Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
1
PHẦN I: CƠ SỞ LÝ THUYẾT
CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO
1. ðặc ñiểm tế bào ñộng vật
1.1 Sự ñiều hòa trao ñổi chất
Quá trình trao đổi chất của cơ thể được tập trung chủ yếu ở trong từng tế bào. Sự
chuyển hóa vật chất chủ yếu xảy ra trong tế bào và có tính quyết định đến sự tồn tại của cơ
thể sống.
Ở tế bào động vật, ngoài tác động của hoạt động enzyme, hệ dịch quanh tế bào, chúng
còn bị tác động rất mạnh bởi hệ thần kinh. Hệ thần kinh thu nhận những phản xạ phong phú
từ bên ngoài và bên trong tế bào, điều khiển một cách hài hòa toàn bộ quá trình trao đổi chất
ở tế bào. Sự rối loạn quá trình trao đổi chất ở tế bào có liên quan rất chặt chẽ đến sự điều
khiển của hệ thần kinh. Do đó, việc trao đổi chất của tế bào động vật ở cơ thể sống là hết sức
phức tạp.
Khi nuôi cấy tế bào in vitro, các quá trình trao đổi chất của tế bào hoàn toàn tuân theo
các đặc điểm của một tế bào độc lập, giống như quá trình trao đổi chất ở tế bào vi sinh vật.
Khi đó, tế bào động vật trở thành một thực thể độc lập không tuân theo các qui luật của mô
và qui luật của cơ thể đa bào.
Việc nuôi cấy tế bào động vật được thực hiện trên cơ sở điều khiển quá trình tổng hợp
enzyme và điều khiển các hoạt động của enzyme. Sự hoạt động của enzyme cũng như quá
trình tổng hợp enzyme sẽ quyết định khả năng phát triển của tế bào, khả năng tạo ra những
sản phẩm trao đổi chất của tế bào cũng như khả năng phân chia tế bào.
Hai vấn đề mang tính chất quyết định trong việc điều khiển quá trình tổng hợp và hoạt
động của tế bào:
Bản chất tự nhiên – nguồn gốc – của tế bào giúp định hướng sản phẩm cuối.
Yếu tố môi trường quyết định tính trạng riêng biệt của tế bào giúp tính trạng
đó được biểu hiện ra trong quá trình nuôi cấy.
Mọi tác động của môi trường đến tế bào nuôi cấy in vitro đều là những tác động trực
tiếp, xảy ra rất nhanh và rất mãnh liệt; do đó khi tiến hành kỹ thuật nuôi cấy in vitro cần tạo
ra sự hài hòa trong mọi tác động đến sự trao đổi chất của tế bào được nuôi cấy.

Tế bào máu là loại tế bào hoàn toàn tự do, tồn tại trong hệ tuần hoàn. Nhờ trạng thái
tự do này mà tế bào máu có chức năng rất riêng biệt.
Tế bào sinh dục thuộc loại tế bào bán tự do. Có nghĩa chỉ tồn tại tự do ở trạng thái
sinh lý nhất định.
Các tế bào còn lại tồn tại trong mô, chúng chỉ có thể tăng số lượng và phát triển trên
một giá đỡ nào đó.
1.5 Chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao ñổi chất của tế bào
Các nhà khoa học gọi cơ chế này là cơ chế kìm hãm ngược bởi sản phẩm cuối (feed
back). Thực ra, bất kỳ tế bào sinh vật nào đều cũng biểu hiện cơ chế này. Điểm khác biệt của
tế bào động vật là ở chỗ quá trình tổng hợp thừa ít xảy ra và hiện tượng các sản phẩm trao đổi
chất từ trong tế bào thoát ra khỏi tế bào thường rất chậm.

1.6 Khả năng tiếp nhận gen lạ
Xét về cấu trúc tế bào, tế bào động vật được xem như một loại tế bào trần tự nhiên.
Chúng được bao bọc chỉ bởi một lớp màng, do đó, trong trường hợp chúng tồn tại ở trạng thái
tự do, khả năng nhận dòng thông tin di truyền lạ (thông tin di truyền từ virus…) hoặc khi cho
những tế bào động vật có thông tin di truyền khác nhau (nhân khác nhau) ở gần nhau, sẽ xảy
ra hiện tượng trao đổi vật chất di truyền. Hiện tượng này tạo ra các tế bào lai (hybridoma).
Hiện tượng lai này có ý nghĩa rất lớn trong việc tạo ra dòng lai mới.

1.7 Khả năng bảo quản trong ñiều kiện nhân tạo
Tế bào động vật cần phải được bảo quản trong những điều kiện hết sức đặc biệt mới
có thể giữ được những đặc tính riêng của nó.
Người ta thường sử dụng nitrogen lỏng hoặc bơm những chất phụ gia vào các dòng tế
bào động vật và bảo quản chúng ở nhiệt độ - 70
o
C. Bằng biện pháp này, tế bào động vật vẫn
duy trì được đặc tính của chúng trong thời gian rất dài. Khi sử dụng, tế bào động vật được
Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
3


2.3 Hai phương thức tái tạo và biệt hóa của tế bào mầm.
Sự tái tạo trực tiếp xảy ra bằng cách phân chia bất đối xứng: một tế bào gốc ra hai tế
bào con, trong hai tế bào con đó sẽ có một tế bào gốc và một tế bào tiền biệt hóa, và
chỉ có tế bào tiền biệt hóa mới tiếp tục phân chia hoặc biệt hóa tiếp theo.
Cơ chế điều hòa mức độ cao:
o Tế bào mầm tạo ra hai tế bào con đều có khả năng tiền biệt hóa như nhau.
Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
4
o Các tế bào tiền biệt hóa đều có khả năng biệt khóa theo các con đường khác
nhau và ở nhiều giai đoạn khác nhau. 3. Sinh học của tế bào ñộng vật trong quá trình nuôi cấy.
3.1 Môi trường nuôi cấy
Trạng thái của tế bào động vật trong quá trình nuôi cấy tương tự như một kiểu chức
năng sinh lý thường xuyên tồn tại trong cơ thể động vật. Trong quá trình nuôi cấy, khi có sự
biến đổi điều kiện môi trường thì đặc tính của tế bào sẽ thay đổi theo. Những tế bào không
tăng sinh bình thường in vivo (trong cơ thể) có thể tăng sinh trong in vitro; hơn nữa trong
điều kiện in vivo, những tương tác giữa tế bào với tế bào và giữa tế bào với chất gian bào
giảm xuống vì chúng đồng dạng với nhau và không có được một cấu trúc 3 chiều, đồng thời,
hormone và các chất dinh dưỡng cung cấp dễ bị biến đổi. Lý do này khiến các nhà khoa học
tập trung nghiên cứu xây dựng một môi trường phù hợp cho sự tăng trưởng, chuyển động đến
vị trí cơ chất, tăng sinh của những tế bào không chuyên biệt hơn là môi trường cần thiết cho
sự biểu hiện các chứ năng khác nhau của tế bào. Việc sử dụng môi trường thích hơp, cung
cấp dưỡng chất, hormone và cơ chất là những vấn đề cơ bản cho sự biểu hiện những chức
năng chuyên biệt của tế bào. Trước khi duy trì những điều kiện chuyên biệt như vậy, cần phải
kiểm tra trong những trường hợp có thể xảy ra khi tiến hành nuôi cấy sơ khởi cũng như nuôi
cấy dòng tế bào sau đó.



Nhạy cảm với trepsin
Sự hạn chế dưỡng chất, hormone, cơ
chất.

ðược nhân lên
như một dòng

Tốc độ tăng trưởng tương đối của
các tế bào khác nhau.

Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
5
tế bào
Ảnh hưởng của mật độ tế bào lên sự
vượt trội của các kiểu hình bình
thường hay kiểu hình biến đổi.
Sự hạn chế dưỡng chất, hormone và
cơ chất.
Lão suy, biến
ñổi gen

Các tế bào thường chết.
Các tế bào biến đổi tăng trưởng
mạnh. Trong giai đoạn nuôi cấy sơ khởi (primary culture) (giai đoạn từ khi tế bào được tách
ra khỏi mô và được nuôi cấy in vitro), sự chọn lọc dựa vào đặc tính của tế bào như tế bào có
thể được tách ra khỏi mẫu cấy ban đầu một cách dễ dàng. Đối với những tế bào phân tán, chỉ

Những tế bào này thường có nguồn gốc từ trung mô, xuất phát từ những mô liên kết với
Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
6
nguyên bào sợi và các yếu tố mạch. Hiện tượng được biết đến là sự tăng trưởng mạnh của
nguyên bào sợi và trở thành những dòng tế bào hữu dụng ví dụ như W138 – nguyên bào sợi
của phôi phổi người, BHK21 – nguyên bào sợi của thận chuột đồng con và có lẽ nổi bật hơn
hết là tế bào L – nguyên bào sợi dưới dạng da được xử lý với methylcholanthrene. Đó là một
trong những thách thức chủ yếu của lĩnh vực nuôi cấy mô từ khi lĩnh vực này mới được khởi
đầu: làm cách nào để ngăn cản sự tăng trưởng quá mức của những tế bào yếu hoặc sự tăng
trưởng quá chậm của những tế bào như tế bào nhu mô gan hoặc những tế bào biểu bì hóa
sừng. Nguyên nhân là do điều kiện môi trường không phù hợp và vấn đề đáng chú ý hiện nay
là xây dựng được môi trường và chọn lọc được cơ chất thích hợp để có thể duy trì được nhiều
dòng tế bào chuyên biệt.

3.4 Sự phát triển của những dòng tế bào liên tục
Hầu hết các dòng tế bào đều có thể sinh sản theo một kiểu không đổi trong một số thế
hệ giới hạn, ngoài ra chúng có thể chết hoặc chuyển thành dòng tế bào liên tục (continuous
cell line). Đó là một số dòng tế bào có khả năng thích ưng với môi trường nuôi cấy, giữa
được khả năng phân chia tốt và có thể cấy chuyền vĩnh viễn. Khả năng dòng tế bào tăng
trưởng liên tục có lẽ phản ánh sự thay đổi kiểu di truyền cho phép sự chọn lọc xảy ra sau đó.
Nguyên bào sợi của người có tính ưu thế, có số lượng bội thể không bị thay đổi trong suốt
thời gian sống của chúng và không tạo thành dòng tế bào liên tục, trong khi đó các nguyên
bào sợi của chuột và các tế bào được tách ra từ các khối u của người và động vật thường bị
thay đồi số lượng bội thể trong quá trình nuôi cấy và trở thành dòng tế bào liên tục với tần số
cao. Những biến đổi trong quá trình nuôi cấy làm tăng sự biến đổi dòng tế bào thành dòng tế
bào liên tục được gọi là “sự biến đổi in vitro” và có thể tự xảy ra hoặc do sự cảm ứng của hóa
chất và virus.
Các dòng tế bào liên tục thường có số lượng bội thể thay đổi và số bội thể ở giữa mức
nhị bội và tứ bội. Cũng chưa rõ ràng hoặc những tế bào có khả năng trở thành các dòng tế bào
liên tục hiện diện sẵn trong mô nuôi cấy với số lượng rất nhỏ hoặc sau đó những tế bào này

lợi
Kiểu gen và kiểu hình điển hình gần
với loại in vivo.
Thường có số bội thể ổn định.
Tăng trưởng nhanh.
Thời gian sống không bị hạn chế.
Dễ nhân dòng.
Có thể nhân lên trong dịch huyền phù.
Tế bào chắc.
Đòi hỏi môi trường đơn giản.
Đòi hỏi lượng huyết thanh thấp.
Bất lợi
Thời gian sống bị hạn chế
Tăng trưởng chậm.
Hiệu quả bám trên cơ chất thấp.
Kiểu gen không ổn định.
Biến đổi.
Thường là có số bội thể không bình thường.3.5 Sự phản phân hóa
Sự phản phân hóa bao hàm ý nghĩa là những tế bào đã phân hóa bị mất đi tính chuyên
biệt in vitro, nhưng cũng chưa rõ là:
• Có thể những tế bào chưa phân hóa (trong cùng một dòng với những tế bào đã phân
hóa) tăng trưởng mạnh.
• Hoặc do sự vắng mặt của các chất cảm ứng thích hợp (hormone, sự tương tác qua lại
của tế bào hoặc chất gian bào) gây ra sự mất khả năng thích nghi.
Trong thực tế, cả hai nguyên nhân cùng có thể xảy ra. Sự tăng sinh liên tục có thể do
các tế bào chưa phân hóa không gặp được sự cảm ứng phù hợp của điều kiện môi trường để
phân hóa.

2
.
Tủ lạnh và tủ đông.
Tủ sất đối lưu.
Bể điều nhiệt.
Kính hiển vi thường.
Kính hiển vi soi ngược.
Ống hút tự động, ống hút Pateur.
Máy khuấy từ.
Máy đo mật độ quang.
Bơm chân không.
Máy ly tâm thường, máy ly tâm lạnh.
Nồi hấp vô trùng môi trường nuôi cấy.
pH kế.
Cân phân tích
Máy cất nước hai lần
Tủ cấy vô trùng

4.1.1.2 Dụng cụ
Hộp plastic nuôi cấy loại giếng
Bình nuôi cấy
Đĩa petri plastic
Hộp plastic nuôi cấy hình chữ nhật
Bình nuôi cấy bằng thủy tinh
Ống nghiệm có nắp đậy
Ống làm lạnh + hộp đựng.
Dụng cụ thủy tinh để pha môi trường.
Màng lọc đã khử trùng.

4.1.2 Môi trường nuôi cấy

2
O 42
NaHCO
3
2200 L – isoleucine 52
Na
2
HPO
4
.H
2
O 140 l – leucine 52
Vitamin
L – lysine.HCl 73,1
D – panthothenate
calcium
1 L – methionine 15
Choline chloride 1 L – phenylalanine 33
Acid folic 1 L – threonine 48
I – inositol 2 L – tryptophan 10
Nicotiamide 1 L – tyrosine 36
Pyridoxal.HCl 1 L – valine 47
Riboflavine 0,1
Các thành phần khác
Thiamine.HCl 1 D – glucose 1000
Đỏ phenol 10

Bảng 3: Môi trường Waymouth’s MB17,50 752/1
Thành phần Nồng ñộ (mg/l)
Thành phần Nồng ñộ (mg/l)

.7H
2
O 566 L – histidine 123
Vitamin
L – isoleucine 25
L – ascorbic acid 17,5 L – leucine 50
Biotin 0,02 L – lysine.HCl 240
D – panthothenate calcium 1 L – methionine 50
Choline chloride 250 L – phenylalanine 50
Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
10
Acid folic 0,4 L – proline 50
I – Inositol 1 L – threonine 75
Nicotiamide 1 L – tryptophan 40
Riboflavine 1 L – tyrosine 40
Thiamine.HCl 10 L – valine 65
Vitamin B12 0,2
Các thành phần khác
Pyroxine.HCl 1 D – Glucose 5000
Đỏ phenol 10
Glutathione 15 Hypoxanthine 25 4.1.2.1 Các yếu tố vật lý tác ñộng ñến môi trường.
a. pH: hầu hết các dòng tế bào tăng trưởng tốt nhất ở pH 7,4. Độ pH tối thích đối với
mỗi dòng tế bào sẽ khác nhau. Một số dòng tế bào như nguyên bào sợi tăng trưởng tốt nhất ở
pH 7,4 – 7,7 và những dòng tế bào biến đổi sẽ tăng trưởng tốt nhất ở pH 7,2 – 7,4 (Eagle,
1973). Theo Eisinger và cộng sự (1979), tế bào biểu bì có thể sống ở pH 5,5. Sự thay đổi pH
môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến sức sống và khả năng tăng sinh của tế bào.
Đánh giá pH môi trường thông qua đỏ phenol thường mang tính chủ quan, do đó cần

Ethyl – Piperazine – Ethane – Sulfonic Acid) có tác dụng đệm mạnh hơn ở pH 7,2 –
7,6 và nó thường được sử dụng vớ nồng độ 10 hoặc 20mM. Khi HEPES được sử dụng
với CO
2
ngoại sinh thì nồng độ của HEPES phải tăng lên gấp 2 lần so với đệm
thông thường. c. Áp suất thẩm thấu
Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
11
Hầu hết các tế bào nuôi cấy đều có thể chịu được biên độ áp suất thẩm thấu tương đối
rộng. Áp suất thẩm thấu thích hợp cho sự tăng trưởng của tế bào những loài động vật khác
nhau sẽ khác nhau. Trong trường hợp nuôi cấy tế bào trong môi trường nhược trương thì nên
nuôi trong đĩa petri để cho có sự thoát bớt hơi nước trong quá trình nuôi.
Việc đo áp suất thẩm thấu rất cần thiết trong quá trình pha môi trường để tránh không
xảy ra sai sót trong lúc cân hóa chất và pha loãng.

d. Nhiệt ñộ
Ngoại trừ những ảnh hưởng trực tiếp lên sự tăng trưởng của tế bào, nhiệt độ còn ảnh
hưởng đến pH của môi trường: nhiệt độ thấp sẽ làm tăng sự hòa tan CO
2
vào môi trường, do
sự thay đổi khả năng ion hóa và pK
2
của dung dịch đệm.

e. ðộ nhớt của môi trường
Độ nhớt của môi trường chủ yếu bị ảnh hưởng bởi thành phần của huyết thanh, và
trong hầu hết các trường hợp, sự thay đổi độ nhớt môi trường sẽ ảnh hưởng trên sự tăng

♥ Mục đích sử dụng: tách các tế bào từ mô hoặc trải các tế bào thành lớp đơn.
Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền
12
♥ Sử dụng trong các huyền phù tế bào có các tế bào chỉ có thể tăng trưởng khi bám vào
cơ chất.
Hiện nay, HEPES là dung dịch có hiệu quả nhất ở pH 7,2 – 7,8 và TRICINE có hiệu
quả ở pH 7,4 – 7,8.

b. Các môi trường xác ñịnh
Được xây dựng bằng cách thay đổi các thành phần trong môi trường tối thiểu của
Eagle (MEM) (1959) - trong đó có chứa các amino acid cần thiết, vitamin và muối – thành
những môi trường phức tạp như môi trường 199, CMRL 1066, RPMI 1640 và F12. Những
môi trường phức tạp có chứa một lượng lớn các amino acid và các vitamin khác nhau và
thường được bổ sung với các chất biến dưỡng như các nucleoside và khoáng
Amino acid: các amino acid cần thiết là các amino acid không được không được tổng hợp
trong cơ thể nên cần bổ sung từ môi trường nuôi cấy. Nhu cầu về cysteine và tyrosine thay
đổi khác nhau tùy theo dòng tế bào. Nồng độ của amino acid thường hạn chế mật độ tối đa
của các tế bào và sự cân bằng amino acid sẽ ảnh hưởng đến sức sống và tốc độ tăng trưởng
của tế bào. Glutamine cần thiết cho hầu hết các dòng tế bào và chỉ một dòng tế bào có thể sử
dụng được glutamate. Hiện nay, một số nghiên cứu cho thấy rằng glutamate được sử dụng
trong môi trường nuôi cấy tế bào như nguồn cung cấp năng lượng và carbon.

Vitamin: khi tăng thành phần môi trường lên (mục đích để giảm hàm lượng huyết thanh
xuống) thì danh sách các vitamin trong môi trường cũng phải tăng theo. Khi mật độ tế bào
trong môi trường nuôi cấy thấp (trong giai đoạn nhân dòng tế bào) thì cần phải tăng lượng
vitamin cho dù trong môi trường đã có sự hiện diện của huyết thanh. Sự hạn chết về vitamin
có ảnh hưởng rõ rệt trên sức sống và tốc độ tăng trưởng của tế bào hơn là trên mật độ tế bào.

Muối: các loại muối chủ yếu là là thành phần chính tạo ra áp suất của môi trường. Trong
huyền phù tế bào, lượng thường được giảm xuống để hạn chế sự kết cụm của tế bào. Nồng

thanh người được sử dụng trong nuôi cấy một số dòng tế bào người.
Mặc dù hầu hết các dòng tế bào đều cần có huyết thanh trong môi trường nuôi cấy,
nhưng hiện nay người ta thấy cũng có những dòng tế bào có thể được duy trì và tăng sinh
trong môi trường không có huyết thanh. Các chủng tế bào liên tục (continuous cell) như L929
và tế bào Hela là những chủng đầu tiên được nuôi cấy và tăng trưởng trong môi trường không
có huyết thanh. Tuy nhiên, ở phòng thí nghiệm Ham và một số phòng thí nghiệm khác
(Carney) đã chứng minh rằng có thể giảm lượng huyết thanh hoặc bỏ hẳn mà không ảnh
hưởng đến tế bào nếu như các chất khoáng và hormone bổ sung vào môi trường thích hợp với
dòng tế bào được nghiên cứu.
Protein: mặc dù protein là thành phần chính trong huyết thanh nhưng vai trò của một
số loại protein vẫn còn chưa được chứng minh rõ ràng: một số loại protein có lẽ có vai trò
chuyên chở các chất khoáng, acid béo, hormone hoặc bản thân chúng cũng là hormone. Các
loại protein hữu dụng là albumin và globulin. Fibronectin (globulin không tan) điều khiển sự
kết hợp α 2-macroglobulin hạn chế hoạt động của trypsin. Fetuin trong huyết thanh bò làm
tăng tính bám của tế bào và transferrin liên kết với sắt làm giảm độc tính của sắt để phù hợp
với nhu cầu của tế bào. Có thể có những loại protein khác chưa biết được đặc tính cũng cần
thiết cho khả năng bám và tăng trưởng của tế bào.

Polypeptide: những huyết thanh có dạng đóng cục tự nhiên sẽ kích thích sự tăng sinh
của tế bào nhiều hơn là những huyết thanh ở dạng khác. Điều này xảy ra là do có sự phóng
thích ra một loại polypeptide từ tiểu cầu trong quá trình trong quá trình đóng cục của huyết
thannh. Polypeptide này được gọi là yếu tố tăng trưởng của tiểu cầu. Đây là một nhóm các
polypeptide gây ra hoạt động phân chia tế bào và có lẽ là yếu tố tăng trưởng chính trong
huyết thanh. Những yếu tố khác như yếu tố tăng trưởng trong nguyên bào sợi (fibroplast
growth factor FGF), yếu tố tăng trưởng biểu bì tế bào (epidermal growth factor EGF), yếu tố
tăng trưởng nội bì và hoạt động kích thích sự nhân dòng (Multiplication-Stimulating Activity
MSA) được cô lập từ mô hoặc tế bào phóng thích ra môi trường trong quá trình nuôi cấy với
các mức độ chuyên biệt khác nhau và có lẽ chúng có mặt với một lượng nhỏ trong huyết
thanh.


4.1.2.3 Ảnh hưởng cuả oxygen, carbon dioxide dạng khí và nhiệt ñộ trong quá trình
nuôi cấy.
a. Oxygen
Tùy theo mục đích sử dụng mà nhu cầu O
2
của mẫu cấy thay đổi: đó là sự khác nhau
giữa cơ quan và môi trường nuôi cấy. Trong khi O
2
không khí hoặc một lượng O
2
thấp hơn
nồng độ O
2
không khí phù hợp hơn với hầu hết các tế bào nuôi cấy thì có vài loại cơ quan, ví
dụ như phôi của các giai đoạn sau (phôi mới hình thành hoặc phôi trưởng thành) lại cần đến
95% O
2
ở dạng khí. Hầu hết các tế bào tách rời nhau cần lượng O
2
thấp hơn và sẽ tăng trưởng
tốt hơn khi lượng O
2
thấp hơn O
2
không khí. Sự có mặt selenium làm giảm bớt lượng O
2
hòa
tan trong môi trường. Vai trò của O
2
hòa tan ngày càng giữ vai trò quan trong và phải cung