy gốc tự do.
Ngoài ra còn có các chất như: glucine betaine và β-alaninen betaine. Các chất này
thường có hai chức năng, lượng chứa của chúng trong tế bào sẽ ñiều chỉnh áp suất
thẩm thấu bằng tác ñộng tổng thể mà chúng có khả năng giữ và lấy nước vào tế bào
hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na
+
. Ngoài ra chúng có thể thay thế vị trí nước
nơi xảy ra các phản ứng sinh hóa, tương tác với lipid hoặc protein trong màng, ngăn
chặn sự phá hủy của màng và các phức protein. Các chất tan thích hợp cũng có thể
thay thế trong liên kết với lipid hoặc protein, do ñó chống lại sự phân hủy màng, sự
phân ly của phức hợp protein hoặc sự bất hoạt của enzyme. Nhiều chất tan trong
ñiều chỉnh thẩm thấu của tế bào trong ñiều kiện bất lợi cũng có tác dụng trong quá
trình phục hồi của cây. Sucrose tăng lên một lượng lớn trong tế bào khi gặp yếu tố
cực ñoan. Chúng tương tác với màng tế bào, hình thành cầu nối hydroxyl của
sucrose với nhóm phospholipid. Bằng cách này chúng thay thế vị trí nước trong
màng tế bào. Sự có mặt của chúng trong nguyên sinh chất còn có khả năng bảo vệ
mối liên quan với khả năng chịu stress thiếu nước [45].
Một số kết quả cho thấy có mối liên quan giữa sự biểu hiện của gen LEA
ñóng vai trò quan trọng không chỉ trong sự chịu khô hạn của hạt mà còn trong
các mô tăng trưởng khi cây chịu stress thiếu nước hay mặn. Một clone cDNA có
ñộ dài phân tử ñầy ñủ chứa gen OsLEA3-1 ñã thể hiện tính chống chịu khô hạn
trong ñiều kiện ñồng ruộng, nhờ promoter kiến trúc CaMV35S. ðặc ñiểm chung
của các protein này là chúng có các chuỗi peptid thích nước cao nên một số
LEA protein thích hợp với vai trò mang nước, những protein này có thể giúp duy
trì nhu cầu nước trong tế bào. Trong quá trình loại nước, sự mất nước dẫn ñến sự
tinh thể hóa các thành phần của tế bào, kết quả là phá hủy cấu trúc tế bào, ñiều
này có thể làm mất tác dụng nhờ LEA protein. Một số LEA protein có thể ñược
xem như các chất tan thích hợp ñóng vai trò như các ñường duy trì cấu trúc của
không bào khi thiếu nước.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 12
Nhóm gen RAB (responsive to absicis acid): Liên quan ñến tác ñộng ức
chế sinh trưởng tế bào của ABA khi thực vật gặp ñiều kiện bất lợi. Các gen RAB
phản ứng với ABA ngoại sinh và nội sinh cho ra những protein có chức năng ức
chế và bảo vệ. Các kết quả phân tích sự biểu hiện của gen trong quá trình phát
sinh phôi và nảy mầm ở lúa và bông ñã cho thấy việc tiền xử lý ABA ñã cảm
ứng quá trình thể hiện của gen RAB. Biểu hiện chức năng của ABA tạo ra bởi
khả năng kháng hạn ñã ñược phân tích chính xác ở mức ñộ phân tử [67]. Các gen
biểu hiện trong ñiều kiện thời tiết bất thuận xác ñịnh bằng kỹ thuật Microarray,
ñược kiểm tra lại bằng kỹ thuật phân tích ARN gel-blot cho thấy 100% gen biểu
hiện trong ñiều kiện ABA ñược phát hiện cũng biểu hiện trong ñiều kiện hạn.
Các kết quả này càng làm tăng ñộ tin cậy rằng có ñộ tương ñồng cao về cơ chế
chống chịu hạn, mặn và ABA ở thực vật.
thực vật bắt ñầu ñược chú ý. Làm thế nào ñể thu nhận ñược nhiều hơn sức chống
chịu với stress (hạn, mặn ) của cây bằng sự biểu hiện của ALDH. ALDH ñược thu
nhận bằng hai con ñường: thu nhận khi sự tích lũy tăng lên của sự thẩm thấu hoặc là
thu từ aldehyde giải ñộc. Gen BADH (betaine aldehyde dehydrogenase) cũng ñóng
vai trò quan trọng trong sự chống chịu của thực vật với hạn và muối. Một gen mới
trong nhóm này là JcBD1 ñã ñược biểu hiện ở E.Coli và sau khi ñánh giá cho thấy
khả năng chịu stress muối cao hơn ñối chứng [69]. Gen BADH cũng ñã ñược
chuyển vào ngô. Ngoài ra còn có rất nhiều công bố về một số gen ñiều khiển và
hoạt hóa sự biểu hiện của rất nhiều gen liên quan ñến tính chịu hạn ở thực vật. Gen
NAC khi ñược chuyển vào cây không chỉ biểu hiện tính chống chịu lại cùng lúc với
nhiều ñiều kiện bất lợi (hạn, mặn, lạnh) mà còn ảnh hưởng tích cực ñến sự phát
triển và năng suất cây trồng. Gen TERF1 ñiều khiển tổng hợp ethylene responvive
factor (ERF) protein ñã ñược chuyển vào lúa cho thấy biểu hiện chịu hạn của cây và
sống sót trong môi trường muối cao. Ngoài ra gen TERF1 cũng ñã ñược phân lập và
chuyển gen giúp cây thuốc lá tăng cường khả năng chống chịu trong ñiều kiện hạn
và ABA. Cây táo chuyển gen Osmyb4 ñã cải thiện khả năng ñáp ứng thích nghi với
stress hạn và lạnh [60]. Một số gen khác ñã ñược phân lập và biểu hiện có mối quan
hệ với tính chịu hạn là trehalose 6-phosphate-synthase ñược phân lập từ cây bông,
gen CaAMP1 từ cây tiêu, gen TaAIDFFa từ lúa mỳ, gen codA (Choline oxidase) từ
cây khoai tây, gen SpFBA từ cây S.Portulacastrum.
b/ Các gen tổng hợp proline và protein sốc nhiệt
Có khá nhiều nghiên cứu tập trung tìm hiểu cơ chế của tính chịu hạn,
trong ñó không ít nghiên cứu ñề cập ñến vai trò của proline ñối với khả năng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 14
chịu hạn của thực vật nói chung và cây trồng nói riêng. Trong các chất tan,
proline ñược xem là ñóng vai trò chính ñiều chỉnh thẩm thấu ở các cây chịu khô
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 15
bào chất và làm tăng khả năng tương tác phân tử mà có thể là nguyên nhân biến
tính protein và hợp nhất màng.
Các HSP có trọng lượng phân tử lớn như HSP70, HSP90, HSP101 ñã ñược
mô tả có trình tự tương ñồng cao trong giới thực vật. Nhiều gen kiểm soát bởi HSP
ñã ñược ñánh giá liên quan ñến khả năng chịu hạn của cây trồng, ñược sử dụng cho
chuyển gen như: sHSP17.7, gen OsWRKY11 do promoter HSP101 kiểm soát.
c/ Các tính trạng số lượng (QTL) chịu hạn.
Tính chịu hạn của cây trồng ñược hình thành trong quá trình tiến hóa tự
nhiên dưới tác ñộng của ñiều kiện ngoại cảnh trong ñó có hạn hán. Nghiên cứu tính
chịu hạn về mặt sinh lý, sinh hóa, cấu trúc tế bào người ta nhận thấy một loạt những
biến ñổi sâu sắc ở tất cả các mức ñộ khác nhau trong các giai ñoạn phát triển khác
nhau. ðiều ñó chứng tỏ tính chống chịu là một hệ ña gen, do rất nhiều gen quyết
ñịnh, biểu hiện trong các giai ñoạn phát triển khác nhau của cây. Phân tích biểu hiện
với một khối lượng lớn cho thấy có một số lượng lớn gen khác nhau ở thực vật chịu
trách nhiệm cho tính chịu hạn.
Hầu hết các nghiên cứu về chỉ thị phân tử cho tính chống chịu khô hạn ñều
quan tâm ñến những tính trạng chính là: Khả năng xuyên sâu của rễ, sự ñiều tiết áp
suất thẩm thấu, hiệu quả sử dụng nước, hiện tượng biến dưỡng ABA. [21].[53]. Các
dữ liệu chỉ thị trong 1678 QTL cấu thành các ñặc ñiểm về khả năng chịu hạn và các
ñặc ñiểm nông sinh học ở lúa từ 41 công bố trước ñây ñã ñược xây dựng. Các QTL
này liên kết với 40 ñặc ñiểm liên quan ñến tính chịu hạn như: các ñặc ñiểm hình thái
rễ, áp suất thẩm thấu, ñộ cuốn lá, ñộ khô lá, chín sớm, sản lượng và các yếu tố cấu
thành năng suất ñược xác ñịnh từ 29 quần thể với 39 dòng bố mẹ. Những chỉ thị này
ñã ñược hình thành trong hệ gen của lúa. Các QTL trải ñều trên mỗi nhiễm sắc thể
từ 1-12 và có khoảng cách trung bình là 9,3 cM.
tăng cường tính chịu hạn như: kỹ thuật chuyển gen, kỹ thuật chọn dòng tế bào, chọn
lọc nhờ chỉ thị phân tử, tăng cường ñiều chỉnh áp suất thẩm thấu, giảm mất nước
qua bề mặt, nghiên cứu các ñặc ñiểm rễ liên quan ñến tính chịu hạn, ñiều khiển sự
biểu hiện và hoạt tính của các hệ vận chuyển K
+
, khả năng tăng cường sự thoát ra
của các ion Na
+
của tế bào rễ, loại bỏ gốc tự do Sau ñây chúng tôi ñi sâu vào ba
hướng chính là chuyển gen, chọn dòng tế bào và chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử.
a/ Chuyển gen
Nghiên cứu cơ chế chịu hạn cho thấy khả năng tăng cường tính chống chịu
của một số chất trong ñiều kiện môi trường cực ñoan. Cho ñến nay một số chất liên
quan ñến tính chịu hạn ñã ñược khẳng ñịnh (chẳng hạn sự tích lũy nhiều proline,
Copyright: Tài liệu đại học ©