BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH METAN
TRONG NƯỚC THẢI CỦA NHÀ MÁY GIẤY TÁI CHẾ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGs. Ts. TRẦN NHÂN DŨNG NGUYỄN THỊ HOÀNG NGÂN
Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN MSSV: 3092493
LỚP: CNSH TT K35
Cần Thơ, 2013PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1 SINH VIÊN THỰC HIỆN

cứu này.
Xin được gi lời cảm ơn chân thành đn tất cả qu Thầy Cô Viện Nghiên cứu và
Phát triển Công nghệ Sinh học đặc biệt là Thầy Đỗ Tấn Khang luôn tận tình giúp đỡ và
truyền dạy cho tôi kin thức, giúp tôi có những kin thức hữu ích phục vụ cho việc thực
hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn các bạn sinh viên, cùng các anh chị học viên cao học, các
bạn sinh viên của phòng thí nghiệm CNSH Enzyme đã nhiệt tình giúp đỡ và chia s nhiều
kinh nghiệm qu báu trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày t lòng bit ơn sâu sắc đn gia đình và người thân đã động
viên, khích lệ và luôn ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian
qua để tôi vững tin thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Kính chúc qu vị nhiều sức khe, hạnh phúc và thành đạt.
Xin trân trọng cảm ơn!

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
TÓM LƯỢC
Đề tài: “phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh metan trong nước thải nhà máy
giấy tái chế” được tiến hành dưới mục đích tìm ra và khảo sát các đặc điểm của vi khuẩn
sinh metan. Môi trường nuôi cấy không có thành phần carbon hữu cơ được chuẩn bị kị
khí bằng cách sục khí N
2
để đuổi khí O
2
, thời gian sục 40 phút ở tốc độ dây 1kg/cm
3
cho
500ml môi trường là thời gian tối ưu. Khí N
2
sau đó được thay thế
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
MỤC LỤC
Trang

PHẦN KÝ DUYỆT i
LỜI CẢM TẠ i
TÓM LƯỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
TỪ VIẾT TẮT viii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1 Đăt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu đề tài 2
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 Sơ lược về vi khuẩn sinh metan: 3
2.2 Sơ lược về quá trình kỵ khí 5
2.3 Sơ lược về vi sinh vật kị khí trong nước thải nhà máy giấy tái chế 7
2.4 Các nghiên cứu liên quan 8
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9
3.1 Phương tiện nghiên cứu 9
3.1.1 Thời gian 9
3.1.2 Địa điểm 9
3.1.3 Nguyên liệu 9
3.1.4 Dụng cụ, thit bị và hóa chất 9
3.2 phương pháp nghiên cứu 12
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

4.6.2 Kt quả giải trình tự dòng D3: 37
4.6.3 Kt quả giải trình tự dòng D4: 39
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44
5.1 Kết luận 44
5.2 Kiến nghị 44
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
TÀI LIỆU THAM KHẢO 45
PHỤ LỤC 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1
PHỤ LỤC 2: SỐ LIỆU KẾT QUẢ 3
PHỤ LỤC 3: SỐ LIỆU THỐNG KÊ VÀ GIẢI TRÌNH TỰ 6 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Thành phần khí biogas 6
Bảng 2. Thành phần môi trường theo Zeikus 10
Bảng 3. Thành phần khoáng 11
Bảng 4. Thành phần vitamin 11
Bảng 5: Các nghiệm thức của thí nghiệm khảo sát khả năng chuyển hóa CO
2
và H
2

của vi khuẩn thông qua độ giảm áp suất khí 15
Bảng 6: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn 23
Bảng 7. Đặc điểm hình thái của 3 dòng D1, D3, D4 41
Bảng 8. Nồng độ oxy ở các nghiệm thức thời gian

Hình 12: Đường tăng trưởng của D3 29
Hình 13: Đường tăng trưởng của dòng D4 30
Hình 14: Đường tăng trưởng của dòng D5 31
Hình 15: Kt quả kiểm tra sản phẩm PCR khuch đại vùng gene 16S rRNA trên gel
agarose 1,5% của 3 dòng vi khuẩn. Sản phẩm điện di xuất hiện ở kích thước khoảng
1500bp 33
Hình 16: Kt quả tra cứu trên Blast của D1 34
Hình 17: Sơ đồ miêu tả đơn giản cơ ch cố định CO
2
của enzyme PEPC 35
Hình 18: Thông số kt quả so sánh trên BLAST N của dong D1 và Shigella
sonnei Ss046 36
Hình 19: Kt quả tra cứu trên Blast của D3 37
Hình 20: Thông số kt quả so sánh trên BLAST N của dòng D3 và Enterobacter sp.
REICA 38
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Hình 21: Kt quả tra cứu trên Blast của D4 39
Hình 22: Thông số kt quả so sánh trên BLAST N của dòng D4 và Enterobacter sp.
REICA 40
Hình 23: Cây phả hệ (phylogenic tree) giữa các dòng D1, D3 và D4 với các loài
đồng hình trên ngân hàng gene so sánh với một số chủng methanogen Error!
Bookmark not defined.
Hình 24: Phổ đồ giải trình tự gene 16S của D1
Hình 25: Phổ đồ giải trình tự 16s của D3
Hình 26: Phổ đồ giả trình tự của D4

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1 Đăt vấn đề
Công nghiệp giấy là một trong những nền công nghiệp chim vị trí quan trọng trong
kinh t quốc gia. Mỗi năm Việt Nam sản xuất 1,13 triệu tấn giấy, trong tổng số đó giấy tái
ch chim 70% (Vũ Ngọc Bảo, 2010). Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích to lớn về kinh t
– xã hội, nghành công nghiệp này cũng phát sinh nhiều vấn đề môi trường bức xúc cần
phải giải quyt, đặc biệt là nước thải.
Nước thải của các nhà máy giấy có hàm lượng COD khá cao 22000-46500 mg/l, BOD
chim từ 40-60% COD (Công ty môi trường Ngọc Lân, 2012). Do đó việc x lý trước khi
xả vào nguồn tip nhận là một điều tất yu. Các phương pháp hóa l đã được ứng dụng để
giải quyt vấn đề một cách nhanh chóng. Tuy nhiên những phương pháp này để lại các
chất tồn đọng gây ô nhiễm môi trường về lâu dài và có chi phí vận hành cao. Vì vậy,
phương pháp x lý sinh học được xem như là phương pháp triệt để nhất. Mặc dù vậy,
phương pháp này cn bị hạn ch do thời gian x lý chậm. Nên việc tăng hiệu suất và rút
ngắn thời gian x lý là một ưu tiên hàng đầu. Dựa trên l do đó đề tài được xây dựng với
mục đích tìm kim những loài vi khuẩn sinh metan - một trong những loài sinh trưởng
chậm, nhưng có hiệu quả kinh t cao do khả năng sản xuất metan thu hồi- tối ưu về thời
gian sinh trưởng và khả năng sinh khí để ứng dụng vào chu trình x l nước thải.
Methanogen là vi khuẩn cổ sinh metan hoạt động như mắc xích cuối trong chuỗi
chuyển hóa cơ chất ở hồ kị khí. Loài vi khuẩn này không những phân giải được các acid
béo, methanol cùng nhiều chất gây ô nhiễm khác mà còn có khả năng sản sinh ra khí
metan, một khí đóng vai tr quan trọng trong thành phần biogas do cung cấp nhiệt lượng
cao. Ngoài hình thức sinh trưởng dị dưỡng, methanogen còn có hình thức hóa tự dưỡng.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về vi khuẩn sinh metan:
Vi khuẩn sinh metan sống trong môi trường kị khí bắt buộc. Kt hợp với các vi sinh
vật kị khí khác để phân giải các chất hữu cơ có trong nước thải, đầm bùn và dịch tiêu hóa
cũng như các hệ sinh thái khác. Vi khuẩn sinh metan được chia thành nhiều nhóm với
nhiều hình dạng khác nhau. Tuy vậy, tất cả có chung một vài đặc điểm nhất định. Các vi
khuẩn này đều có khả năng s dụng hidro như một nguồn năng lượng. Nguồn carbon chủ
yu từ forrmate, methanol. Một phương thức khác là có thể tổng hợp carbon cho t bào từ
CO
2
. Theo tính toán thì hydro và formate là nguồn năng lượng tương đương nhau, hai
nguồn năng lượng thấp hơn là methanol và acetate. Phân tích trên một mol CH
4
tạo thành

2
CH
2
SO
3
, cấu trúc phân t và tổng hợp hóa học
của CoM được nghiên cứu bởi Taylor và Wolfe (1974).

Hình 1. Chức năng của CoM trong sự sản sinh CO
2

(*Nguồn: Gunsalus et al, 1978)
Hợp chất huỳnh quang (Fluorescent compound), F
420
, hiện diện trong hầu ht các
nghiên cứu về loài vi khuẩn này. Cấu trúc của F
420
hiện tại vẫn chưa được tìm ra.Hợp chất
này có đỉnh hấp thụ cao nhất tại bước sóng 420 nm ở trạng thái oxi hóa.

Hình 2. Vai trò của F420
(*Nguồn: Tzeng et al, 1975)
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Sự tổng hợp metan: Vi khuẩn sinh metan s dụng hydro- carbon dioxide, formate,
methanol, acetate, cơ ch chính xác cho mỗi cơ chất trên là tùy thuộc vào mỗi loài. Mô
hình chuyển hóa được miêu tả như sau.
Hình 3. Quá trình tổng hợp metan
(*Nguồn: Barker, 1956)
2.2 Sơ lược về quá trình kỵ khí


(*Nguồn: aao.htmlhttp
://www.duongnhat.com.vn/, ngày 6/8/2013)
Methane có nhiệt trị cao (gần 9.000 kcal/m
3
). Do đó, nhiệt trị của Biogas khoảng
4.500 - 6.000 kcal/m
3
, tùy thuộc vào phần trăm của methane hiện diện trong Biogas.

Hình 4. Quá trình phân hủy yếm khí được chia thành 3 giai đoạn chính
(*Nguồn: McCathy và Donchin, 1981)
Thành phần
Phần trăm
Methane (CH
4
)
55¸65%
Carbon dioxide (CO
2
)
35¸45%
Nitrogen (N
2
)
0¸3%
Hydrogen (H
2
)
0¸1%

2
, và H
2
. Acetate là
sản phẩm chính của quá trình lên men carbon hydrate.
- Nhóm 3: Vi khuẩn tạo Aceton:
Vi khuẩn tạo aceton chuyển các acid béo (như: acid propionic và butyric) và rượu
thành acetate, hydro, and CO
2
, những chất này sẽ được s dụng bởi nhóm vi khuẩn tạo
metan. Nhóm này đi hi nồng độ hydro thấp để chuyển hoá các axít béo và do đó cần
phải theo dõi sát nồng độ hydro. Dưới điều kiện nồng độ hydro cục bộ cao, sự tạo thành
acetate giảm và chất nền sẽ chuyển thành acid propionic, butyric và ethanol thay vì
metan.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
- Nhóm 4: Vi khuẩn tạo khí metan:
Trong tự nhiên vi khuẩn tạo mêtan khó tính này thường có ở các lớp bùn trầm tích
hoặc trong dạ dày của các loài ăn c. Nhóm này được tạo thành bởi các vi khuẩn gram âm
và gram dương với các hình dạng khác nhau. Các vi sinh tạo mêtan sinh trưởng chậm
trong nước thải, chu kỳ sinh có thể từ 2 ngày ở 35
0
C cho đn 50 ngày ở 10
0
C. Khoảng
2/3 mêtan được tạo ra từ sự chuyển hoá acetate của nhóm vi khuẩn này. 1/3 còn lại là do
sự giảm CO
2
tạo ra bởi hydro.
2.4 Các nghiên cứu liên quan

3.1.3 Nguyên liệu
Mẫu nước thải thu từ nhà máy TNHH Ch Bin và Thương mại Bao Bì Tân Hưng
đường Cái Sơn Hàng Bàng , Quận Ninh Kiều, Thành Phố Cần Thơ.
Thu và xử lý mẫu
- Nguyên tắc: thu mẫu ở độ sâu 2m trong điều kiện kị khí bắt buộc. S dụng hệ
thống ống thu có valve một chiều, dọc thân ống có phần cao su trong, mềm.
- Tiến hành:
Làm sạch ống thu bằng alcohol và tiệt trùng bằng dung dịch iodine.
Lấy mẫu ở một độ sâu 2m.
S dụng ống tiêm và kim tiêm. Làm đầy ống tiêm với hỗn hợp khí H
2
và CO
2
. Giữ
ống đứng thẳng, trút xuống để giữ khí hidro không bị thoát ra.
Đẩy ht khí ra ngoài, hút mẫu, cho mẫu vào chai đã đóng nắp và được làm đầy bằng
khí H
2
và CO
2
, giữ mẫu tránh ánh sáng.
Trữ mẫu ở 4
o
C.
3.1.4 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
- Dụng cụ
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Chai thủy tinh 50ml, nắp cao su butyl, nhắp nhôm, ống đong, pipet, chai môi trường,
bơm kim tiêm 10cc, bơm kim tiêm 100cc, cốc thủy tinh, que cấy, đèn cồn

.6H
2
O, ZnCl
2
, CaCl
2
, H
3
BO
3
,

Sodium molybdate, KH
2
PO
4
, K
2
HPO
4
, NH
4
Cl, MgCl
2
.H
2
O, nitrilotriacetic acid,
FeCl
2
.4H

4

0,75
K
2
HPO
4

1,45
MgCl
2
.6H
2
O
0,2
Vitamin
10 ml
Khoáng
9 ml
(*Nguồn: Zeikus ,1977)
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Bảng 3. Thành phần khoáng
Thành phần
Khối lượng (g/l)
CoCl
2
.6H
2

O
0.1
CaCl
2

0.02
(*Nguồn: Zeikus ,1977)
Bảng 4. Thành phần vitamin
Thành phần
Khối lượng
(mg/l)
Nicotinic acid
10
Thiamine
10
Biotin
5
Folic acid
5
B12
5
(*Nguồn: Zeikus ,1977) Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 12 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
3.2 phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Thiết lập hệ thống nuôi cấy kỵ khí
Mục đích: Thit lập được một hệ thống an toàn và vận hành dễ dàng, có khả năng
tạo môi trường nuôi cấy không có thành phần oxy.

sục khí.
- Chuẩn bị chai môi trường 500ml, thổi khí nitơ tại áp suất dây là 1 kg/cm
3
được đo
bởi đồng hồ khí TANAKA, Đài Loan. Sau khi sục đủ thời gian, dùng pipet rút 20
ml dung dịch cho vào chai 50ml đang được sục khí với cùng áp suất dây. Rút chai
ra nhẹ nhàng, đóng nắp cao su rồi dập nắp nhôm khít lại. Thay hỗn hợp khí H
2
và
CO
2
, dùng kim tiêm cân bằng áp suất chai với áp suất khí quyển.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 14 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
- Dùng máy sắc k khí để phân tích thành phần phần trăm oxy có trong hỗn hợp khí.
3.2.3 Phân lập vi khuẩn
- Mục đích thí nghiệm: Phân lập vi khuẩn sinh metan.
- Nguyên tắc: Methanogen sống trong môi trường kị khí bắt buộc và có thể s dụng
H
2
như chất cung cấp năng lượng và CO
2
là nguồn carbon. S dụng môi trường
chuyện biệt của Ziekus để phân lập vi khuẩn, ủ tại 25
0
C.
- Tiến hành:
 Dựa vào thí nghiệm khảo sát thời gian đẩy oxy bằng khí nitơ để tạo môi trường
ym khí.
 Chuẩn bị môi trường trong chai nắp xanh 500ml (chuẩn bị môi trường đặc bằng

0
C.
Chỉ tiêu đánh giá
Quan sát khuẩn lạc: hình dáng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc.
Quan sát vi khuẩn: hình dạng vi khuẩn dưới vật kính dầu x100, gram.

Trích đoạn Kết quả thiết lập hệ thống nuôi cấy kỵ khí Kết quả giải trình tự vùng gene 16S rRNA của các dòng vi khuẩn

---