BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TỐI ƯU HÓA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
BACILLUS sp. SV1 SINH PROTEASE
KIỀM TÍNH

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Ts. DƯƠNG THỊ HƯƠNG GIANG NGUYỄN HOÀNG VŨ
MSSV: 3092561
LỚP: CNSHTT K35
Cần Thơ, Tháng 12/2013

LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành đề tài luận văn tốt nghiệp, ngoài sự nổ lực, cố gắng không ngừng
của bản thân. Tôi còn nhận được sự quan tâm chân thành từ gia đình, thầy cô, bạn bè.
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS. Dương Thị Hương
Giang đã tận tình giúp đỡ và góp ý trong quá trình thực hiện luận văn.
Xin cảm ơn tới các thầy, cô, các anh chị quản lý trong các phòng thí nghiệm đã
tạo điều kiện thuận lợi nhất về cơ sở vật chất.
Cảm ơn các anh chị trong phòng Công nghệ Enzyme đã tận tình giúp đỡ và
hướng dẫn những kiến thức cơ bản trong phòng thí nghiệm
Cảm ơn tập thể lớp Công nghệ Sinh học Tiên tiến khóa 35 đã nhiệt tình giúp đỡ
và động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cảm ơn gia đình tôi đã luôn quan tâm, động viên và tạo điều kiện tốt nhất để tôi
có thể hoàn thành luận văn tốt nhất.
Một lần nữa xin chân thành cảm ơn và trân trọng.

Cần Thơ, ngày 4 tháng 12 năm 2013

Nguyễn Hoàng Vũ Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TÓM LƯỢC
Protease kiềm tính từ vi khuẩn là nguồn enzyme có giá trị cao trong công nghệ
enzyme. Quá trình phân lập và khảo sát sơ bộ một số chủng sinh protease kiềm tính ở
phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần
Thơ đã xác định được dòng vi khuẩn Bacillus sp. SV1 là dòng có tiềm năng sinh tổng
hợp protease kiềm tính. Kết quả tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy nhằm mục đích tăng
sản lượng protease kiềm tính ngoại bào của dòng vi khuẩn này cho thấy với lượng vi

2.2.1. Vi khuẩn Bacillus. 5
2.2.2. Đặc điểm protease kiềm tính của Bacillus sp. 5
2.3. Ứng dụng của protease kiềm tính 8
2.3.1. Công nghiệp thực phẩm 8
2.3.2. Công nghiệp thuộc da 8
2.3.3. Công nghiệp dược 8
2.3.4. Công nghiệp chất tẩy rửa 9
2.4 Các phương pháp định lượng và xác định hoạt tính của protease 9
2.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng protein (Bradford, 1976). 9
2.4.2. Phương pháp xác định hoạt tính protease (Kunitz cải tiến, 1947) 9
2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 9
2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 9
2.5.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 10

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
3.1. Phương tiện nghiên cứu 11
3.1.1. Dụng cụ thiết bị 11
3.1.2. Nguyên vật liệu 11
3.1.3. Hóa chất 11
3.2. Phương pháp nghiên cứu 11
3.2.1 Quy trình chung về nuôi cấy và thu nhận protease kiềm tính từ vi khuẩn
Bacillus sp. SV1. 11
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ đến khả năng sinh protease
kiềm tính của Bacillus sp. SV1. 12
3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ đến khả năng sinh
protease kiềm tính của Bacillus sp. SV1. 13
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng tương tác giữa nhiệt độ và pH lên khả năng sinh

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Một số các protease kiềm tính được sản xuất theo qui mô công nghiệp bởi
Bacillus sp 5
Bảng 2. Trọng lượng của các phân tử protease kiềm tính tổng hợp bởi các dòng
Bacillus sp 7
Bảng 3. Điểm đẳng điện pI của các protease chịu kiềm được sản xuất bởi các dòng
Bacillus sp 8
Bảng 4. Thành phần môi trường Horikoshi-I (pH 9.0) 12
Bảng 5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ. 12
Bảng 8. Kết quả OD đường chuẩn Tyrosine Phụ lục
Bảng 9. Ảnh hưởng của cơ chất nguồn nitơ và nồng độ lên khả năng sinh protease
kiềm tính của Bacillus sp. SV1. Phụ lục
Bảng 10. Ảnh hưởng của cơ chất nguồn carbon và nồng độ lên khả năng sinh protease
kiềm tính của Bacillus sp. SV1. Phụ lục
Bảng 11. Ảnh hưởng của thời gian lên khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus
sp. SV1. Phụ lục
Bảng 12. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus sp.
SV1 Phụ lục
Bảng 13. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh protease kiềm tính của Bacillus
sp. SV1. Phụ lục
Bảng 14. Ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ lên khả năng sinh protease kiềm
tính của Bacillus sp. SV1. Phụ lục
Bảng 15. Hoạt tính của protease trong môi trường Horikoshi-I. Phụ lục
Bảng 16. Hoạt tính của protease theo nguồn nitơ và nồng độ Phụ lục
Bảng 17. Hoạt tính của protease kiềm tính theo nguồn carbon và nồng độ. Phụ lục
Bảng 18. Hoạt tính của protease kiềm tính theo thời gian nuôi cấy. Phụ lục
Bảng 19. Hoạt tính của protease kiềm tính theo pH Phụ lục


Chuyên ngành công nghệ sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CÁC TỪ VIẾT TẮT
CFU Colony-forming unit
EDTA Ethylendiaminetetraacetic acid
pI Isoelectric point
SDS Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Enzyme đã được sử dụng trong sản xuất và đời sống từ lâu, tuy nhiên việc nâng
cao chất lượng sản phẩm enzyme và giảm chi phí sản xuất là vấn đề mà các nhà khoa
học đang chú tâm. Enzyme là chất xúc tác sinh học không thể thiếu trong quá trình
trao đổi chất của sinh vật. Enzyme tinh sạch hay enzyme thô được ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực như chế biến thực phẩm, thuộc da, công nghiệp chất tẩy rửa, trong y
dược học, trong kỹ thuật phân tích xét nghiệm, trong sinh học phân tử, xử lý chất thải
v.v
Protease đóng vai trò quan trọng nhất trong công nghệ enzyme, protease được
sử dụng rộng rãi, chiếm hơn 60% tổng sản lượng enzyme sản xuất trên thế giới
(Kalisz, 1998; Beg et al., 2003; Ellaiah et al, 2003). Đã có rất nhiều nghiên cứu về
protease ở nước ta nhưng về protease kiềm tính vẫn còn khá ít. Phần lớn các protease
hoạt động ở một dãy pH hẹp, chủ yếu ở pH acid và trung tính nhiều hơn. Riêng
protease kiềm tính hoạt động trong phổ pH rộng và hoạt tính khá bền ở nhiệt độ cao
cho thấy ưu việt của nhóm enzyme này.
Các enzyme của vi khuẩn Bacillus có nhiều lợi ích về mặt sản xuất với quy mô
lớn. Ngoài ra, ứng dụng vi khuẩn này trong việc sản xuất protease kiềm tính có lợi thế

chịu nhiệt…
Phân loại protease
- Protease được phân làm hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
- Dựa vào phản ứng với mạch polypeptide, exopeptidase được chia làm hai
loại:
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu mút C của
chuỗi poly peptide và giải phóng tuần tự từng acid amin hay từng dipeptide.
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hay tripeptide.
- Dựa vào động học của phản ứng xúc tác, endopeptidase được chia làm 4
nhóm:
+ Serine proteases: là những enzyme có chứa nhóm –OH của serine trong
trung tâm hoạt động của enzyme và có vai trò đặc biệt trong phản ứng xúc tác của
enzyme. Nhóm này chia thành hai nhóm nhỏ hơn là chypmotrypsin và subtilisin.
Nhóm chymotrypsin có ở động vật như trypsin, elastase. Nhóm subtilisin gồm hai loại
protease kiềm tính từ vi khuẩn như subtilisin Carsberg, subtilisin BPN’. Các serine

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
protease hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối
rộng.

Hình 1. Cơ chế phản ứng của serine proteases
(Nguồn: http://www.jiaowu.buct.edu.cn/Courseware/Harvard/BCMP201/pdf/ctw_proteases1.pdf,
19/11/2013)
+ Cysteine proteases: bao gồm các protease có chứa –SH trong trung tâm
hoạt động. Các cysteine protease gồm papain, bromelin và các enzyme của kí sinh
trùng. Các enzyme này hoạt động ở vùng pH trung tính.


Hiện nay, vi khuẩn là một nguồn cung cấp protease chính vì sự vượt trội trong sản sinh
và tốc độ xúc tác so với các protease từ nấm và các loại vi sinh vật khác. Đa số các
protease thương mại được sản xuất hiện nay, đều được sản xuất từ các chủng Bacillus
sp.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2.2. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus.
2.2.1. Vi khuẩn Bacillus.
Nhóm vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp trong việc sản xuất
protease và đặc biệt là một nhóm chính có tính kinh tế cao được sử dụng để sản xuất
protease kiềm tính thương mại. Môi trường sống của Bacillus sp. rất rộng rãi, nhiều
nhất là trong đất và nước. Các vi khuẩn Bacillus sp. sản xuất ra protease kiềm tính đặc
biệt còn sống trong môi trường acid. Nghiên cứu về Bacillus sp. cho thấy, khi Bacillus
sống chung với môi trường với Aperillus oryzae ở môi trường trung tính. Bacillus sp.
có khả năng thay đổi pH môi trường sang kiềm tính có lợi và chiếm ưu thế hơn
(Horikoshi, 2011). Bacillus sp. là những sinh vật hiếu khí, thường có dạng hình que,
gram dương, có khả năng tạo thành bào tử khi điều kiện sống trở nên bất lợi vì thế nó
tồn tại dưới nhiều điều kiện về nhiệt độ và pH khắc nghiệt.
Bảng 1. Một số các protease kiềm tính được sản xuất theo qui mô công
nghiệp bởi Bacillus sp.
Loài
pH tối ưu
Ứng dụng trong công nghiệp
Bacillus stearothermophilus
9.5
Công nghiệp chất tẩy, bột giặc
Bacillus sp. Y. (BYA)
10.0 – 12.5

B18’ (Fujiwara et al., 1991).
- Nhiệt độ tối ưu.
Nhiệt độ tối ưu của các protease kiềm tính dao động khá rộng, từ 40 – 80
o
C như
các enzyme được sinh tổng hợp từ một số loài như Bacillus brevis có nhiệt độ tối ưu là
60
o
C (Banerjee et al., 1999) hay Bacillus horikoshii với nhiệt độ ở 45
o
C (Joo et al.,
2002). Protease kiềm tính có nhiệt độ tối rất cao, đương cử là enzyme được sản xuất từ
Bacillus P-2, hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 90
o
C (Kaur et al., 2001). Bênh cạnh đó, một
số dòng khác lại có nhiệt độ tối ưu hoạt động ở khoảng thấp hơn, từ 30 – 37
o
C.
Bacillus firmus cho hoạt tính cao nhất ở 37
o
C (Moon S. H., 1991) và dòng Bacillus sp.
B21-2 cho sinh lượng protease tối ưu khi nhiệt độ môi trường ở 30
o
C (Fujiwara at el.,
1987).
- Sự hiếu khí
Trong quá trình lên men, khi ta nói đến tỉ lệ hiếu khí nghĩa là mức độ hòa tan
của oxy trong môi trường dinh dưỡng. Đa số các dòng Bacillus sp. sản sinh protease
kiềm tính là vi khuẩn hiếu khí nên trong quá trình phát triển oxy sẽ được sử dụng, sau
một thời gian, lượng oxy trong môi trường sẽ cạn kiệt nếu không được cung cấp oxy,

Phương pháp xác định
Nguồn tham khảo
Bacillus sp. No. AH-101
30
SDS-PAGE
Takami et al., 1989
Bacillus Pumilus MK 6-5
28
SDS-PAGE
Kumar, 2002
Bacillus stearothermophilus F1
33.5
SDS
Rahman et al., 1994
Bacillus licheniformis MIR 29
40
SDS-PAGE
Ferrero et al., 1996
Bacillus pseudofirmus AL-89
24
SDS-PAGE
Gessesse et al., 2003
Bacillus sp. B18’
30
28
SDS PAGE
Gel filtration
Fujiwara et al., 1993
(*Nguồn: Anwar et al., 1998)
- Điểm đẳng điện.

Huang et al., 2003
Bacillus subtilis no. 16
3.9
Kato et al., 1992
Bacillus sphaericus
8.6
Singh et al., 2001
(*Nguồn: Hande Genckal, 2004)
2.3. Ứng dụng của protease kiềm tính
2.3.1. Công nghiệp thực phẩm
Protease kiềm tính thủy phân protein của thực vật và động vật tạo ra các sản
phẩm có vai trò quan trọng trong việc điều hòa huyết áp, trong thành phần thức ăn của
trẻ em, trong thực phẩm dinh dưỡng và trong công nghiệp nước giải khát. Vào những
năm gần đây, các enzyme cũng được sử dụng để thủy phân nhiều protein như những
protein trong đậu, gelatin, casein nhằm nâng cao chất dinh dưỡng trong thực phẩm.
2.3.2. Công nghiệp thuộc da
Đối với công nghiệp thuộc da, xử lý bằng protease có thể xóa được các màu
không mong muốn, tăng diện tích sử dụng được của da nên tăng năng xuất sản xuất
(Gupta et al., 2002). Phương pháp sử lý da bằng protease có nhiều ưu thế hơn so với
phương pháp sử lí lý hóa khác vì khả năng điều khiển thời gian xử lí dễ hơn và giảm
lượng chất thải. Protease kiềm tính được úng dụng trong cả ba giai đoạn của công
nghiệp thuộc da là quá trình ngâm, cạo bỏ lông và ngâm mềm da.
2.3.3. Công nghiệp dược
Protease cũng có vai trò quan trọng trong công nghiệp thuốc. Dòng vi khuẩn
Bacillus subtilis 316M sinh ra elastoesterase giúp chữa các vết bỏng, vết thương có
mủ, các mụn nhọt (Gupta et al., 2002; Kudrya và Simonenko 1994). Bên cạnh đó các
protease kiềm tính từ Bacillus dòng CK11-4 có tác dụng làm tan các vết máu tụ
(Gupta, 2002).

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Hiện đã có rất nhiều nghiên cứu ở nước ta về enzyme và protease nói riêng ở
nước ta nhưng số lượng nghiên cứu về protease kiềm tính vẫn còn hạn chế. Đa số các

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
nghiên cứu quan tâm về các protease có nguồn gốc từ động và thực vật như bromelain,
papain, trypsin, pepsin. Tuy nhiên, đã có một số nghiên cứu về ứng dụng của protease
kiềm tính trong việc xử lý môi trường bằng nấm mốc như Asperillus Oryzae trong đề
tài nghiên cứu thu nhận protease kiềm tính và ứng dụng trong xử lý phế liệu da giầy
(Đặng Thị Đăng Phương, 2005). Bên cạnh đó, đề tài “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm
enzyme protease từ ruột cá basa” (Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mẫn, 2006) nghiên
cứu về quy trình thu nhận protease từ ruột cá và trong điều kiện chiết enzyme với độ
pH = 9.5.
2.5.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Trên thế giới, trước năm 1971 có rất ít các nghiên cứu về protease kiềm tính.
Nhưng kể từ khi dòng Bacillus 221 được phân lâp và có khả năng sản xuất serine
protease kiềm tính (Hirokoshi, 1971) thì rất nhiều các nghiên cứu khác đã tìm hiểu và
ứng dụng những chủng khác vào sản xuất.
Chủng Bacillus Mycoides cũng được Mohamed và các cộng sự (1997) tìm hiểu
và có khả năng sản xuất protease kiềm tính. Các điều kiện phát triển tối ưu của chủng
này là pH 9.0, dextrin 3%, (NH
4
)
2
SO
4
0,1%, peptone (0-1%) và KH
2

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh Học, Đại học Cần Thơ.
3.1.3. Hóa chất
Glucose, KH
2
PO
4
, polypeptone, MgSO
4
, Na
2
CO
3
, Tris-HCl, EDTA, Comassive
Brilliant Blue G250, yeast extract, casein.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Quy trình chung về nuôi cấy và thu nhận protease kiềm tính từ vi khuẩn
Bacillus sp. SV1.
Vi khuẩn được chủng 1ml với mật độ 10
9
CFU/ml vào 30ml môi trường
Horikoshi-I (Horikoshi, 1971) trong bình tam giác 100ml được ủ lắc ở 32
o
C, tốc độ
120 vòng/phút. Phần dịch nuôi cấy được ly tâm ở 4
o
C, 13000 vòng/phút trong 10 phút.
Phần dịch nổi bên trên được lấy để xác định hoạt tính protease.
Chỉ tiêu khảo sát: hoạt tính protease của dịch nuôi cấy được xác định bằng
phương pháp Kunitz (1947).


(*Nguồn: Horikoshi, 2011)
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ đến khả năng sinh protease
kiềm tính của Bacillus sp. SV1.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí với 2 nhân tố là nguồn nitơ và nồng
độ.
Nhân tố C: nguồn Nitơ
C
1
: casein C
3
: yeast
C
2
: pepton
Nhân tố D: nồng độ của nguồn nitơ (w/v).
D
1
: 0,5% D
2
: 1,0%
D
3
: 1,5% D
4
: 2,0%
Thí nghiệm 3 lần lặp lại với 12 nghiệm thức. Tổng đơn vị thí nghiệm là 36.
Bảng 5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ và
nồng độ.
Nhân tố C
Nhân tố D

2
D
1
C
2
D
2
C
2
D
3
C
2
D
4
C
3
C
3
D
1
C
3
D
2
C
3
D
3
C

4
: 2,0%
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với với 12 nghiệm thức. Tổng đơn vị thí nghiệm
là 36.
Bảng 6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon và
nồng độ.
Nhân tố A
Nhân tố B
B
1
B
2
B
3
B
4
A
1

A
1
B
1
A
1
B
2
A
1
B

3
B
2
A
3
B
3
A
3
B
4
Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính protease (U/ml)
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng tương tác giữa nhiệt độ và pH lên khả năng sinh
protease kiềm tính của Bacillus sp. SV1.
3.2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh protease
kiềm tính của Bacillus sp. SV1
- Chủng Bacillus sp. SV1 được nuôi cấy theo môi trường dinh dưỡng nhận từ
thí nghiệm 3.2.2 và 3.2.3.
- Thí nghiệm được khảo sát với một nhân tố là thời gian theo các khoảng 24h,
48h, 72h và 96h

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành công nghệ sinh học 14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Thí nghiệm có 3 lần lặp lại với tổng đơn vị thí nghiệm là 12.
Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính protease (U/ml)
3.2.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh protease kiềm
tính của Bacillus sp. SV1.
- Vi khuẩn Bacillus sp. được nuôi trong môi trường có nguồn carbon và nitơ
nhận được từ thí nghiệm 3.2.2, 3.2.3.

pH
1
0
0
2
0
1
3
0
-1
4
-1
0
5
-1
-1
6
-1
1
7
1
0
8
1
-1
9
1
1
Trong đó 0 được xem là nghiệm thức tối ưu của mỗi nhân tố, -1 và 1 là hai
điểm biên trong kết quả thí nghiệm 3.2.4 (b) và 3.2.4 (c). Thời gian thu mẫu nhận được