Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
---------------

LƢU THỊ NHƢ

PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA
SÂM LÀO (PANAX SP.) VÀ SÂM NGỌC LINH
(PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) VỚI
MỘT SỐ LOÀI KHÁC TRONG CHI PANAX

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành:Thực vật học

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
TS. NGUYỄN THỊ PHƢƠNG TRANG
TS. HÀ MINH TÂM

Hà Nội, 2013

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2


Để đảm bảo tính trung thực, khách quan của khóa luận, tôi xin cam
đoan:
Khóa luận “Phân tích mối quan hệ di truyền của Sâm lào (Panax sp.) và
Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) với một số loài Sâm khác
trong chi Panax ” là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được thực hiện dưới
sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Phương Trang và TS. Hà Minh Tâm. Các
kết quả trình bày trong khóa luận là trung thực, khách quan và chưa được
công bố trong bất kỳ công trình nào trước đây.
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2013.
Sinh viên
Lưu Thị Như

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ABI

Applied Biosystems ABI 3100 DNA Sequencer (máy đọc trình
tự)

ADN

Acid Deoxyribonucleic


dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphtate (các nucleotide tự do)

Genbank

Ngân hàng gen quốc tế

ISSR

Internal sinple sequence repeat (vùng giữa các đoạn trình tự lặp
lại đơn giản)

ITS

Internal Transcribed Spacer

Kb

Kilobase

MEGA

Phần mềm phân tích di truyền tiến hóa phân tử

NCBI

Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc tế


Bảng 1

Danh sách các trình tự sử dụng trong nghiên cứu

18

Bảng 2

Khoảng cách di truyền của Sâm lào so sánh với 1 số

25

loài khác trong chi Panax

DANH LỤC HÌNH
Trang
Hình 1

Nhâm sâm việt nam – Panax vietnamensis

4

Hình 2

Sâm ngọc linh (thu tại Trà My, tỉnh Quảng Nam)

6

Hình 3


Hình 8

So sánh trình tự vùng ITS-rADN của Sâm lào và

22

Sâm ngọc linh với một số loài khác trong chi Panax
Hình 9

Mối quan hệ di truyền của loài Sâm lào (Panax sp.)

27

và Panax vietnamensis với một số loài khác trong
chi Panax trên cơ sở phân tích trình tự vùng ITSrDNA bằng phương pháp Maximum Parsimony

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC

Lưu Thị Như

K35C - Sinh

Sâm ngọc linh của Việt Nam, chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu “Phân tích
mối quan hệ di truyền của Sâm lào (Panax sp.) và Sâm ngọc linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) với một số loài Sâm khác trong chi Panax”

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

8

Khóa luận tốt nghiệp

Điểm mới của đề tài
đề tài của tôi nghiên cứu hoàn toàn mới chưa được công bố trong công
trình khoa học nào, đề tài được đăng trong hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa
học các trường sư phạm toàn quốc lần thứ VI.
Mục đích của đề tài
Đánh giá sự khác biệt về mặt di truyền của cây sâm có nguồn gốc từ
Lào và Sâm ngọc linh của Việt Nam dựa trên phân tích trình tự gen ITS, từ đó
đánh giá mối quan hệ di truyền của chúng với một số loài sâm khác trên thế
giới.
Nội dung nghiên cứu
- Tách ADN tổng số của mẫu Sâm, nhân bản vùng gen ITS- rDNA
- Giải trình tự gen ITS – rDNA
- Phân tích số liệu: so sánh, phân tích các trình tự DNA của các mẫu
thu được và so với Panax vietnamsis ở Quảng Nam, và các loài
trong chi Panax.

này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt
Nam). Ở đây đang có tới 7 loài và thứ (dưới loài) mọc hoàn toàn tự nhiên. Hai
loài trồng là P. notoginseng nhập từ Bắc Mỹ và P. pseudoginseng (không tìm
thấy trong hoang dại nhưng giả thiết có nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc
là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi nào đó). Đây có thể coi là trung
tâm phân bố của chi Sâm (Panax L.) của thế giới. Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (P.
notoginseng; P. quinquefolius và P. trifoliatus). Giới hạn cuối cùng về phía
Nam của chi Panax L. là loài Sâm ngọc linh (Panax Vietnamensis) ở miền
trung của Việt Nam, tại 14015’ vĩ độ Bắc. Chính vì vậy Sâm ngọc linh được coi
là loài đặc hữu hẹp của miền trung Việt Nam [6].
Các loài Nhâm sâm nói chung có tính hàn, ưa khí hậu ôn hoà, mát mẻ,
sợ rét, sợ ánh nắng mặt trời mạnh chiếu trực tiếp, không ưa mưa nhiều và
nhiệt độ cao, sợ gió nóng. Nhiệt độ thích hợp để sinh trưởng là 20 - 280C.
Candolle, 1830, Seemann 1868 mô tả Panax có cụm hoa tán, hoa nhỏ có năm
cánh, bộ nhụy có 2 hoặc 3 lá noãn, quả mọng khi chín màu đỏ hoặc cam, có 2

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

10

Khóa luận tốt nghiệp

- 5 hạt. Cây sống nhiều năm nhờ thân rễ, thân rễ nạc có chiều dài tuỳ theo số
năm sinh trưởng [20]. Khái niệm này được chấp nhận bởi các công trình
nghiên cứu sau này (Wen và Zimmer, 1999; Choi và Wen, 2000) [34, 39].

Sâm ngọc linh mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt
độ ban ngày từ 20 - 25oC, ban đêm 15 - 18oC, Sâm ngọc linh có thể sống rất
lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm.
Công dụng:
Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể
dùng lá và rễ con.
Sinh học:
Vào đầu tháng 1 hàng năm, Sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông,
thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành. Từ tháng 4 đến tháng 6,
cây nở hoa và kết quả. Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9.
Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng để lại 1 vết sẹo ở đầu củ
sâm và bắt đầu giai đoạn ngủ đông đến tháng 12. Chính căn cứ vào vết sẹo
trên đầu củ mỗi mùa đông đến mà người ta có thể nhận biết cây sâm bao
nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi tức trên củ có 1 sẹo (sau 3 năm đầu sâm chỉ
rụng 1 lá) mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 tuổi [18, 20]. Mùa đông
cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm.

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

12

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 2: Sâm ngọc linh (Chụp tại vƣờn Sâm Đăc-Tô, Nam Trà My,
tỉnh Quảng Nam)

(Panax ginseng); Giả Nhâm sâm (P. pseudoginseng); Tây Dương Sâm (P.
quiquefolius); Tam thất (P. notogiseng) và Sâm ngọc linh (P. vietnamensis Ha et
Grushv.). Ở Việt Nam, ngay từ những năm kháng chiến chống Pháp (1952 1953) nhiều cán bộ cách mạng hoạt động nằm vùng ở Quảng Nam đã được
đồng bào chỉ cho cây thuốc này được coi như một thứ thần dược để phòng thân
những khi đau yếu, dùng để chữa cho người đau ốm nặng, người bị rắn cắn và
các bệnh thông thường như đau bụng, cầm máu vết thương [20, 24].
Theo quan điểm hóa phân loại và dược lý học, những công trình nghiên
cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chia 12 loài thuộc chi Panax thuộc
2 nhóm chính:
- Nhóm 1 gồm các loài hiện đã được phát triển trồng trọt gồm: Nhâm sâm
(Panax ginseng), Sâm mỹ (P. quinquefolius) và Tam thất (P. notoginseng), có
bộ phận dưới mặt đất là một rễ củ dạng cà rốt phát triển và chứa các Saponin
có khung thuộc nhóm dammaran.
- Nhóm 2 gồm các loài mọc hoang như P. japonicas, P. zingiberensis, P.
stipuleanatus với bộ phận thân rễ dưới đất phát triển theo hướng nằm ngang,
chứa Saponin có khung cấu tạo thuộc nhóm olean [17].
Tuy nhiên, hàm lượng Saponin của Sâm ngọc linh so với các loài
Panax trồng trọt thuộc nhóm 1 lại cao hơn rất nhiều.
Từ năm 1985 đến năm 2000, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả,
đặc biệt với các nhà khoa học Ba Lan, Nhật Bản đã cho thấy Sâm ngọc linh

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

14


Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

15

Khóa luận tốt nghiệp

chưa tìm thấy ocotillol trong Nhâm sâm triều tiên. Năm 1994, Nguyễn Minh
Đức còn chứng minh Nhâm sâm việt nam có hàm lượng saponin damarane
cao nhất (12 - 15%) so với Nhâm sâm khác chỉ chứa 10% và số lượng saponin
nhiều nhất (49%) so với 26% trong nhâm sâm triều tiên [10].
Ngoài những saponin nói trên, trong Nhâm sâm việt nam còn chứa các
polyacetylen, axit béo, axit amin, gluxit, tinh dầu và một số yếu tố vi lượng [15].
1.2.4 Hiện trạng của loài Sâm ngọc linh ở Việt Nam
Ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có khoảng 5 loài,
trong đó có 2 loài nhập trồng là Tam thất (P.notogineng) và Nhâm sâm
(P.ginseng) [1]. Ba loài mọc tự nhiên và đang là đối tượng bảo tồn là Sâm Vũ
Diệp (P.bipinnatifidus Seem.), Tam thất hoang (P.stipuleanatus Tsai et Feng)
và đặc biệt Sâm ngọc linh (P.vietnamensis Ha et Grushv.) là loài đặc hữu hẹp
của miền Trung Việt Nam, có phân bố tự nhiên ở các huyện Tu Mơ Rông,
huyện Đăk Glei (tỉnh Kom Tum), Huyện Nam Trà My, huyện Phước Sơn
(tỉnh Quảng Nam), trên vùng núi Ngọc Linh độ cao trên 1500m. Tuy nhiên
hiện tại loài này đã trở nên cực hiếm ngoài tự nhiên, do tình trạng khai thác
kiệt quệ trong nhiều năm cộng với việc đốt nương làm rẫy nên diện tích rừng
tự nhiên bị thu hẹp. Hiện tại Sâm ngọc linh đã được đưa vào danh lục đỏ của
IUCN (2003) và danh sách các loài hạn chế khai thác và sử dụng vì mục đích

1.4.1 Thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử
Ngoài nước: trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang
được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hóa, phân loại và đa
dạng di truyền quần thể sinh vật. Phương pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân
tích ADN. Các chỉ thị AFLP (đa hình độ dài các đoạn ADN khuếch đại),
RFLP (đa hình các đoạn cắt giới hạn), RAPD (đa hình các ADN Khuếch đại
ngẫu nhiên), SSR (trình tự các đoạn lặp đơn giản), cpSSR (trình tự lặp đơn
giản), gen mã hóa 18S - RNA,… hay được sử dụng để đánh giá đa dạng di
truyền, nhận dạng các đoạn ADN hoặc các trình tự đặc trưng cho loài [23,
19]. Với số lượng bản sao lớn trong hệ gen là điều kiện thuận lợi cho kỹ thuật
PCR với các cặp mồi thích hợp.
Vì thế chỉ trong vài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (GenBank, 2007) đã lưu
dữ trên 70 triệu trình tự ADN với gần 90 tỷ nucleotit. Đây là nguồn dữ liệu có
giá trị trong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn lý do chính là (1)
số liệu về trình tự các nucleotit rất có giá trị trong việc xác định các đơn vị
bảo tồn giúp cho đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậc loài và dưới loài; (2)

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

17

Khóa luận tốt nghiệp

số liệu trình tự nucleotit đảm bảo độ chính xác cao nên tạo cơ sở khoa học tốt
nhất cho bảo tồn đa dạng di truyền, trong nghiên cứu di truyền quần thể


Trường ĐHSP Hà Nội 2

18

Khóa luận tốt nghiệp

di truyền thực vật, trên các đối tượng cây trồng (cây lạc, lúa, một số loài hoa
lan…) [13, 14, 23] cây rừng (họ Dầu, Vạn tuế, Bách xanh, Giổi…) [8, 22]...
nhưng các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc đánh giá đa dạng di truyền
quần thể phục vụ cho nghiên cứu bảo tồn, tiến hóa và tái tạo nguồn gen.
Việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng
di truyền, phân loại và nhận dạng mẫu sinh vật ở Việt Nam cũng đã đạt được
nhiều kết quả có giá trị. Nhóm nghiên cứu của Nông Văn Hải đã thực hiện
trên gen ty thể (18S rRNA) để nghiên cứu phả hệ và giám định ADN một số
loài lan Hài, đã phát hiện ra mức độ tiến hóa của chúng [14]. Hay nhóm tác
giả của đặng Tất Thế (2003-2006) cũng sử dụng các nhóm gen này để phân
tích sự tiến hóa phân tử và phát sinh chủng loại của một số loài thú, bó sát
quý hiếm của Việt Nam [27]. Nguyễn Thúy Hạnh (2006) [13]. Hay nhóm tác
giả của Nguyễn Minh Tâm đã dùng các chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng
nguồn gen cây vạn tuế của Việt Nam làm cơ sở cho công tác di truyền [22].
Tuy nhiên, nghiên cứu các ứng dụng phương pháp phân tích ADN góp
phần vào việc phân loại mẫu thực vật đang còn ít.
1.4.2. Các bước trong phương pháp phân loại hiện đại
1.4.2.1. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Retion) được Karry Mullis và cộng
sự mô tả lần đầu tiên năm 1985 đã góp phần tạo nên một cuộc cách mạng
trong sinh học phân tử. Đây là phương pháp invitro để nhân bản nhanh một
đoạn ADN nào đó mà chỉ cần lượng mẫu ban đầu rất hạn chế (cỡ 10 -3μg). Kỹ
thuật này có độ nhạy rất cao và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh

đơn có kích thước khoảng 20 nucleotit.
1.4.2.3. Phân tích mối quan hệ di truyền
Mỗi quan hệ di truyền của các loài được thể hiện bằng cây phát sinh
chủng loại, đây là sơ đồ mô tả mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, được xây
dựng dựa trên sự giống và khác nhau các đặc điểm vật chất di truyền hay cơ
thể. Trong các nghiên cứu phân tử là sự giống và khác nhau về cấu trúc ADN
giữa các loài. Các taxon được nối với nhau trên cây thể hiện mối quan hệ di
truyền. Trên cây có rễ mỗi nút bên trong cây đại diện cho một loài tổ tiên
chung. Giả định nút gần nhất với rễ là loài khởi điểm, các nút còn lại được tỏa
ra từ nút này được gọi là con cháu. Mỗi một nút được gọi là đơn vị phân loại,
các nút trong cây được gọi là các đơn vị phân loại giả thiết. Độ dài của cành
cây mô phỏng thời gian tiến hóa. Cây không rễ là cây không có điểm khởi

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

20

Khóa luận tốt nghiệp

đầu, do đó nó không tái dựng lịch sử tiến hóa của các loài. Cây không rễ chỉ
cho biết mối quan hệ họ hàng giữa các loài hiện tại. Có 4 phương pháp tạo
cây bao gồm: (1) phương pháp Neighbor - Joining (NJ), (2) phương pháp
Minimum Evolution, (3) phương pháp Maximum Parsimony . Khoảng cách di
truyền giữa các loài cũng được ước lượng thông qua độ dài của cành cây [37,
38].


22

Khóa luận tốt nghiệp

2.2 Nơi thực hiện nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Hệ thống học phân tử và Di
truyền bảo tồn, viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam
2.3 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 6/2011- 5/2013
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1 Tách ADN tổng số
Mẫu lá (củ) củ tươi được nghiền trong nitơ lỏng (-196oC) thành dạng bột
mịn. Khoảng 100mg bột nghiền được dùng để tách ADN, sử dụng Dneasy
plant mini kit (Qiagen, Đức).
Phương pháp chiết tách ADN gồm ba bước chính:
 Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân bằng các tác nhân vật lý hay hoá học
hoặc kết hợp nhiều tác nhân, giải phóng ADN ra môi trường.
 Bước 2: Loại bỏ thành phần không mong muốn trong mẫu (protein, lipid,
polysaccharide…). Thường dùng hỗn hợp phenol – chloroform - isoamyl
alcohol (25:24:1) làm biến tính protein, sau đó ly tâm: protein biến tính sẽ tủa
thành một lớp nằm giữa pha nước chứa axit nucleic và pha phenol chloroform, thu nhận lại pha nước chứa axit nucleic.
 Bước 3: Kết tủa axit nucleic. Thường dùng cồn ethanol thể tích 2.5:1 và trong
môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao) hoặc dùng isopropanol thể tích
1:1. Thu ADN bằng li tâm, sau đó hoà trong nước khử ion hoặc dung dịch
đệm.
2.4.2 Phát hiện ADN bằng phương pháp điện di trên gel agarose
Phương pháp này được áp dụng cả trong phân tích định tính lẫn trong
việc thu nhận mẫu axit nucleic.

Nhân bản vùng gen ITS - rADN bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc
hiệu (thiết kế trên cơ sở trình tự ITS - rADN của các loài trong chi Panax trên
Genbank).
- Mồi xuôi PaITS-F: 5’- CAC TGA ACC TTA TAC TTT TGAG - 3’.
- Mồi ngược: PaITS-R: 5’- CTT ATT GAT ATG CTT AAA CTC AG - 3’.
Chu trình phản ứng PCR được chạy trong tổng thể tích 50µl gồm 32µl
H2O, 5 µl đệm, 5 µl dNTP, 3 µl mồi xuôi F (30 pM), 3 µl mồi ngược R (30
pM), 1 µl ADN tổng số, 1 µl enzyme Tag polymerase.
Chương trình chạy PCR được tiến hành theo chu kỳ nhiệt: 3 phút ở
950C, 30 chu kỳ (50 giây 95 0C, 1 phút 55 0C, 1 phút 72 0C) và sau đó là 1 chu
kỳ ở 72 0C trong 5 phút.

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

24

Khóa luận tốt nghiệp

Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agrarose 1% và tinh sạch
bằng Qiaquick gel extranction kit (Qiagen,Đức).
2.4.4. Đọc trình tự
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được sử dụng làm khuôn cho phản
ứng giải trình tự trực tiếp với mồi PaITS - F, sử dụng Bigdye terminator
cycler và đọc kết quả trên hệ thống ABI 3100 Avant Genetic Analyzer
(Applied Biosystems.Mỹ).

Panax notoginseng

JX680329

5

Panax pseudoginseng var bipinnatifidus

AY271923

6

Panax stipuleanatus

U41690

7

Panax variabilis

AY233329

8

Aralia foliolosa

DQ007383

Lưu Thị Như



ADN tổng số từ Lá Sâm ngọc linh

Giếng 2

ADN tổng số từ Củ Sâm ngọc linh

Giếng 3

ADN tổng số từ Lá Sâm lào

Giếng 4

ADN tổng số từ củ Sâm lào

Ảnh điện di cho thấy đều có ADN xuất hiện ở tất cả các mẫu, tuy nhiên
ở các giếng số 1 (mẫu lá Sâm ngọc linh), 2 (củ Sâm ngọc linh), 3 (lá Sâm lào)
thì có vạch sang rõ nét hơn, giếng số 4 (mẫu củ Sâm lào) vạch mờ, chứng tỏ
ADN tách từ củ Sâm lào có chất lượng không tốt bằng 3 mẫu còn lại.

Lưu Thị Như

K35C - Sinh