Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Vũ Thị Hiền

NÂNG CAO HIỆU SUẤT BIỂU HIỆN
CỦA TEV PROTEASE TRONG VI KHUẨN E.coli
BẰNG PROTEIN DUNG HỢP SUPER FOLDER
GREEN FLUORESCENT PROTEIN (sfGFP) LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hà Nội – 2013
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

Tôi xin cảm ơn các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học, Viện Sinh thái và
tài nguyên sinh vật đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu
khoa học.
Tôi xin cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam, Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, nơi tôi làm
việc, đã tạo điều kiện tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện
luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và động
viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Học viên Vũ Thị Hiền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC TỪ VIẾT TĂT
Stt
Từ viết tắt
Tên đầy đủ
1

DNA
Deoxyribonucleic Acid
12
DTT
Dithiothreitol
13
E.coli
Escherichia coli
14
EDTA
Ethylenediaminetetraacetic acid
15
EtBr
Ethidium bromid
16
Gln
Glutamin
17
Glu
Acid glutamic
18
Gly
Glycin
19
GST
Glutathione transferase
20
His
Histidin
21

Sodium acetate
30
OD
Optical Density
31
PCR
Polymerase chain reaction
32
PMSF
Phenylmethanesunfonylfluoride
33
SDS
Sodium dodecyl sulfate
34
TAE
Tris- acid acetic – EDTA
35
TEMED
N, N, N’, N’- tetramethyl- ethylenediamine
36
v/ v
Volume/ volume: thể tích/ thể tích
37
X-gal
5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside
Bảng 2.3
Thành phần phản ứng gắn gene vào vector biểu hiện.

Bảng 2.4
Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE.

Bảng 2.5

Thành phần phản ứng cắt GP120 tái tổ hợp bằng sfGFP-
TEVp.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

DANH MỤC HÌNH
STT
Tên hình
Trang
Hình 1.1
Quá trình đồng biểu hiện và xử lý sau dịch mã của TEV

Hình 1.2
Cấu trúc không gian của TEV protease

Hình 1.3
Cấu trúc không gian của GFP

Hình 1.4


Hình 3.5
Kết quả biểu hiện sfGFP-TEVprotease

Hình 3.6
Kết quả biểu hiện sfGFP-TEV protease ở các nhiệt độ
khác nhau

Hình 3.7
Kết quả xác định trạng thái tồn tại của protein sfGFP-
TEVp khi biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau.

Hình 3.8
Kết quả biểu hiện sfGFP-TEVp ở các thời gian cảm ứng
khác nhau

Hình 3.9
Kết quả biểu hiện sfGFP-TEVp ở các nồng độ IPTG
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Hình 3.10
Kết quả tinh sạch sfGFP-TEVp tái tổ hợp

Hình 3.11
Điện di đồ kết quả kiểm tra hoạt tính của sfGFP-TEV.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 20
2.2.1. Thiết kế vector biểu hiện mang gene mã hóa sfGFP-TEVp 21
2.2.2. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn 21
2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

2.2.4. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli 23
2.2.5. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩnE.coli 24
2.2.6. Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli 25
2.2.7. Phương pháp xác định trạng thái tồn tại của TEVp 25
2.2.8. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 26
2.2.9. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột Probond Nickel- Chelating Resin 27
2.4.11. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford 28
2.2.11. Phương pháp thử hoạt tính của sfGFP-TEV protease 29
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. Thiết kế vector biểu hiện psfGFP-TEVp 31
3.2. Kiểm tra khung đọc của gene sfGFP-TEVp trong vector pET21(a+) 34
3.3. Kết quả biểu hiện sfGFP-TEVp trong E. coli BL21 (DE3) Star™ 35
3.4. Tối ƣu hoá các điều kiện biểu hiện 36
3.3.1 Ảnh hưởngcủa nhiệt độ nuôi cấy 37
3.3.2. Ảnh hưởng củ 39
3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 39
3.5. Kết quả tinh chế sfGFP-TEVp 41
3.6. -TEVp 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

một loại GFP ả ấp cuộn mạnh
tăng độ hòa tan, độ bền vàgấp cuộn của protein .

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, “Nâng cao
hiệu suất biểu hiện TEVprotease trong vi khuẩn E.coli bằng protein dung
hợp super folder Green Fluorescent Protein (sfGFP)” nhằm
TEV protease .
Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Vi sinh vật học Phân tử, Viện Công nghệ
sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.


- Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của
chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Endopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide đặc hiệu nằm giữa 2 amino
acid bên trong của protein hay peptide [14, 16]. Vị trí không gian của các amino
acid tạo thành vị trí xúc tác đƣợc bảo tồn trong tự nhiên của các protease và cung
cấp cách phân loại chúng thành 4 nhóm [16, 34]:
- Serin proteinase hay alkaline protease: là nhữ –OH của
gốc serine đóng vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động. Những enzyme này chứa
bộ ba xúc tác là His, Ser, Asp chịu trách nhiệm phân cắt, bộ ba này cố định chính
xác trong không gian 3 chiều bằng các khung alpha- carbon của protease. Yếu tố
Ser thƣờng không phản ứng và hoạt động nhƣ 1 nucleophile suốt quá trình xúc tác
bằng cách nhƣờng 1 điện tử cho nhóm cacbonyl cacbon của liên kết peptide để phân
hủy. Một acyl Ser đƣợc hình thành và một proton đƣợc nhƣờng để giải phóng một
nhóm amino nhờ yếu tố His ở trung tâm hoạt động. Acyl enzyme sau đó đƣợc phân
giải, sản phẩm acid cacboxylic sau đó đƣợc giải phóng và trung tâm hoạt động sau
đó đƣợc tái tạo [16]. Nhóm này bao gồm hai lớp nhỏ là chymotrypsin và subtilisin.
Trypsin là họ lớn nhất, bao gồm cả enzyme của động vật có vú và vi khuẩn. Một số
ví dụ phổ biến là enzyme tiêu hóa ở tuyến tụy nhƣ trypsin, chymotrypsin, elastase,
cũng nhƣ các enzyme đông máu thrombin, plasmin, và nhiều enzyme bổ sung.
Ngƣợc lại, họ subtilisin chỉ đƣợc tìm thấy trong vi khuẩn nhƣ subtilisin Carlsberg,
subtilisin BPN [31]. Các serine proteinase thƣờng hoạt động mạnh ở vùng kiềm, tối
ƣu ở pH 7 và 11và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tƣơng đối rộng.
- Cystein –SH trong trung tâm hoạt động
trực tiếp tham gia phản ứng xúc tác. Cystein protease có một bộ đôi xúc tác bao
gồm His và Cys tƣơng tác với nhau. Trong suốt quá trình phân giải protein, nhóm
sulhydryt của yếu tố Cys hoạt động nhƣ 1 nucleophile bắt đầu tấn công nhóm
cacbonyl cacbon của liên kết peptide để phân giải. Trong quá trình này, vòng

Protease trung tính có pH 7-8 nhƣ papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa,
ficin từ Ficus sp là những protease có nguồn gốc từ động vật. Những protease này
là cystein protease, papain là protease ổn định với nhiệt độ nhất. Vi khuẩn
Clostridium histolyticum sản xuất ra enzyme clostripain và Streptococcus spp sản
xuất ra enzyme streptopain, đều là cystein protease.
Protease kiềm có pH 9-11.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

1.2. TEV protease
1.2.1. Giới thiệu chung về Tobacco Etch Virus
Tobacco Etch Virus (TEV) là virus gây bệnh ở thực vật thuộc chi Potyvirus,
họ Potyviridae, phân nhóm IV picornavirus [21, 35]. TEV là virus RNA sợi đơn
dƣơng, không có vỏ bao bọc [5], hình dạng khúc khuỷu với chiều dài 730 nm, đƣờng
kính 12- 13 nm [39]. Virus trƣởng thành bao gồm xấp xỉ 2000 bản sao của protein
capsid (CP) trong có chứa sợi RNA đơn dƣơng không phân đoạn [5, 34]. Hệ gene của
TEV là phân tử RNA chứa 9596 nucleotide [15] liên kết cộng hóa trị với protein
đƣợc mã hóa trong virus (VPg) ở đầu 5’ và 1 đuôi poly A ở đầu 3’[13], tỷ lệ phần
trăm nucleotide là (20,1% C; 30,075% A; 22,8% G, và 27,1% U, hàm lƣợng phospho
(0,46% ± 0,02 %) [11, 22]. Tƣơng tự nhƣ các virus sợi RNA đơn dƣơng khác, hệ
gene virus chứa 1 khung đọc mở mã hóa cho 1 polyprotein với trọng lƣợng phân tử
346 kDa [10, 22], polyprotein này đƣợc phân cắt bởi 3 protease của chính nó và
protease của tế bào chủ [5, 20, 37] tạo ra các protein khác của virus. Ba protease của
virus xúc tác cho quá trình biến đổi sau dịch mã là P1, HC-Pro và NIa [21, 22].
Protein chiếm 95% trọng lƣợng hạt virus TEV [11]. Các phân tích đột biến và hóa
sinh cho thấy hầu hết các protein đều có chức năng trực tiếp hoặc gián tiếp trong quá
trình sao chép hệ gene của virus [22, 39].
Bảng 1.1: Chức năng dự đoán của các protein trong TEV
PROTEIN
CHỨC NĂNG

protein; NIa-VPg: Nucleotide inclusion a- viral protein virus genome.
1.2.2. Nguồn gốc, phân loại và vai trò của TEV protease trong đời sống của virus.
Hệ gene của TEV chứa một khung đọc mở (ORF), đƣợc dịch mã thành 1
polyprotein, sau đó trải qua quá trình sửa chữa sau dịch mã và phân cắt bởi 3
protease của virus là P1, HC- pro và NIa để tạo ra các protein khác nhau của virus
(hình 1.1). P1 và HC- pro chỉ xúc tác cho 1 phản ứng tự phân giải protein ở đầu
cacboxyl tƣơng ứng của nó trong khi NIa xúc tác cho 7 hoặc 8 sự phân cắt còn lại
trong suốt quá trình tự phân giải [21], TEV NIa protease (hoặc còn gọi là TEV
protease) là vùng xúc tác 27kDa của NIa protease [37].
TEV protease đƣợc phân loại theo EC (Enzyme Commission) số: 3.4.22.44.
Phân tích phân loại này nhƣ sau:
Enzymes.
3. Hydrolases.
3.4 Hoạt động ở liên kết peptide (peptidases).
3.4.22 Cysteine endopeptidases.
3.4.22.44 Endopeptidase thể vùi trong nhân (NIa) TEV protease.
TEV protease đóng vai trò chính trong việc phân giải protein trong quá trình
xử lý protein sau dịch mã, xử lý polyprotein gốc thành các protein chức năng, đồng
thời cũng đóng vai trò trong việc nhân bản hệ gene của virus [16, 19]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 1.1: Quá trình đồng biểu hiện và xử lý sau dịch mã của TEV
1.2.4. Cấu trúc của TEV protease
TEV NIa protease (TEV protease) là vùng xúc tác 27kDa 1.2) của NIa
protease trƣởng thành [39]. NIa protease trƣởng thành có khối lƣợng 49 kDa và xảy
ra quá trình tự phân cắt để tạo ra một protein liên kết với RNA của virus (VPg 21
kDa) và TEV NIa protease. TEV protease gồm 234 amino acid ứng với amino acid

có vai trò điều khiển sự phân cắt [13, 30]. Kapust và các cộng sự [24] cho thấy, ở vị
trí P’l của cơ chất có thể là Gly hoặc Ser và đây cũng là điểm cắt của TEV protease.
Ông và các cộng sự đã thiết kế 20 loại protein dung hợp khác nhau chứa các trình tự
nhận biết của TEV protease chỉ khác nhau ở vị trí P’1, sau đó thực hiện phản ứng
cắt với TEV protease từ đó đánh giá tác động của vị trí P’1 đến hiệu quả xúc tác của
protease TEV và nhận thấy ảnh hƣởng của các amino acid tại vị trí P’1 đến khả
năng cắt của TEV protease nhƣ sau: \G> S> A> M> C> N> H> Y> K> D> Q> F>
T> W> R> L> E> I> V> P. Kết quả nghiên cứu còn cho thấy, việc thay thế các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

amino acid làm giảm đáng kể hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của TEV protease, khi
thay đổi amino acid vị trí P5 và P2 có thể tăng hoặc giảm tỷ lệ phân cắt [16].Vai trò
và sự ảnh hƣởng của từng amino acid trong trình tự nhận biết trên đến tốc độ
(Vmax) và hiệu suất phản ứng của TEVp đã đƣợc Tsuchida và cộng sự khảo sát
trong một nghiên cứu gần đây. Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu thay thế
các vị trí amino acid trong trình tự nhận biết kinh điển của TEVp là Glu – Asn –
Leu – Tyr – Phe – Gln – Gly/Ser và nhận thấy: khi thay Phe bằng Leu, Val, Ser và
Cys giá trị Vmax của enzyme lần lƣợt là 73%, 43%, 42%, 25% [37]. Trong một
nghiên cứu trƣớc đó, Dougherty và cộng sự chỉ ra rằng khi thay Phe bằng Leu, Val,
Ser thì tỷ lệ phân cắt cơ chất của TEV protease là 20%, còn khi thay bằng Cys thì tỷ
lệ phân cắt cơ chất không thay đổi. Kapust và cộng sự quan sát thấy khi thay Gly
bằng Ala, Ser, Ile, Arg thì giá trị Vmax của TEV lần lƣợt là 96%, 92%, 17%, 11%,
còn tỷ lệ phân cắt cơ chất khi thay Gly bằng Ser và Ala là nhƣ nhau. Trong khi đó
khi thay thế Gly bằng Ile và Arg thì tỷ lệ phân cắt cơ chất tƣơng ứng là 60%, 70%
[24]. Kết quả nghiên cứu của các nhóm trên có sự sai khác nhất định, điều này có
thể là do họ sử dụng phƣơng pháp nghiên cứu khác nhau. Các tác giả đứng đầu là
Suchudia dùng phƣơng pháp huỳnh quang HAFCOM (Homogeneous Assay for
Fluorescence Concentrated On Membrane) [31], trong khi đó nhóm của Dougherty
và cộng sự sử dụng phƣơng pháp quét hình ảnh (Scanning of the band in dried

0
C TEV protease
vẫn hoạt động tốt với đầy đủ hoạt tính. Điều này làm giảm sự phân giải protein của
protein đích [39], đặc biệt với các protein phụ thuộc nghiêm ngặt vào nhiệt độ, dễ bị
phân hủy ở nhiệt độ cao [9]. Các TEV protease tái tổ hợp duy trì hoạt động cao
trong nhiều hệ dung dịch đệm trong sắc ký và chịu đƣợc nồng độ cao của chất bổ
sung thƣờng đƣợc sử dụng trong tinh chế protein, chẳng hạn nhƣ ethylene glycol,
EGTA, Triton X-100, Tween-20, NP-40, chaps, urê, SDS, guanidine hydrochloride
và β-mercaptoethanol [24, 29].
Nhiều nghiên cứu cho thấy, TEV protease nhận biết và cắt chính bản thân
nó, hay nói cách khác là tự phân cắt để tạo thành một protease ngắn hơn với hoạt
tính giảm đi rất nhiều [24, 30]. Đặc tính này gây khó khăn cho quá trình tinh sạch
để tách các sản phẩm bị cắt ngắn ra khỏi các protease hoàn chỉnh cũng nhƣ ra khỏi
sản phẩm phân cắt của protein đích. Hơn nữa, sự mất hoặc giảm hoạt tính trong việc
bảo quản các enzyme là một lo ngại đáng kể. Việc biểu hiện TEV protease trong
E.coli gặp phải trở ngại nhƣ năng suất thấp và dạng hòa tan ít [9, 26]. Trong thực tế,
TEV protease tái tổ hợp thƣờng hòa tan ở nồng độ dƣới 1mg/ml và duy trì đặc tính
ở 50% (v/v) glycerol [9]. Để cắt cơ chất hiệu quả, vị trí nhận biết của TEV protease
trên phân tử protein đích cần Gly hoặc Ser ở vị trí P’1. Do đó, nếu protein dung hợp
hay đuôi ái lực gắn với protein đích ở đầu N thì sau khi bị loại bỏ bởi TEV protease,
các protein đích thƣờng sẽ giữ lại Ser hoặc Gly ngoại lai (ở vị trí P’1) tại đầu N của
nó, và trong một số trƣờng hợp điều này có thể ảnh hƣởng đến hoạt tính sinh học
của protein đích [25].
1.2.7. Tình hình nghiên cứu TEV protease tái tổ hợp trong và ngoài nước
Do tính đặc hiệu cơ chất cao và tầm quan trọng của enzyme này trong nghiên
cứu y học, sinh học nên TEV protease đƣợc nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

quan tâm nghiên cứu. Một trong các hƣớng tiếp cận chủ yếu là sử dụng công nghệ


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

nghiên cứu cho thấy, khi thay thế một số amino acid nhƣ Lys ở vị trí 45 thành Phe
(Lys45Phe), và Ser ở vị trí 135 thành Gly (Ser135Gly) làm tăng độ hòa tan của
rTEVp lên 6 lần, đặc biệt khi thay thế cùng lúc 2 amino acid là
Lys56Val/Ser135Gly độ hòa tan của rTEVp tăng lên trên 40 lần so với dạng dại [7,
9].
- Năm 2009, ba nhà nhà khoa học gồm Tropea, Cherry và Waugh đã làm tăng khả
năng hòa tan của rTEVp biểu hiện ở E.coli bằng cách dung hợp với MBP và thay
thế Ser ở vị trí 219 thành Val [23].
- Năm 2011, Miladi và cộng sự đã nghiên cứu dung hợp TEVp với Streptag II
(Streptag II-TEVp) và biểu hiện protein dung hợp trong E.coli ở điều kiện nhiệt độ
thấp [6]. Hệ thống Streptag đƣợc ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất, tinh sạch
các protein tái tổ hợp. Kết quả cho thấy việc dung hợp với Streptag II làm tăng đáng
kể về độ hòa tan của TEVp, protein tái tổ đƣợc tinh sạch bằng sắc ký ái lực Strep-
tactin với hiệu quả lên đến 99%. Hiệu quả của việc tinh sạch bằng phƣơng pháp
Streptag đã đƣợc Lichty và cộng sự khẳng định vào năm 2005.Nghiên cứu của
Miladi và cộng sự cũng cho thấy Streptag II-TEVp vẫn giữ đƣợc hoạt tính enyme
tƣơng tự 6xHis-TEVp [6].
Cho đến nay chúng tôi chƣa tìm thấy công bố nào về nghiên cứu biểu hiện và
tinh sạch TEVp tái tổ hợp tại Việt Nam.
1.3. Tổng quan về Green Fluorecent Protein (GFP)
1.3.1. Đặc điểm cơ bản của GFP
GFPlà một protein, đƣợc đặt tên bởi MorinvàHastings[40], chứa 238 amino
acid có khối lƣợng phân tử 26,9 kDa và có khả năng phát ra huỳnh quang màu xanh
lá khi đƣợc chiếu tia sáng màu xanh da trời[40]. GFP đƣợc phân lập chủ yếu từ sứa
Aequorea Victoria hoặc Renilla reniformis.Trong A. victoria có hai loại protein
phát quang là Aequorin và GFP. Aequorin khi tƣơng tác với ion Ca
2+

Quá trình thành thục của GFP diễn ra nhƣ sau: trong môi trƣờng thuỷ phân,
xảy ra phản ứng giữa gốc carboxyl của Ser65 và gốc amino của Gly67, dẫn đến sự
hình thành hệ thống vòng imidazol-5-one heterocyclic nitrogen. Quá trình oxi hoá
tiếp sau đó tạo liên kết giữa vòng Imidazol với Tyr66 và do đó tạo thành protein có
hoạt tính.
GFP t nhiên từ A. victoria tồn tại ở hai trạng thái : dạng proton hoá (dạng
trội) và dạng không proton hoá (hiếm gặp hơn), tƣơng ứng có hai đỉnh kích
thích:đỉnh chính ở bƣớc sóng 395nm và đỉnh phụ có bƣớc sóng 475nm. Dƣới ánh
sáng kích thích, GFP phát ra ánh sáng có bƣớc sóng 509nm, tƣơng ứng với ánh sáng
màu xanh lá trong phổ ánh sáng nhìn thấy, ngay cả khi kích thích dƣới ánh sáng
UV, GFP vẫn có khả năng phát huỳnh quang.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Hình 1.4.Đỉnh kích thích huỳnh quang (nét liền) và đỉnh huỳnh quang phát ra
(nét đứt) của GFP tự nhiên từ A. victoria.
1.3.2. Super folder GFP và các biến thể khác của GFP
GFP tự nhiên có một vài nhƣợc điểm nhƣ phổ kích thích lƣỡng cực, kém bền
với ánh sáng và cuộn gấp kém ở 37
0
C. Tuy nhiên, với tiềm năng ứng dụng to lớn,
nhiều biến GFP đã đƣợc tạo ra nhằm mục đích cải thiện tính hòa tan, độ bền